<tt id="g2m2k"></tt><rt id="g2m2k"></rt>
<rt id="g2m2k"><optgroup id="g2m2k"></optgroup></rt>
<rt id="g2m2k"></rt><rt id="g2m2k"></rt><rt id="g2m2k"><small id="g2m2k"></small></rt>
<rt id="g2m2k"></rt>
<rt id="g2m2k"></rt>

向PBMC遞送生物分子以改變免疫應答的制作方法

文檔序號:29064533發布日期:2022-03-01 07:32

本申請要求以下的權益:于2019年2月28日提交的美國臨時申請號62/812,225、于2019年3月11日提交的歐洲專利申請號19161964.2、于2019年4月30日提交的美國臨時申請號62/841,089、于2019年8月14日提交的美國臨時申請號62/886,799、于2019年11月8日提交的美國臨時申請號62/933,304以及于2019年12月16日提交的美國臨時申請號62/948,732,將每一篇所述文獻的全部內容通過引用并入本文。

ASCII文本文件序列表的提交

將以下提交的ASCII文本文件的內容通過引用以其整體并入本文:序列表的計算機可讀形式(CRF)(文件名稱:750322002241SEQLIST.TXT,記錄日期:2020年2月24日,大?。?5KB)。

技術領域

本公開文本總體上涉及包含抗原和/或佐劑的外周血單核細胞(PBMC)、制造此類PBMC細胞的方法、以及使用此類PBMC諸如用于調節個體的免疫應答的方法。

背景技術

免疫療法可分為兩種主要干預類型:被動干預或主動干預。被動方案包括施用預激活和/或工程化的細胞、疾病特異性治療性抗體和/或細胞因子。主動免疫療法策略涉及體內刺激免疫系統效應子功能。當前的若干種主動方案包括用疾病相關肽、裂解物或同種異體全細胞進行疫苗接種策略;輸注作為腫瘤抗原遞送的媒介物的自體DC;以及輸注免疫檢查點調節劑。參見Papaioannou,Nikos E.等人Annals of translational medicine 4.14(2016)。

通過疾病相關抗原刺激的CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)和CD4+輔助T(Th)細胞具有靶向和破壞患病細胞的潛力;然而,目前用于誘導內源性T細胞應答的方法面臨挑戰。

本文引用的所有參考文獻(包括專利申請和出版物)均通過引用以其整體并入。



技術實現要素:

本發明提供了包含用于刺激個體的免疫應答的抗原的外周血單核細胞(PBMC)。在一些實施方案中,使用Cell平臺在細胞內遞送抗原。本發明人意外地發現,PBMC的混合群體比純B細胞和T細胞群體具有更大的功效。此外,本發明至少部分基于以下意外發現:用佐劑調理PBMC增加所述PBMC的抗原呈遞細胞的激活,從而在向個體施用所述PBMC時導致增加的免疫刺激。

在一些方面,本發明提供了包含抗原的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原對于所述經修飾的PBMC是外源的。在一些實施方案中,本發明提供了包含抗原的多種經修飾的PMBC,其中所述抗原對于所述經修飾的PBMC是外源的,其中所述抗原是癌癥抗原、感染性疾病抗原或病毒疾病相關抗原。在一些方面,本發明提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原對于所述經修飾的PBMC是外源的。在一些實施方案中,本發明提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PMBC,其中所述抗原對于所述經修飾的PBMC是外源的,其中所述抗原是癌癥抗原、感染性疾病抗原或病毒疾病相關抗原。在一些實施方案中,本發明提供了包含抗原和佐劑的經調理的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原對于所述經修飾的PBMC是外源的。

在一些方面,本發明提供了包含抗原的經調理的多種PBMC,其通過以下方式制備:將包含所述抗原的所述多種PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了包含抗原的經調理的多種PBMC,其通過以下方式制備:將所述多種PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述PBMC,然后將所述抗原引入所述PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種PBMC。

在一些方面,本發明提供了包含抗原的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述方法還包括:在與所述佐劑一起孵育以調理所述經修飾的PBMC之前,從所述細胞懸浮液中分離出包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了包含抗原和佐劑的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原和所述佐劑通過以形成多種擾動的輸入PBMC;以及b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原和所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原和所述佐劑進入所述擾動的輸入PBMC;從而產生包含所述抗原和佐劑的所述多種經修飾的PBMC。

在一些方面,本發明提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)將多種輸入PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述輸入PBMC,從而產生經調理的多種輸入PBMC;b)使包含所述經調理的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成經調理的多種擾動的輸入PBMC;以及c)將所述經調理的多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了包含抗原和佐劑的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含含有所述佐劑的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;以及b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和所述佐劑的所述多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了包含抗原和佐劑的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含含有所述抗原的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述佐劑通過以形成多種擾動的輸入PBMC;以及b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許所述佐劑進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和所述佐劑的所述多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,根據本文描述的包含抗原和/或佐劑的多種經修飾的PBMC,其中所述方法還包括:將包含所述抗原和/或佐劑的所述多種經修飾的PBMC與第二佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原和/或所述佐劑的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述方法還包括:在與所述佐劑一起孵育以調理所述經修飾的PBMC之前,從所述細胞懸浮液中分離出包含所述抗原和/或所述佐劑的所述多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述方法還包括以下步驟:將所述輸入PBMC和/或所述經修飾的PBMC與如下藥劑一起孵育,與在沒有所述進一步孵育步驟的情況下制備的相應經修飾的PBMC相比,所述藥劑增強所述經修飾的PBMC的活力和/或功能。

在一些方面,本發明提供了一種包含如本文描述的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在通過手術、療法或診斷治療人體或動物體的方法中使用。在一些實施方案中,本發明提供了一種包含如本文描述的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在治療癌癥、感染性疾病或病毒相關疾病中使用。

在一些方面,本發明提供了一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用作藥物,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在通過手術、療法或診斷治療人體或動物體的方法中使用,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用作藥物,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:a)將多種輸入PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述輸入PBMC,從而產生經調理的多種輸入PBMC;b)使包含所述經調理的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成經調理的多種擾動的輸入PBMC;以及c)將所述經調理的多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在治療人體或動物體的方法中使用,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:a)將多種輸入PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述輸入PBMC,從而產生經調理的多種輸入PBMC;b)使包含所述經調理的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成經調理的多種擾動的輸入PBMC;以及c)將所述經調理的多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在治療個體的癌癥、感染性疾病或病毒相關疾病的方法中使用,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在治療個體的癌癥、感染性疾病或病毒相關疾病中使用,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在治療個體的HPV相關疾病的方法中使用,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在治療個體的HPV相關疾病中使用,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

在一些方面,本發明提供了包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物在制造用于治療個體的癌癥、感染性疾病或病毒相關疾病的藥物中的用途,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物在制造用于治療HPV相關疾病的藥物中的用途,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

在一些方面,本發明提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述佐劑是CpG ODN,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述佐劑是CpG ODN,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在優選的實施方案中,所述佐劑是CPG 7909。

在一些方面,本發明提供了包含人乳頭瘤病毒(HPV)抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了包含HPV抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,從而產生包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了包含HPV抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了包含HPV抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,從而產生包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

在一些方面,本發明提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約34μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約34μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

在一些方面,本發明提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

在一些方面,本發明提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)向所述個體施用包含抗原的多種經修飾的PBMC,所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任一個的氨基酸序列;以及b)向所述個體施用佐劑。

在一些方面,本發明提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)向所述個體施用包含抗原的多種經修飾的PBMC,所述抗原包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列;以及b)向所述個體施用佐劑。在一些方面,本發明提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)向所述個體施用包含抗原的多種經修飾的PBMC,所述抗原包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列;以及b)向所述個體施用佐劑。在一些方面,本發明提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)向所述個體施用包含多種抗原的多種經修飾的PBMC,所述多種抗原包含SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:23的氨基酸序列;以及b)向所述個體施用佐劑。在一些方面,本發明提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)向所述個體施用包含多種抗原的多種經修飾的PBMC,所述多種抗原由SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:23的氨基酸序列組成;以及b)向所述個體施用佐劑。在一些實施方案中,所述多種抗原包含在非共價連接的肽的集合內。在一些實施方案中,所述多種抗原包含在非共價連接的肽的集合內,其中每種肽包含不超過一種抗原。在一些實施方案中,所述多種抗原包含在非共價連接的肽的集合內,其中SEQ ID NO:19的氨基酸序列和SEQ ID NO:23的氨基酸序列包含在單獨的肽內。

在一些方面,本發明提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)將包含抗原的多種PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述PBMC,從而產生包含所述抗原的經調理的多種PBMC;b)向所述個體施用包含所述抗原的所述經調理的多種PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)將多種PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述PBMC,從而產生包含抗原的經調理的多種PBMC;b)將抗原引入所述多種PBMC;以及c)向所述個體施用包含所述抗原的所述經調理的多種PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的經調理的多種經修飾的PBMC;以及d)向所述個體施用包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述方法還包括在與所述佐劑一起孵育之前,從所述細胞懸浮液中分離出包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原和佐劑通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原和所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原和所述佐劑進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和佐劑的多種經修飾的PBMC;以及c)向所述個體施用所述多種經修飾的PBMC。

在一些方面,本發明提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)將多種輸入PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述輸入PBMC,從而產生經調理的多種輸入PBMC;b)使包含所述經調理的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原通過以形成經調理的多種擾動的輸入PBMC;c)將所述經調理的多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC;以及d)向所述個體施用所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)使包含含有佐劑的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和所述佐劑的多種經修飾的PBMC;以及c)向所述個體施用所述多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)使包含含有抗原的輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使佐劑通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許所述佐劑進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和所述佐劑的多種經修飾的PBMC;以及c)向所述個體施用所述多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;c)向所述個體施用所述多種經修飾的PBMC;以及d)向所述個體施用佐劑。在一些實施方案中,本發明提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)使包含含有抗原的輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使佐劑通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許所述佐劑進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和所述佐劑的多種經修飾的PBMC;以及c)向所述個體施用所述多種經修飾的PBMC;以及d)向所述個體施用佐劑。

在一些方面,本發明提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:向所述個體施用與抗原締合的多種PBMC,其中所述多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:a)將多種輸入PBMC與抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原與所述輸入PBMC的細胞表面締合,從而產生與所述抗原締合的所述多種PBMC;以及b)向所述個體施用所述多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述方法還包括向所述個體施用佐劑。

在一些方面,本發明提供了一種用于產生包含抗原的經調理的多種PBMC的方法,其包括將包含所述抗原的多種PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了一種用于產生包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述方法還包括在與所述佐劑一起孵育之前,從所述細胞懸浮液中分離出包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了一種用于產生包含抗原的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;以及b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了一種用于產生包含抗原和佐劑的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原和所述佐劑通過以形成多種擾動的輸入PBMC;以及b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原和所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原和所述佐劑進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和佐劑的所述多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了一種產生包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:a)將多種輸入PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述輸入PBMC,從而產生經調理的多種輸入PBMC;b)使包含所述經調理的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成經調理的多種擾動的輸入PBMC;以及c)將所述經調理的多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了一種用于產生包含抗原和佐劑的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:a)使包含含有佐劑的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;以及b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和所述佐劑的所述多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,本發明提供了一種用于產生包含抗原和佐劑的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:a)使包含含有抗原的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使佐劑通過以形成多種擾動的輸入PBMC;以及b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許所述佐劑進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和所述佐劑的所述多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述方法還包括以下步驟:將所述輸入PBMC和/或所述經修飾的PBMC與如下藥劑一起孵育,與在沒有所述進一步孵育步驟的情況下制備的相應經修飾的PBMC相比,所述藥劑增強所述經修飾的PBMC的活力和/或功能。

附圖說明

圖1A是多種PBMC內的代表性細胞的示意圖,其顯示了SQZ介導的E6和/或E7 SLP的遞送;以及E6和E7表位分別在MHC-I上的后續加工和呈遞。代表性細胞可以是PBMC細胞類型(諸如T細胞、單核細胞、NK細胞和B細胞)中的任一種。

圖1B是在伴有或不伴有CpG佐劑的共同施用下向個體施用包含HPV抗原的PBMC的單一療法中處于遞增階段的群組的示意性代表圖。圓圈的量繪示了經修飾的PBMC的相對劑量,箭頭繪示了施用,雙螺旋表示CpG佐劑,并且“AVB”指示額外的疫苗加強。

圖1C是在向個體組合施用包含HPV抗原的PBMC和阿特珠單抗中處于遞增階段的群組的示意性代表圖。圓圈的量繪示了經修飾的PBMC的相對劑量,箭頭繪示了施用,并且“AVB”指示額外的疫苗加強。

圖2A示出了在孵育右旋糖酐(內吞作用)和在30、60和90psi的驅動壓力下SQZ介導的右旋糖酐遞送后,脾細胞中亞群的活力。圖2B示出了具有通過內吞作用或在30、60和90psi的驅動壓力下SQZ介導的遞送所遞送的右旋糖酐的細胞的百分比。

圖3示出了細胞調理和CpG的共同施用對由SQZ負載有OVA的B細胞或脾細胞引發的抗原特異性免疫應答的影響。

圖4示出了脾細胞調理和各種濃度的CpG的共同施用對由SQZ負載有OVA的精制脾細胞引發的抗原特異性免疫應答的影響。

圖5示出了脾細胞調理和CpG或IFNα的共同施用對由SQZ負載有OVA的精制脾細胞引發的抗原特異性免疫應答的影響。

圖6示出了當在進行一次施用(初免)或兩次施用(初免-加強)的情況下以不同的細胞劑量施用時,由SQZ負載有OVA的經調理的精制脾細胞引發的抗原特異性免疫應答。

圖7示出了當在進行一次施用(初免)或兩次施用(初免-加強)的情況下以不同的劑量施用時,由(a)SQZ負載有OVA的經調理的B細胞或(b)SQZ負載有OVA的經調理的精制脾細胞引發的抗原特異性免疫應答。

圖8示出了調理(CpG孵育)的持續時間對由SQZ負載有OVA的成熟脾細胞引發的抗原特異性免疫應答的影響。

圖9示出了SQZ負載有E7HPV抗原的成熟脾細胞在抑制E7表達TC1腫瘤方面的劑量依賴性作用。

圖10A示出了CpG孵育對人PBMC(頂部)和鼠脾細胞(底部)內B細胞亞群中的激活標記物的影響。

圖10B示出了當使人PBMC或鼠脾細胞與CpG一起孵育時細胞因子/趨化因子譜的變化。

圖11示出了當使人PBMC在60psi的驅動壓力和3.5μm或4μm的縮窄部寬度下經受SQZ介導的遞送時細胞組成和MHC-I水平的變化。

圖12A示出了在60psi的驅動壓力下和用3.5μm或4μm的縮窄部寬度經受SQZ介導的遞送的人PBMC內的CD3+ T細胞或CD14+單核細胞的活力和有效載荷遞送。

圖12B示出了在60psi的驅動壓力下和用3.5μm或4μm的縮窄部寬度經受SQZ介導的遞送的人PBMC內的CD20+ B細胞或CD56+ NK細胞的活力和有效載荷遞送。

圖13示出了當與使用3.5μm或4μm縮窄部寬度經由SQZ介導的過程負載有E7HPV抗原的成熟人PBMC共培養時,具有PBMC群體的亞組中的遞送(底部)與E7特異性應答細胞的刺激(頂部)的相關性。

圖14示出了當與在45psi或60psi的驅動壓力和3.5μm、4μm或4.5μm的縮窄部寬度下經由SQZ介導的過程負載有E7HPV抗原的成熟人PBMC共培養時,E7特異性應答細胞的刺激,所述過程在RT下(頂部)或在冰上(底部)進行。

圖15上圖示出了當與SQZ負載有pp65的人PBMC或SQZ負載有pp65并用佐劑成熟化的人PBMC共培養(在1μM CpG的存在或不存在下)時,pp65特異性應答細胞的刺激。

圖15下圖示出了(a)當在1μM CpG的存在下與SQZ負載有pp65的人PBMC或SQZ負載有pp65并用佐劑成熟化的人PBMC共培養時;或(b)當與SQZ負載有pp65的人T細胞或SQZ負載有pp65并用佐劑成熟化的人T細胞共培養時,pp65特異性應答細胞的刺激。

圖16示出了當將應答細胞與SQZ負載有pp65CMV抗原的成熟人PBMC共培養時,(a)通過各種佐劑進行的PBMC成熟化和(b)在SQZ負載中使用的pp65抗原濃度對pp65特異性應答細胞的刺激的影響。

圖17顯示了當與SQZ負載有pp65CMV抗原的成熟人PBMC共培養時,通過不同佐劑CpG、R837和R848以3或24小時的孵育時間進行的PBMC成熟化對pp65特異性應答細胞的刺激的影響。

圖18示出了在SQZ介導的負載之前與之后,脾細胞的調理對由SQZ負載有pp65CMV抗原的經調理的鼠脾細胞引發的抗原特異性應答的影響。

圖19示出了當向攜帶E7表達腫瘤的小鼠施用單獨的負載pp65的脾細胞(B組);單獨的化學療法(順鉑)(C、D、G組);或負載pp65的脾細胞與化學療法的組合(E、F、H組)時對腫瘤抑制的作用。

圖20A示出了在室溫下或在冰上SQZ介導的3kDa右旋糖酐向人PBMC亞群遞送的效率。圖20B示出了在50psi或70psi的驅動壓力下,SQZ介導的3kDa右旋糖酐向人PBMC的亞群遞送的效率。

圖21A和圖21B示出了當向攜帶E7表達腫瘤的小鼠施用SQZ負載有E7HPV抗原的精制鼠脾細胞時,脾細胞調理或CpG共同施用對腫瘤抑制(圖21A)和存活率改善(圖21B)的影響。

圖22示出了在伴有或不伴有與CpG或IFNα的共同施用的情況下,脾細胞調理對由SQZ負載有OVA抗原的精制鼠脾細胞引發的抗原特異性應答的影響。

圖23A至圖23H示出了在伴有或不伴有與CpG 1826一起孵育的情況下,脾細胞調理對進行SQZ處理或未經處理的精制鼠脾細胞內B細胞標記物CD86(圖23A-圖23D)和H-2Kb(圖23E-圖23H)表達的影響。

圖24A至圖24D示出了以下小鼠中循環細胞因子的水平:未經治療的小鼠(圖24A)、僅用1μg CpG 1826 IV注射的小鼠(圖24B)、用SQZ負載有E7 SLP的精制鼠脾細胞免疫的小鼠(圖24C)或用SQZ負載有E7 SLP的精制鼠脾細胞共同注射并用1μg CpG 1826 IV共同注射的小鼠(圖24D)。

圖25示出了SQZ負載有E7 SLP的精制鼠脾細胞(M-SQZ-脾-HPV)和未經處理的精制鼠脾細胞的循環動力學。

圖26A至圖26E示出了在用SQZ負載有E7 SLP的精制鼠脾細胞或未經處理的精制鼠脾細胞免疫后E7特異性T細胞浸潤的量,并且圖26F示出了隨時間變化的腫瘤體積。腫瘤環境中每個活細胞的CD8+ T細胞百分比以及每份腫瘤質量的CD8+ T細胞數量分別示出在圖26A和圖26D中。腫瘤環境中每個活細胞的E7特異性T細胞百分比和每份腫瘤質量的E7特異性T細胞數量分別示出在圖26C和圖26E中。腫瘤環境中每個CD8+ T細胞的E7特異性T細胞百分比示出在圖26B中。

圖27A至圖27D示出了在通過SQZ負載有OVA的精制鼠脾細胞或通過與OVA一起孵育的精制鼠脾細胞(孵育對照)進行刺激或無刺激(OT-I對照)的情況下,WT或MHC-I-/-小鼠中OVA特異性T細胞(OT-I CD8+ T細胞)的體內增殖的量。圖27A和圖27C示出了2個重復實驗的受體淋巴結中的對應OT-I增殖。圖27B和圖27D示出了2個重復實驗的受體脾臟中的對應OT-I增殖。

圖28A至圖28E示出了在與SQZ負載有OVA的精制鼠脾細胞(圖28A),或與SQZ負載有OVA的精制鼠脾細胞的所指示亞組(B細胞、T細胞、單核細胞、NK細胞的亞組,分別在圖28B、圖28C、圖28D、圖28E中)共培養后,OT-I CD8+ T細胞中激活標記物CD69的增殖和表達。

圖29A至圖29F中的頂部圖組示出了對于在RPMI中SQZ處理的人PBMC(圖29A、圖29C、圖29E)或SQZ負載有FAM標記的E6、E7或E6+E7SLP的人PBMC(分別為圖29B、圖29D、圖29F),每個樣品的來自Z堆疊中部的共焦成像,其展示了質膜的定位(CD45染色,PM,頂部圖組);FAM標記的HPV SLP的定位(SLP,從頂部起的第二圖組);以及示出其相對定位的疊加圖(疊加,從頂部起的第三圖組),而圖29中的底部圖組示出了沿著對應疊加圖組中所示的白線穿過細胞中心的線條軌跡。

圖30示出了在共同注射如下B細胞后,gp100特異性T細胞的增殖:保持未經處理(NC)、與gp100SLP一起孵育(孵育對照)、SQZ負載有gp100SLP(擠壓)或用gp100SLP脈沖處理(PP),如通過CFSE稀釋度(左圖)和隨后的定量(右圖)測量的。

圖31示出了在未經治療或預防性施用了SQZ負載有E7 SLP的精制脾細胞的小鼠中植入TC-1腫瘤的腫瘤體積變化。在第0天向未經治療的群組I植入TC-1腫瘤。在第60天向未經治療的群組II植入TC-1腫瘤。在第0天和第60天兩天向用SQZ負載的脾細胞治療的小鼠植入TC-1腫瘤。

圖32示出了在SQZ負載有E7 SLP的精制脾細胞的治療性治療之后植入TC-1腫瘤的腫瘤體積變化。用0.1x106或1.0x106個SQZ負載的脾細胞治療小鼠,所述脾細胞以單劑量的初免(在植入后第10天)或根據初免和加強方案(在植入后第10天初免,在第17天和第24天加強)施用。

圖33A和圖33B示出了當向攜帶E7表達腫瘤的小鼠施用SQZ負載有HPV E7抗原的精制鼠脾細胞時,脾細胞調理或CpG共同施用對腫瘤抑制(圖33A)和存活率改善(圖33B)的影響。

圖34示出了在將精制脾細胞在沒有負荷的情況下進行SQZ處理(僅SQZ)或在OVA的存在下進行SQZ處理(SQZ+OVA)后,在T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞的脾細胞亞群中由OVA加工的表位SIINFEKL(SEQ ID NO:54)的MHC-I呈遞的程度。

圖35示出了對于由SQZ負載有HPV16 E7抗原的精制鼠脾細胞引發的抗原特異性應答,脾細胞施用的劑量依賴性功效。

圖36A至圖36C示出了在用SQZ負載有E7 SLP的精制鼠脾細胞或用肽疫苗免疫后或保持未經處理后E7特異性T細胞浸潤的量并且圖36D示出了隨時間變化的腫瘤體積。腫瘤環境中每個活細胞的CD45+白細胞百分比、CD45+細胞中CD8+ T細胞的數量以及腫瘤環境中每個CD8+ T細胞的E7特異性T細胞百分比分別示出于圖36A、圖36B和圖36C中。

圖37A示出了在典型研究環境中SQZ處理的細胞的數量與在制造環境中SQZ處理的細胞的數量。圖37B示出了在與右旋糖酐一起孵育后,或在右旋糖酐的存在下進行SQZ處理后PBMC的活力。圖37C示出了對于PBMC以及B細胞(CD20+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)和單核細胞(CD14+)的組成細胞類型,在與右旋糖酐一起孵育或用右旋糖酐進行SQZ處理后,關于右旋糖酐呈陽性的細胞的百分比。

圖38A示出了在將PBMC保持未經處理(NC)、用空有效負載進行SQZ處理(空SQZ)或SQZ負載有CD86編碼mRNA(SQZ)后,B細胞(CD19+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)和單核細胞(CD14+)的PBMC亞群內CD86表達細胞的百分比。圖38B示出了在將PBMC用空有效負載進行SQZ處理(空SQZ)或SQZ負載有IFNα2編碼mRNA(SQZ)后,B細胞(CD19+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)和單核細胞(CD14+)的PBMC亞群內IFNα2表達細胞的百分比。

圖39A示出了在將PBMC用空有效負載進行SQZ處理(空SQZ)或SQZ負載有CD86編碼mRNA(SQZ)后,在72小時內T細胞(CD3+)的PBMC亞群內CD86表達的百分比。圖39B示出了在將PBMC用空有效負載進行SQZ處理(空SQZ)或SQZ負載有4-1BBL編碼mRNA(SQZ)后,在72小時內T細胞(CD3+)的PBMC亞群內4-1BBL表達細胞的百分比。

圖40示出了在將PBMC用未經修飾的eGFP mRNA或攜帶5-甲氧基尿苷骨架修飾(5moU)的eGFP mRNA以0μg/mL至200μg/mLmRNA濃度進行SQZ處理后,在T細胞(CD3+)的PBMC亞群內的eGFP表達的量。

圖41示出了在將PBMC保持未經處理(NC)或分別用編碼IL-12、IFNα或IL-2的mRNA進行SQZ處理(SQZ)后,PBMC分泌IL-12、IFNα或IL-2細胞因子的程度。

圖42A示出了在刺激效應免疫細胞應答中來自增強的抗原呈遞細胞的信號1、2、3的示意圖。圖42B示出了在將PBMC分別用編碼CD70或4-1BBL的mRNA進行SQZ處理后,在B細胞(CD19+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)和單核細胞(CD14+)的PBMC亞群內在48小時內信號2效應子表達的量。圖42C示出了在將PBMC分別用編碼IFNα2或IL-2的mRNA進行SQZ處理后,在24小時內PBMC的信號3效應子分泌的量。

圖43A示出了對于未刺激、在SQZ處理之前用ConA刺激、在SQZ處理之后用conA刺激的PBMC,PBMC中eGFP翻譯和表達的量,其中將PBMC在eGFP編碼mRNA的存在下進行SQZ處理。圖43B示出了當將PBMC在CD86編碼mRNA的存在下進行SQZ處理時,在未刺激或在SQZ處理之前用ConA刺激的PBMC中CD86表達的量。

圖44A示出了研究在SQZ負載后的精制小鼠脾細胞中是否翻譯信號2和信號3效應子mRNA的實驗的示意圖。圖44B示出了在將精制脾細胞分別在編碼CD70、CD80、CD86或OX40L的mRNA的存在下進行SQZ處理后,精制鼠脾細胞中CD70、CD80、CD86或OX40L表達的量。圖44C示出了在將精制脾細胞分別在編碼IL-12、IL-2或IFNα2的mRNA的存在下進行SQZ處理后,精制鼠脾細胞的IL-12、IL-2或IFNα2分泌的量。

圖45A示出了研究在精制鼠脾細胞中SQZ負載信號2和信號3效應子mRNA是否有利于增強刺激抗原特異性T細胞應答的能力的實驗的示意圖。圖45B示出了在與SQZ負載有OVA肽和編碼信號2效應子(CD70、CD80或CD86)的mRNA的精制鼠脾細胞共培養后,OVA特異性T細胞的激活程度。圖45C示出了在與SQZ負載有OVA肽和編碼信號3效應子IL-2的mRNA的精制鼠脾細胞共培養后,OVA特異性T細胞的激活程度。

圖46A示出了在與SQZ負載有編碼對應抗原(E7、HSV GD1、MART-1、pp65或流感M1)的mRNA的人PBMC共培養后,抗原特異性應答T細胞的激活量。圖46B和圖46C分別示出了在將PBMC在編碼E7或M1的mRNA的存在下進行SQZ處理后,PBMC中E7或M1的翻譯和表達量。

圖47A示出了關于負載的鼠脾細胞在刺激抗原特異性T細胞應答方面中的效力比較抗原的mRNA形式與蛋白質形式的SQZ負載的實驗的示意圖。圖47B示出了在與SQZ負載有OVA蛋白或OVA編碼mRNA的鼠脾細胞共培養后,激活的OVA特異性T細胞的量。

圖48A和圖48B分別示出了研究E7負載的精制脾細胞和抗CTLA4施用的組合是否將導致對E7攜帶腫瘤TC1的治療效果改善的實驗的實驗設計和示意圖。圖48C、圖48D、圖48E和圖48F示出了當在伴有或不伴有抗CTLA4抗體的進一步施用下向攜帶E7表達腫瘤的小鼠施用SQZ負載有HPV E7抗原的精制鼠脾細胞時,腫瘤抗原負載的脾細胞和免疫檢查點抑制劑的組合對腫瘤生長抑制(圖48C)、腫瘤發生的延遲或抑制(圖48D和48E)和存活率改善(圖48F)的累加治療效果。

具體實施方式

抗原呈遞細胞(APC)在誘導CTL的內源性激活方面起關鍵作用。在這項工作中,描述了實施Cell平臺以工程化外周血單核細胞(PBMC),用于在調節對多種適應癥(包括癌癥和感染性疾病)的免疫應答中使用。通過使得能夠高效地將靶抗原和/或佐劑經胞質溶膠遞送至PBMC,此平臺證明了體內誘導靶抗原的高度有效MHC-I呈遞和CTL的刺激的能力。本發明人意外地發現,PBMC的混合群體比單獨的純B細胞和T細胞群體具有更大的功效。此外,本發明人意外地發現,與未經調理的抗原負載的PBMC相比,用佐劑調理PBMC增加抗原呈遞細胞的激活,從而在向個體施用時導致更大的免疫刺激。

在一些方面,本申請提供了包含抗原和佐劑的經修飾的PBMC,并且其中所述抗原存在于細胞內。在一些實施方案中,在向個體施用之前,將包含所述抗原的所述PBMC在佐劑的存在下孵育一段時間(即,調理所述PBMC)。在一些實施方案中,在將所述抗原引入所述PBMC之前,將所述PBMC在佐劑的存在下孵育一段時間。

在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC通過以下方式制備:a)使輸入PBMC細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC細胞的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成擾動的輸入PBMC;以及b)將所述擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC;從而產生包含所述抗原的所述經修飾的PBMC。還提供了使用經修飾的PBMC調節個體的免疫應答,例如增強個體的免疫應答的方法。在一些實施方案中,所述增強的免疫應答是針對所述抗原的。在一些實施方案中,所述細胞變形縮窄部被包含在微流體通道(諸如本文描述的任何微流體通道)內。

通用技術

本領域技術人員通常充分理解并且一般使用常規方法利用本文描述或提及的技術和程序,所述常規方法如例如以下文獻中描述的廣泛使用的方法:Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook等人,第4版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,紐約,2012);Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人編輯,2003);叢書Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.);PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor編輯,1995);Antibodies,A Laboratory Manual(Harlow和Lane編輯,1988);Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique and Specialized Applications(R.I.Freshney,第6版,J.Wiley and Sons,2010);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編輯,1984);Methods in Molecular Biology,Humana Press;Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis編輯,Academic Press,1998);Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,Plenum Press,1998);Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell編輯,J.Wiley and Sons,1993-8);Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell編輯,1996);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos編輯,1987);PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人編輯,1994);Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人編輯,1991);Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人編輯,J.Wiley and Sons,2002);Immunobiology(C.A.Janeway等人,2004);Antibodies(P.Finch,1997);Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.編輯,IRL Press,1988-1989);Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean編輯,Oxford University Press,2000);Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999);The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra編輯,Harwood Academic Publishers,1995);以及Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等人編輯,J.B.Lippincott Company,2011)。

定義

出于解釋本說明書的目的,以下定義將適用,并且在適當時,以單數形式使用的術語也包括復數,并且反之亦然。如果下面列出的任何定義與通過引用并入本文的任何文件相沖突,則應以所列出的定義為準。

如本文所使用,除非另外指出,否則單數形式“一個/一種(a/an)”和“所述(the)”包括復數個指示物。

應理解,本文描述的本發明的方面和實施方案包括“包含方面和實施方案”、“由方面和實施方案組成”和/或“基本上由方面和實施方案組成”。

如本文所用的術語“約”是指本技術領域的技術人員容易知道的相應值的常用誤差范圍。本文提及“約”某一值或參數時包括(并描述)涉及該值或參數本身的實施方案。

如本文所用,“外周血單核細胞”或“PBMC”是指具有圓形核的血細胞的異質性群體。在PBMC群體中可以發現的細胞的例子包括淋巴細胞,諸如T細胞、B細胞、NK細胞(包括NKT細胞和CIK細胞);以及單核細胞,諸如巨噬細胞和樹突細胞。如本文所用的“多種PBMC”是指包含至少兩種血細胞類型的細胞的PBMC制劑。在一些實施方案中,多種PBMC包含以下中的兩種或更多種:T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞或樹突細胞。在一些實施方案中,多種PBMC包含以下中的三種或更多種:T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞或樹突細胞。在一些實施方案中,多種PBMC包含以下中的四種或更多種:T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞或樹突細胞。在一些實施方案中,多種PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞和樹突細胞。

可以通過本領域已知的方法分離PBMC。例如,PBMC可以基于與其他血細胞相比的PBMC密度而源自個體的外周血。在一些實施方案中,PBMC使用Ficoll(例如,ficoll梯度)而源自個體的外周血。在一些實施方案中,PBMC使用細胞分離系統而源自個體的外周血。

在一些實施方案中,從個體分離PBMC群體。在一些實施方案中,多種PBMC是自體PBMC群體,其中所述群體源自特定個體,將其通過本文描述的任何方法進行操縱,并且返回到所述特定個體。在一些實施方案中,多種PBMC是同種異體PBMC群體,其中所述群體源自一個個體,將其通過本文描述的任何方法進行操縱,并且施用至第二個體。

在一些實施方案中,多種PBMC是重構的PBMC制劑。在一些實施方案中,所述多種PBMC可以通過混合通常在PBMC群體中發現的細胞來產生;例如通過混合T細胞、B細胞、NK細胞或單核細胞中的兩種或更多種的群體來產生。在一些實施方案中,調節(例如,精制)脾細胞群體中的細胞的比率以更好地反映人PBMC的群體譜。例如,可以從脾細胞群體中耗盡B細胞,以更好地反映人PBMC的群體。

如本文所用的術語“孔”是指開口,包括但不限于材料內的洞、裂縫、空腔、孔口、斷裂、間隙或穿孔。在一些例子中,(在指示的情況下)所述術語是指本公開文本的表面內的孔。在其他例子中,(在指示的情況下)孔可以是指細胞膜中的孔。

如本文所用的術語“膜”是指含有孔的選擇性屏障或薄片。所述術語包括充當邊界或襯里的柔韌的片狀結構。在一些例子中,所述術語是指含有孔的表面或過濾器。此術語不同于術語“細胞膜”。

如本文所用的術語“過濾器”是指允許選擇性通過孔的多孔物品。在一些例子中,所述術語是指含有孔的表面或膜。

如本文所用的術語“不均勻的”是指在結構或組成上是混合的或不均一的事物。在一些例子中,所述術語是指在給定表面內具有變化的大小、形狀或分布的孔。

如本文所用的術語“均勻的”是指在整個結構或組成上一致或均一的事物。在一些例子中,所述術語是指在給定表面內具有一致大小、形狀或分布的孔。

術語“異源的”當其涉及核酸序列(諸如編碼序列和控制序列)時表示通常不連接在一起和/或通常不與特定細胞締合的序列。因此,核酸構建體或載體的“異源”區域是在另一個核酸分子內或與其附接的核酸區段,所述核酸區段在自然界中未發現與另一分子締合。例如,核酸構建體的異源區域可以包括如下編碼序列,其側接在自然界中未發現與所述編碼序列締合的序列。異源編碼序列的另一個例子是其中編碼序列本身在自然界中未被發現的構建體(例如,具有與天然基因不同的密碼子的合成序列)。類似地,出于本發明的目的,被細胞中通常不存在的構建體轉化的細胞將被認為是異源的。等位基因變異或天然存在的突變事件不產生如本文所用的異源DNA。

術語“異源的”當其涉及氨基酸序列(諸如肽序列和多肽序列)時表示通常不連接在一起和/或通常不與特定細胞締合的序列。因此,肽序列的“異源”區域是在另一個氨基酸分子內或與其附接的氨基酸區段,所述氨基酸區段在自然界中未發現與另一分子締合。例如,肽構建體的異源區域可以包括側接如下序列的肽的氨基酸序列,所側接的序列在自然界中未發現與所述肽的氨基酸序列締合。異源肽序列的另一個例子是如下構建體,其中肽序列自身在自然界中未被發現(例如,具有與天然基因所編碼不同的氨基酸的合成序列)。類似地,出于本發明的目的,用表達通常不存在于細胞中的氨基酸構建體的載體轉化的細胞將被認為是異源的。等位基因變異或天然存在的突變事件不產生如本文所用的異源肽。

術語“外源”在涉及與細胞相關的藥劑(諸如抗原或佐劑)時是指從細胞外部遞送(即,來自細胞外部)的藥劑。細胞可能具有或可能不具有已經存在的藥劑,并且在已遞送外源藥劑之后可能產生或可能不產生所述藥劑。

如本文所用,術語“抑制”可以是指阻斷、減少、消除或以其他方式拮抗特定靶標的存在或活性的行為。抑制可以是指部分抑制或完全抑制。例如,抑制免疫應答可以是指導致對免疫應答的阻斷、減少、消除或任何其他拮抗作用的任何行為。在其他例子中,對核酸表達的抑制可以包括但不限于核酸轉錄的降低、mRNA豐度的降低(例如,沉默mRNA轉錄)、mRNA的降解、mRNA翻譯的抑制等。

如本文所用,術語“阻抑”可以是指降低、減少、禁止、限制、減低或以其他方式削弱特定靶標的存在或活性的行為。阻抑可以是指部分阻抑或完全阻抑。例如,阻抑免疫應答可以是指導致降低、減少、禁止、限制、減低或以其他方式削弱免疫應答的任何行為。在其他例子中,對核酸表達的阻抑可包括但不限于核酸轉錄的降低、mRNA豐度的降低(例如,沉默mRNA轉錄)、mRNA的降解、mRNA翻譯的抑制等。

如本文所用,術語“增強”可以是指改進、加強、提高或以其他方式增加特定靶標的存在或活性的行為。例如,增強免疫應答可以是指導致改進、加強、提高或以其他方式增加免疫應答的任何行為。在一個示例性例子中,增強免疫應答可以是指使用抗原和/或佐劑來改進、加強、提高或以其他方式增加免疫應答。在其他例子中,增強核酸的表達可以包括但不限于核酸轉錄的增加、mRNA豐度的增加(例如,增加mRNA轉錄)、mRNA降解的減少、mRNA翻譯的增加等。

如本文所用,術語“調節”可以是指變化、改變、變動或以其他方式修改特定靶標的存在或活性的行為。例如,調節免疫應答可以是指導致變化、改變、變動或以其他方式修改免疫應答的任何行為。在其他例子中,調節核酸的表達可以包括但不限于核酸轉錄的變化、mRNA豐度的變化(例如,增加mRNA轉錄)、mRNA降解的相應變化、mRNA翻譯的變化等。

如本文所用,術語“誘導”可以是指引發、促進、刺激、建立或以其他方式產生結果的行為。例如,誘導免疫應答可以是指導致引發、促進、刺激、建立或以其他方式產生所希望的免疫應答的任何行為。在其他例子中,誘導核酸表達可以包括但不限于核酸轉錄的引發、mRNA翻譯的引發等。

如本文所用的術語“同源的”是指源自相同生物體的分子。在一些例子中,所述術語是指通常在給定生物體內發現或表達的核酸或蛋白質。

如本文所用的術語“多核苷酸”或“核酸”是指任何長度的核苷酸(核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此,此術語包括但不限于單鏈、雙鏈或多鏈DNA或RNA,基因組DNA,cDNA,DNA-RNA雜合體,或包含嘌呤和嘧啶堿基或其他天然的、化學或生物化學修飾的、非天然的或衍生的核苷酸堿基的聚合物。多核苷酸的骨架可以包含糖和磷酸基團(如通??稍赗NA或DNA中發現的)或者經修飾或取代的糖或磷酸基團??商娲?,多核苷酸的骨架可以包含合成亞基(諸如氨基磷酸酯和硫代磷酸酯)的聚合物,并且因此可以是寡脫氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。此外,雙鏈多核苷酸可以從化學合成的單鏈多核苷酸產物,通過合成互補鏈并在適當的條件下使所述鏈退火或者通過使用DNA聚合酶用適當的引物從頭合成互補鏈來獲得。

術語“多肽”和“蛋白質”可互換使用以指代氨基酸殘基的聚合物,并且不限于最小長度。氨基酸殘基的此類聚合物可以含有天然或非天然氨基酸殘基,并且包括但不限于肽、寡肽、氨基酸殘基的二聚體、三聚體和多聚體。所述定義涵蓋全長蛋白質及其片段兩者。所述術語還包括多肽的表達后修飾,例如糖基化、唾液酸化、乙?;?、磷酸化等。此外,出于本發明的目的,“多肽”是指如下蛋白質,其包括對天然序列的修飾(諸如缺失、添加和取代)(在本質上通常是保守的),只要所述蛋白質保持所希望的活性即可。這些修飾可能是故意的,如通過定點誘變,或者可能是偶然的,如通過產生蛋白質的宿主的突變或由于PCR擴增而引起的錯誤。

如本文所用,術語“佐劑”是指直接或間接調節和/或引起免疫應答的物質。通常,與單獨的抗原相比,將佐劑與抗原結合施用以實現針對抗原的免疫應答的增強。在一些實施方案中,使用佐劑來調理多種PBMC(例如,如實施例中所展示)。本文描述了各種佐劑。

術語“CpG寡聚脫氧核苷酸”和“CpG ODN”是指如下DNA分子,其含有被磷酸酯隔開的胞嘧啶和鳥嘌呤的二核苷酸(在本文中也稱為“CpG”二核苷酸或“CpG”)。本公開文本的CpG ODN含有至少一個未甲基化的CpG二核苷酸。也就是說,所述CpG二核苷酸中的胞嘧啶未被甲基化(即,不是5-甲基胞嘧啶)。CpG ODN可以具有部分或完全硫代磷酸酯(PS)骨架。

如本文所用,“藥學上可接受的”或“藥理學上相容的”意指不是生物學上或在其他方面不希望的材料,例如所述材料可以摻入施用至患者的藥物組合物中而不引起任何顯著的不希望的生物學作用或不與含有它的組合物的任何其他組分以有害方式相互作用。藥學上可接受的載體或賦形劑優選滿足毒理學和制造測試要求的標準和/或包括在美國食品和藥物管理局編寫的非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)中。

對于本文描述的任何結構和功能特征,確定這些特征的方法是本領域中已知的。

經修飾的PBMC、組合物和產生經修飾的PBMC的方法

經修飾的PBMC

在某些方面,提供了包含抗原的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原對于所述經修飾的PBMC是外源的。在其他方面,提供了包含抗原的多種經修飾的PMBC,其中所述抗原對于所述經修飾的PBMC是外源的,其中所述抗原是癌癥抗原、感染性疾病抗原或病毒疾病相關抗原。在一些方面,提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原對于所述經修飾的PBMC是外源的。在一些方面,提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PMBC,其中所述抗原對于所述經修飾的PBMC是外源的,其中所述抗原是癌癥抗原、感染性疾病抗原或病毒疾病相關抗原。在某些方面,存在包含抗原和佐劑的經調理的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原對于所述經修飾的PBMC是外源的。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述多種PBMC包含編碼抗原的核酸。在一些實施方案中,所述多種PBMC包含編碼抗原的mRNA。在一些實施方案中,所述一種或多種核酸被攜帶在一種或多種媒介物中,其中所述一種或多種媒介物被遞送至所述輸入PBMC。在一些實施方案中,所述媒介物是病毒或病毒相關顆粒。在一些實施方案中,所述病毒包含以下中的一種或多種:腺病毒、腺相關病毒(AAV)、桿狀病毒、皰疹病毒或逆轉錄病毒。在一些實施方案中,所述病毒包括AAV。在一些實施方案中,所述媒介物是基于脂質的媒介物,例如脂質體。在一些實施方案中,所述媒介物是納米顆粒。

在一些方面,提供了包含抗原的多種經修飾的PBMC,所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任一個的氨基酸序列。在其他方面,提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任一個的氨基酸序列。

在一些方面,提供了包含抗原的多種經修飾的PBMC,所述抗原包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在其他方面,提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,所述抗原包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些方面,提供了包含抗原的多種經修飾的PBMC,所述抗原包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在其他方面,提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,所述抗原包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。

在一些方面,提供了包含抗原的經調理的多種PBMC,其通過以下方式制備:將包含所述抗原的所述多種PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種PBMC。在其他方面,提供了包含抗原的經調理的多種PBMC,其通過以下方式制備:將所述多種PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述PBMC,然后將所述抗原引入所述PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種PBMC。

在一些方面,提供了包含編碼抗原的核酸(例如,mRNA)的經調理的多種PBMC,其通過以下方式制備:將包含所述抗原的所述多種PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種PBMC。在其他方面,提供了包含編碼抗原的核酸(例如,mRNA)的經調理的多種PBMC,其通過以下方式制備:將所述多種PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述PBMC,然后將所述抗原引入所述PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種PBMC。

可以使用縮窄部介導的遞送(SQZ)將抗原和/或佐劑引入PBMC中。因此,在一些方面,提供了包含抗原的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述方法還包括在與所述佐劑一起孵育以調理所述經修飾的PBMC之前,從所述細胞懸浮液中分離出包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述一種或多種核酸被攜帶在一種或多種媒介物中,其中所述一種或多種媒介物被遞送至所述輸入PBMC。在一些實施方案中,所述媒介物是病毒或病毒相關顆粒。在一些實施方案中,所述病毒包含以下中的一種或多種:腺病毒、腺相關病毒(AAV)、桿狀病毒、皰疹病毒或逆轉錄病毒。在一些實施方案中,所述病毒包括AAV。在一些實施方案中,所述媒介物是基于脂質的媒介物,例如脂質體。在一些實施方案中,所述媒介物是納米顆粒。

在一些方面,提供了包含抗原和佐劑的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原和所述佐劑通過以形成多種擾動的輸入PBMC;以及b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原和所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原和所述佐劑進入所述擾動的輸入PBMC;從而產生包含所述抗原和佐劑的所述多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)將多種輸入PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述輸入PBMC,從而產生經調理的多種輸入PBMC;b)使包含所述經調理的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成經調理的多種擾動的輸入PBMC;以及c)將所述經調理的多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在某些方面,提供了包含抗原和佐劑的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含含有所述佐劑的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;以及b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和所述佐劑的所述多種經修飾的PBMC。在其他方面,提供了包含抗原和佐劑的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含含有所述抗原的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述佐劑通過以形成多種擾動的輸入PBMC;以及b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許所述佐劑進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和所述佐劑的所述多種經修飾的PBMC。

在一些方面,提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了包含人乳頭瘤病毒(HPV)抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述HPV抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述HPV抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述HPV抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了包含HPV抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,從而產生包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述HPV抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述HPV抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述HPV抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了包含HPV抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述HPV抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述HPV抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述HPV抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了包含HPV抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,從而產生包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述HPV抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述HPV抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述HPV抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述佐劑是CpG 7909,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在根據本文描述的多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是(a)約4.2μm至約6μm;或(b)約4.5μm。在一些實施方案中,將所述HPV抗原與CpG ODN一起孵育(a)約2小時至約10小時;(b)約3小時至約6小時;或(c)約4小時。

在根據本文描述的多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是約3μm至約6μm。在一些實施方案中,將所述HPV抗原與CpG ODN一起孵育(a)約2小時至約10小時;(b)約3小時至約6小時;或(c)約4小時。

在根據本文描述的多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是(a)約4.2μm至約6μm;或(b)約4.5μm。在一些實施方案中,將包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育(a)約2小時至約10小時;(b)約3小時至約6小時;或(c)約4小時。

在根據本文描述的多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是約3μm至約6μm。在一些實施方案中,將包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育(a)約2小時至約10小時;(b)約3小時至約6小時;或(c)約4小時。

在一些方面,提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

在一些方面,提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在根據本文描述的多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是(a)約4.2μm至約6μm;或(b)約4.5μm。在一些實施方案中,將所述抗原與CpG ODN一起孵育(a)約2小時至約10小時;(b)約3小時至約6小時;或(c)約4小時。

在根據本文描述的多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是約3μm至約6μm。在一些實施方案中,將所述HPV抗原與CpG ODN一起孵育(a)約2小時至約10小時;(b)約3小時至約6小時;或(c)約4小時。

在根據本文描述的多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是(a)約4.2μm至約6μm;或(b)約4.5μm。在一些實施方案中,將包含所述抗原的所述經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育(a)約2小時至約10小時;(b)約3小時至約6小時;或(c)約4小時。

在根據本文描述的多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是約3μm至約6μm。在一些實施方案中,將包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育(a)約2小時至約10小時;(b)約3小時至約6小時;或(c)約4小時。

在根據本文描述的多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原的濃度在約0.1μM與約1mM之間和/或與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度在約0.1μM與約1mM之間。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原的濃度在約0.1μM與約10μM之間和/或與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度在約0.1μM與約10μM之間。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原的濃度是約1μM和/或與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度是約1μM。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原與所述佐劑的比率在約10000:1至約1:10000之間。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原與所述佐劑的比率是約200:1。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原與所述佐劑的比率是約20:1。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在根據本文描述的多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述方法還包括:將包含所述抗原和/或佐劑的所述多種經修飾的PBMC與第二佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原和/或所述佐劑的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述方法還包括在與所述佐劑一起孵育以調理所述經修飾的PBMC之前,從所述細胞懸浮液中分離出包含所述抗原和/或所述佐劑的所述多種經修飾的PBMC。

在根據本文描述的多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述抗原存在于所述多種經修飾的PBMC中的細胞的胞質溶膠中,并且所述佐劑存在于所述細胞的囊泡中。在一些實施方案中,所述囊泡是內體。在一些實施方案中,所述抗原和/或所述佐劑存在于所述多種經修飾的PBMC中的細胞的多個區室中。在進一步的實施方案中,所述抗原和/或所述佐劑存在于所述多種PBMC中的至少約70%的細胞中。在一些實施方案中,所述抗原和/或所述佐劑存在于所述多種PBMC中的至少約70%、約75%、約80%、約85%、約95%或約99%中的任一個的細胞中。在一些實施方案中,所述抗原結合至所述多種經修飾的PBMC中的細胞的表面。在一些實施方案中,所述抗原和/或所述佐劑存在于所述多種PBMC中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞中的每一種的至少約70%的細胞中。在一些實施方案中,所述抗原和/或所述佐劑存在于所述多種PBMC中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞中的每一種的至少約70%、約75%、約80%、約85%、約95%或約99%中的任一個的細胞中。在一些實施方案中,所述抗原和/或所述佐劑存在于所述多種PBMC中的T細胞、B細胞、NK細胞或單核細胞中的一種或多種的至少約70%的細胞中。在一些實施方案中,所述抗原和/或所述佐劑存在于所述多種PBMC中的T細胞、B細胞、NK細胞或單核細胞中的一種或多種的至少約70%、約75%、約80%、約85%、約95%或約99%中的任一個的細胞中。

在一些實施方案中,提供了一種包含本文描述的多種經修飾的PBMC中的任一種的組合物。在一些實施方案中,提供了一種包含本文描述的多種經修飾的PBMC中的任一種的組合物,其用作藥物。在一些實施方案中,提供了一種包含本文描述的多種經修飾的PBMC中的任一種的組合物,其用于在通過手術、療法或診斷治療人體或動物體的方法中使用。在一些實施方案中,提供了一種包含本文描述的多種經修飾的PBMC中的任一種的組合物,其用于在治療癌癥或感染性疾病中使用。在一些實施方案中,提供了一種包含本文描述的多種經修飾的PBMC中的任一種的組合物,其用于在治療癌癥、感染性疾病或病毒相關疾病中使用。在一些實施方案中,所述癌癥是頭頸癌、子宮頸癌、外陰癌、陰道癌、陰莖癌、肛門癌、肛周癌、肛門生殖器癌、口腔癌或唾液腺癌。在一些實施方案中,所述感染性疾病與HIV、HPV、EBV、MCV、HBV或HCV相關。在一些實施方案中,存在一種藥物組合物,其包含本文描述的多種經修飾的PBMC中的任一種和藥學上可接受的載體。在一些實施方案中,所述組合物用于治療癌癥或感染性疾病。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述多種PBMC包含編碼抗原的核酸。在一些實施方案中,所述多種PBMC包含編碼抗原的mRNA。

組合物

在某些方面,提供了一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用作藥物,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在通過手術、療法或診斷治療人體或動物體的方法中使用,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用作藥物,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:a)將多種輸入PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述輸入PBMC,從而產生經調理的多種輸入PBMC;b)使包含所述經調理的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成經調理的多種擾動的輸入PBMC;以及c)將所述經調理的多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在治療人體或動物體的方法中使用,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:a)將多種輸入PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述輸入PBMC,從而產生經調理的多種輸入PBMC;b)使包含所述經調理的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成經調理的多種擾動的輸入PBMC;以及c)將所述經調理的多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在治療個體的癌癥、感染性疾病或病毒相關疾病的方法中使用,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在治療個體的癌癥、感染性疾病或病毒相關疾病中使用,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在治療個體的HPV相關疾病的方法中使用,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在治療個體的HPV相關疾病中使用,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物在制造用于治療個體的癌癥、感染性疾病或病毒相關疾病的藥物中的用途,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物在制造用于治療HPV相關疾病的藥物中的用途,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在根據本文描述的組合物中的任一種的一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原的濃度在約0.1μM與約1mM之間和/或與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度在約0.1μM與約1mM之間。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原的濃度在約0.1μM與約10μM之間和/或與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度在約0.1μM與約10μM之間。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原的濃度是約1μM和/或與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度是約1μM。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原與所述佐劑的比率在約10000:1至約1:10000之間。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原與所述佐劑的比率是約200:1。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原與所述佐劑的比率是約20:1。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在根據本文描述的組合物中的任一種的一些實施方案中,所述方法還包括:將包含所述抗原和/或佐劑的所述多種經修飾的PBMC與第二佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原和/或所述佐劑的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述方法還包括在與所述佐劑一起孵育以調理所述經修飾的PBMC之前,從所述細胞懸浮液中分離出包含所述抗原和/或所述佐劑的所述多種經修飾的PBMC。

在根據本文描述的組合物中的任一種的一些實施方案中,所述抗原存在于所述多種經修飾的PBMC中的細胞的胞質溶膠中,并且所述佐劑存在于所述細胞的囊泡中。在一些實施方案中,所述囊泡是內體。在一些實施方案中,所述抗原和/或所述佐劑存在于所述多種經修飾的PBMC中的細胞的多個區室中。在進一步的實施方案中,所述抗原和/或所述佐劑存在于所述多種PBMC中的至少約70%的細胞中。在一些實施方案中,所述抗原和/或所述佐劑存在于所述多種PBMC中的至少約70%、約75%、約80%、約85%、約95%或約99%或100%中的任一個的細胞中。在一些實施方案中,所述抗原結合至所述多種經修飾的PBMC中的細胞的表面。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述多種PBMC包含編碼抗原的核酸。在一些實施方案中,所述多種PBMC包含編碼抗原的mRNA。

產生多種經修飾的PBMC的方法

在一些方面,還提供了一種用于產生包含抗原的經調理的多種PBMC的方法,其包括將包含所述抗原的多種PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種PBMC。

在一些方面,存在一種用于產生包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了一種用于產生包含抗原的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;以及b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了一種用于產生包含抗原和佐劑的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原和所述佐劑通過以形成多種擾動的輸入PBMC;以及b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原和所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原和所述佐劑進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和佐劑的所述多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了一種產生包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:a)將多種輸入PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述輸入PBMC,從而產生經調理的多種輸入PBMC;b)使包含所述經調理的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成經調理的多種擾動的輸入PBMC;以及c)將所述經調理的多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在某些方面,提供了一種用于產生包含抗原和佐劑的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:a)使包含含有佐劑的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;以及b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和所述佐劑的所述多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了一種用于產生包含抗原和佐劑的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:a)使包含含有抗原的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使佐劑通過以形成多種擾動的輸入PBMC;以及b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許所述佐劑進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和所述佐劑的所述多種經修飾的PBMC。

在某些方面,提供了一種用于產生包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在某些方面,提供了用于產生包含人乳頭瘤病毒(HPV)抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述HPV抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述HPV抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述HPV抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了用于產生包含HPV抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,從而產生包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述HPV抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述HPV抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述HPV抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了用于產生包含HPV抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述HPV抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述HPV抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述HPV抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了用于產生包含HPV抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,從而產生包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述HPV抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述HPV抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述HPV抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了用于產生包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述佐劑是CpG 7909,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在根據本文描述的方法中的任一種的一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是(a)約4.2μm至約6μm;或(b)約4.5μm。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是約3μm至約6μm。在一些實施方案中,將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育(a)約2小時至約10小時;(b)約3小時至約6小時;或(c)約4小時。

在根據本文描述的方法中的任一種的一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是(a)約4.2μm至約6μm;或(b)約4.5μm。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是約3μm至約6μm。在一些實施方案中,將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育(a)約2小時至約10小時;(b)約3小時至約6小時;或(c)約4小時。

在一些方面,提供了一種用于產生包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了用于產生包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了一種用于產生包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了用于產生包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在根據本文描述的方法中的任一種的一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是(a)約4.2μm至約6μm;或(b)約4.5μm。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是約3μm至約6μm。在一些實施方案中,將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育(a)約2小時至約10小時;(b)約3小時至約6小時;或(c)約4小時。

在根據本文描述的方法中的任一種的一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是(a)約4.2μm至約6μm;或(b)約4.5μm。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是約3μm至約6μm。在一些實施方案中,將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育(a)約2小時至約10小時;(b)約3小時至約6小時;或(c)約4小時。

在根據本文描述的方法中的任一種的一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原的濃度在約0.1μM與約1mM之間和/或與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度在約0.1μM與約1mM之間。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原的濃度在約0.1μM與約10μM之間和/或與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度在約0.1μM與約10μM之間。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原的濃度是約1μM和/或與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度是約1μM。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原與所述佐劑的比率在約10000:1至約1:10000之間。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原與所述佐劑的比率是約200:1。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原與所述佐劑的比率是約20:1。

在根據本文描述的方法中的任一種的一些實施方案中,所述方法還包括:將包含所述抗原和/或佐劑的所述多種經修飾的PBMC與第二佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原和/或所述佐劑的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述方法還包括在與所述佐劑一起孵育以調理所述經修飾的PBMC之前,從所述細胞懸浮液中分離出包含所述抗原和/或所述佐劑的所述多種經修飾的PBMC。

在根據本文描述的方法中的任一種的一些實施方案中,所述抗原存在于所述多種經修飾的PBMC中的細胞的胞質溶膠中,并且所述佐劑存在于所述細胞的囊泡中。在一些實施方案中,所述囊泡是內體。在一些實施方案中,所述抗原和/或所述佐劑存在于所述多種經修飾的PBMC中的細胞的多個區室中。在進一步的實施方案中,所述抗原和/或所述佐劑存在于所述多種PBMC中的至少約70%的細胞中。在一些實施方案中,所述抗原和/或所述佐劑存在于所述多種PBMC中的至少約70%、約75%、約80%、約85%、約95%或約99%或100%中的任一個的細胞中。在一些實施方案中,所述抗原結合至所述多種經修飾的PBMC中的細胞的表面。在一些實施方案中,所述抗原和/或所述佐劑存在于所述多種經修飾的PBMC內的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞中的每一種的至少約70%、約75%、約80%、約85%、約95%或約99%或100%中的任一個的細胞中。在一些實施方案中,所述抗原和/或所述佐劑存在于所述多種經修飾的PBMC內的T細胞、B細胞、NK細胞或單核細胞中的一種或多種的至少約70%、約75%、約80%、約85%、約95%或約99%或100%中的任一個的細胞中。

在根據本文描述的方法中的任一種的一些實施方案中,所述方法還包括以下步驟:將所述輸入PBMC和/或所述經修飾的PBMC與如下藥劑一起孵育,與在沒有所述進一步孵育步驟的情況下制備的相應經修飾的PBMC相比,所述藥劑增強所述經修飾的PBMC的活力和/或功能。

刺激個體的應答的方法

在一些方面,本發明提供了用于治療和預防癌癥或感染性疾病,和/或調節患有癌癥或感染性疾病的個體的免疫應答的方法,其包括向所述個體施用包含多種經修飾的PBMC的組合物,其中所述經修飾的PBMC在細胞內包含與癌癥或與感染性疾病相關的抗原。

在一些實施方案中,提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括向所述個體施用本文描述的多種經修飾的PBMC、組合物或藥物組合物中的任一種。

在某些方面,提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)向所述個體施用包含抗原的多種經修飾的PBMC,所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任一個的氨基酸序列;以及b)向所述個體施用佐劑。

在某些方面,提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)將包含抗原的多種PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述PBMC,從而產生包含所述抗原的經調理的多種PBMC;b)向所述個體施用包含所述抗原的所述經調理的多種PBMC。

在一些方面,提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)將多種PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述PBMC,從而產生包含抗原的經調理的多種PBMC;b)將抗原引入所述多種PBMC;以及c)向所述個體施用包含所述抗原的所述經調理的多種PBMC。

在一些方面,提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的經調理的多種經修飾的PBMC;以及d)向所述個體施用包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述方法還包括在與所述佐劑一起孵育之前,從所述細胞懸浮液中分離出包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原和佐劑通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原和所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原和所述佐劑進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和佐劑的多種經修飾的PBMC;以及c)向所述個體施用所述多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)將多種輸入PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述輸入PBMC,從而產生經調理的多種輸入PBMC;b)使包含所述經調理的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原通過以形成經調理的多種擾動的輸入PBMC;c)將所述經調理的多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC;以及d)向所述個體施用所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)使包含含有佐劑的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和所述佐劑的多種經修飾的PBMC;以及c)向所述個體施用所述多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在某些方面,提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)使包含含有抗原的輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使佐劑通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許所述佐劑進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和所述佐劑的多種經修飾的PBMC;以及c)向所述個體施用所述多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;c)向所述個體施用所述多種經修飾的PBMC;以及d)向所述個體施用佐劑。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)使包含含有抗原的輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使佐劑通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許所述佐劑進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和所述佐劑的多種經修飾的PBMC;以及c)向所述個體施用所述多種經修飾的PBMC;以及d)向所述個體施用佐劑。

在一些方面,提供了一種用于刺激個體的針對HPV抗原的免疫應答的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的經調理的多種經修飾的PBMC;以及d)向所述個體施用包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了一種用于刺激個體的針對HPV抗原的免疫應答的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,從而產生包含所述HPV抗原的經調理的多種經修飾的PBMC;以及d)向所述個體施用包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述HPV抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述HPV抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述HPV抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了一種用于刺激個體的針對HPV抗原的免疫應答的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的經調理的多種經修飾的PBMC;以及d)向所述個體施用包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述HPV抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述HPV抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述HPV抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了一種用于刺激個體的針對HPV抗原的免疫應答的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,從而產生包含所述HPV抗原的經調理的多種經修飾的PBMC;以及d)向所述個體施用包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述HPV抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述HPV抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述HPV抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在根據本文描述的方法中的任一種的一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是約4μm至約10μm。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是約3μm至約6μm。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是(a)約4.2μm至約6μm;或(b)約4.5μm。在一些實施方案中,將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育(a)約2小時至約10小時;(b)約3小時至約6小時;或(c)約4小時。

在一些方面,提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的經調理的多種經修飾的PBMC;以及d)向所述個體施用包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,從而產生包含所述抗原的經調理的多種經修飾的PBMC;以及d)向所述個體施用包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的經調理的多種經修飾的PBMC;以及d)向所述個體施用包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在一些方面,提供了一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,從而產生包含所述抗原的經調理的多種經修飾的PBMC;以及d)向所述個體施用包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在根據本文描述的方法中的任一種的一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是約4μm至約10μm。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是約3μm至約6μm。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是(a)約4.2μm至約6μm;或(b)約4.5μm。在一些實施方案中,將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育(a)約2小時至約10小時;(b)約3小時至約6小時;或(c)約4小時。

在根據本文描述的方法中的任一種的一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原的濃度在約0.1μM與約1mM之間和/或與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度在約0.1μM與約1mM之間。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原的濃度在約0.1μM與約10μM之間和/或與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度在約0.1μM與約10μM之間。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原的濃度是約1μM和/或與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度是約1μM。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原與所述佐劑的比率在約10000:1至約1:10000之間。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原與所述佐劑的比率是約200:1。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原與所述佐劑的比率是約20:1。

在根據本文描述的方法中的任一種的一些實施方案中,所述方法還包括:將包含所述抗原和/或佐劑的所述多種經修飾的PBMC與第二佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原和/或所述佐劑的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述方法還包括在與所述佐劑一起孵育以調理所述經修飾的PBMC之前,從所述細胞懸浮液中分離出包含所述抗原和/或所述佐劑的所述多種經修飾的PBMC。

在根據本文描述的方法中的任一種的一些實施方案中,所述抗原存在于所述多種經修飾的PBMC中的細胞的胞質溶膠中,并且所述佐劑存在于所述細胞的囊泡中。在一些實施方案中,所述囊泡是內體。在一些實施方案中,所述抗原和/或所述佐劑存在于所述多種經修飾的PBMC中的細胞的多個區室中。在進一步的實施方案中,所述抗原和/或所述佐劑存在于所述多種PBMC中的至少約70%的細胞中。在一些實施方案中,所述抗原和/或所述佐劑存在于所述多種PBMC中的至少約70%、約75%、約80%、約85%、約95%或約99%或100%中的任一個的細胞中。在一些實施方案中,所述抗原結合至所述多種經修飾的PBMC中的細胞的表面。在一些實施方案中,所述抗原存在于所述多種經修飾的PBMC中的至少約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約95%、約99%或100%中的任一個的細胞中。在一些實施方案中,所述抗原存在于所述多種經修飾的PBMC內的T細胞、B細胞、NK細胞或單核細胞中的一種或多種中的至少約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約95%、約99%或100%中的任一個的細胞中。在一些實施方案中,所述抗原存在于所述多種經修飾的PBMC內的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞中的每一種的至少約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約95%、約99%或100%中的任一個的細胞中。在一些實施方案中,所述抗原存在于所述多種經修飾的PBMC內的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞中的一種或多種的至少約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約95%、約99%或100%中的任一個的細胞中。

在根據本文描述的方法中的任一種的一些實施方案中,所述方法還包括以下步驟:將所述輸入PBMC和/或所述經修飾的PBMC與如下藥劑一起孵育,與在沒有所述進一步孵育步驟的情況下制備的相應經修飾的PBMC相比,所述藥劑增強所述經修飾的PBMC的活力和/或功能。

在根據本文描述的方法中的任一種的一些實施方案中,所述方法還包括向所述個體施用第三佐劑。在一些實施方案中,同時施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物和所述第三佐劑。在一些實施方案中,在向所述個體施用所述多種經修飾的PBMC之前、同時或之后施用所述第三佐劑。在一些實施方案中,依序施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物和所述第三佐劑。在一些實施方案中,所述第三佐劑與縮窄部遞送的佐劑相同。在一些實施方案中,所述第三佐劑與所述調理佐劑相同。在一些實施方案中,所述第三佐劑不同于縮窄部遞送的佐劑。在一些實施方案中,所述第三佐劑不同于所述調理佐劑。

在一些實施方案中,所述方法包括多次施用所述經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述方法包括約3至約9次施用所述經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述方法包括約以下中的任一個的次數施用所述經修飾的PBMC:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些實施方案中,所述方法包括根據需要連續施用所述經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述多種經修飾的PBMC的兩次連續施用之間的時間間隔在約1天與約30天之間。在一些實施方案中,所述多種經修飾的PBMC的兩次連續施用之間的時間間隔是約21天。在一些實施方案中,在所述經修飾的免疫細胞的兩次連續施用之間的時間間隔是約以下中的任一個:1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或150天。在一些實施方案中,所述個體對于HLA-A2的表達是陽性的。在一些實施方案中,所述多種經修飾的PBMC中的至少一種細胞對于HLA-A2的表達是陽性的。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC中的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或99%中的任一個對于HLA-A2的表達是陽性的。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC內的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或99%中的任一個的T細胞對于HLA-A2的表達是陽性的。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC內的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或99%中的任一個的B細胞對于HLA-A2的表達是陽性的。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC內的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或99%中的任一個的NK細胞對于HLA-A2的表達是陽性的。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC內的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或99%中的任一個的單核細胞對于HLA-A2的表達是陽性的。

在一些實施方案中,在施用所述第三佐劑之前施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。例如,在施用所述第三佐劑之前約1小時至約1周施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。例如,在一些實施方案中,在施用所述第三佐劑之前約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。在一些實施方案中,在施用所述第三佐劑之前在約1小時與約2小時之間、在約2小時與約3小時之間、在約3小時與約4小時之間、在約4小時與約6小時之間、在約6小時與約8小時之間、在約8小時與約10小時之間、在約10小時與約12小時之間、在約12小時與約14小時之間、在約14小時與約16小時之間、在約16小時與約18小時之間、在約18小時與約20小時之間、在約20小時與約24小時之間、在約24小時與約30小時之間、在約30小時與約36小時之間、在約36小時與約42小時之間、在約42小時與約48小時之間、在約48小時與約60小時之間、在約60小時與約3天之間、在約3天與約4天之間、在約4天與約5天之間、在約5天與約6天之間、在約6天與約7天之間施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。

在一些實施方案中,在施用所述第三佐劑之后施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。例如,在施用所述第三佐劑之后約1小時至約1周施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。例如,在一些實施方案中,在施用所述第三佐劑之后約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。在一些實施方案中,在施用所述第三佐劑之后在約1小時與約2小時之間、在約2小時與約3小時之間、在約3小時與約4小時之間、在約4小時與約6小時之間、在約6小時與約8小時之間、在約8小時與約10小時之間、在約10小時與約12小時之間、在約12小時與約14小時之間、在約14小時與約16小時之間、在約16小時與約18小時之間、在約18小時與約20小時之間、在約20小時與約24小時之間、在約24小時與約30小時之間、在約30小時與約36小時之間、在約36小時與約42小時之間、在約42小時與約48小時之間、在約48小時與約60小時之間、在約60小時與約3天之間、在約3天與約4天之間、在約4天與約5天之間、在約5天與約6天之間、在約6天與約7天之間施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。

在一些實施方案中,所述第三佐劑是任一種IFN-α或CpG ODN。在一些實施方案中,所述第三佐劑是CpG 7909。

在根據本文描述的方法中的任一種的一些實施方案中,在施用治療劑之前、同時或之后施用所述多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述治療劑包括免疫檢查點抑制劑、化學療法或放射療法中的一種或多種。在一些實施方案中,所述治療劑包括一種或多種細胞因子。

免疫檢查點是免疫系統的調節劑,并且保持檢查免疫應答??梢允褂妹庖邫z查點抑制劑來促進免疫應答的增強。在一些實施方案中,將包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物與免疫檢查點抑制劑的施用組合施用。在一些實施方案中,同時施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物和所述免疫檢查點抑制劑。在一些實施方案中,依序施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物和所述免疫檢查點抑制劑。

在一些實施方案中,在施用所述免疫檢查點抑制劑之前施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。在一些實施方案中,在施用所述免疫檢查點抑制劑之后施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。例如,在施用所述免疫檢查點抑制劑之前約1小時至約1周施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。例如,在一些實施方案中,在施用所述免疫檢查點抑制劑之前約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。在一些實施方案中,在施用所述免疫檢查點抑制劑之前在約1小時與約2小時之間、在約2小時與約3小時之間、在約3小時與約4小時之間、在約4小時與約6小時之間、在約6小時與約8小時之間、在約8小時與約10小時之間、在約10小時與約12小時之間、在約12小時與約14小時之間、在約14小時與約16小時之間、在約16小時與約18小時之間、在約18小時與約20小時之間、在約20小時與約24小時之間、在約24小時與約30小時之間、在約30小時與約36小時之間、在約36小時與約42小時之間、在約42小時與約48小時之間、在約48小時與約60小時之間、在約60小時與約3天之間、在約3天與約4天之間、在約4天與約5天之間、在約5天與約6天之間、在約6天與約7天之間施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。

在一些實施方案中,在施用所述免疫檢查點抑制劑之前約7天、約10天、約14天、約18天、約21天、約24天、約28天、約30天、約35天、約40天、約45天或約50天施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。在一些實施方案中,在施用所述免疫檢查點抑制劑之前在約7天至約10天之間、在約10天與約14天之間、在約14天與約18天之間、在約18天與約21天之間、在約21天與約24天之間、在約24天與約28天之間、在約28天與約30天之間、在約30天與約35天之間、在約35天與約40天之間、在約40天與約45天之間或在約45天與約50天之間施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。

在一些實施方案中,在施用所述免疫檢查點抑制劑之后施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。例如,在施用所述免疫檢查點抑制劑之后約1小時至約1周施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。例如,在一些實施方案中,在施用所述免疫檢查點抑制劑之后約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。在一些實施方案中,在施用所述免疫檢查點抑制劑之后在約1小時與約2小時之間、在約2小時與約3小時之間、在約3小時與約4小時之間、在約4小時與約6小時之間、在約6小時與約8小時之間、在約8小時與約10小時之間、在約10小時與約12小時之間、在約12小時與約14小時之間、在約14小時與約16小時之間、在約16小時與約18小時之間、在約18小時與約20小時之間、在約20小時與約24小時之間、在約24小時與約30小時之間、在約30小時與約36小時之間、在約36小時與約42小時之間、在約42小時與約48小時之間、在約48小時與約60小時之間、在約60小時與約3天之間、在約3天與約4天之間、在約4天與約5天之間、在約5天與約6天之間、在約6天與約7天之間施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。

在一些實施方案中,在施用所述免疫檢查點抑制劑之后約7天、約10天、約14天、約18天、約21天、約24天、約28天、約30天、約35天、約40天、約45天或約50天施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。在一些實施方案中,在施用所述免疫檢查點抑制劑之后在約7天至約10天之間、在約10天與約14天之間、在約14天與約18天之間、在約18天與約21天之間、在約21天與約24天之間、在約24天與約28天之間、在約28天與約30天之間、在約30天與約35天之間、在約35天與約40天之間、在約40天與約45天之間或在約45天與約50天之間施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。

在一些實施方案中,所述方法包括多次施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物和/或多次施用所述免疫檢查點抑制劑。例如,在一些實施方案中,所述方法包括兩次施用、三次施用、四種施用、五次施用、六次施用、七次施用、八次施用、九次施用、十次施用、十一次施用、十二次施用、十三次施用、十四次施用或十五次施用包含所述經修飾的PBMC的所述組合物和/或所述免疫檢查點抑制劑。例如,在一些實施方案中,所述方法包括少于五次施用、少于十次施用、少于十五次施用、少于二十次施用、少于二十五次施用、少于三十次施用、少于五十次施用、少于七十次-五次施用、少于一百次或少于兩百次施用包含所述經修飾的PBMC的所述組合物和/或所述免疫檢查點抑制劑。

示例性免疫檢查點抑制劑靶向但不限于PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA。在一些實施方案中,所述免疫檢查點抑制劑靶向以下中的一種或多種:PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA。在一些實施方案中,所述免疫檢查點抑制劑是以下中的一種或多種:結合至PD-1的抗體、結合PD-L1的抗體、結合CTLA-4的抗體、結合LAG3的抗體或結合TIM-3的抗體、結合TIGIT的抗體、結合VISTA的抗體、結合TIM-1的抗體、結合B7-H4的抗體或結合BTLA的抗體。在進一步的實施方案中,所述抗體可以是全長抗體或任何變體,例如但不限于抗體片段、單鏈可變片段(ScFv)或抗原結合片段(Fab)。在進一步的實施方案中,所述抗體可以是雙特異性的、三特異性的或多特異性的。在一些實施方案中,所述免疫檢查點抑制劑是結合至和/或抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA中的一種或多種的一種或多種化學化合物。在一些實施方案中,所述免疫檢查點抑制劑是結合至和/或抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA中的一種或多種的一種或多種肽。在一些實施方案中,所述免疫檢查點抑制劑靶向PD-1。在一些實施方案中,所述免疫檢查點抑制劑靶向PD-L1。

可以將細胞因子與本文描述的多種經修飾的PBMC中的任一種組合使用以實現針對癌癥(例如,HPV相關癌癥)的累加或協同作用。在一些實施方案中,將包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物與一種或多種細胞因子的施用組合施用。在一些實施方案中,同時施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物和所述細胞因子。在一些實施方案中,依序施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物和所述細胞因子。

在一些實施方案中,在施用所述細胞因子之前施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。在一些實施方案中,在施用所述細胞因子之后施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。例如,在施用所述細胞因子之前約1小時至約1周施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。例如,在一些實施方案中,在施用所述細胞因子之前約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。在一些實施方案中,在施用所述細胞因子之前在約1小時與約2小時之間、在約2小時與約3小時之間、在約3小時與約4小時之間、在約4小時與約6小時之間、在約6小時與約8小時之間、在約8小時與約10小時之間、在約10小時與約12小時之間、在約12小時與約14小時之間、在約14小時與約16小時之間、在約16小時與約18小時之間、在約18小時與約20小時之間、在約20小時與約24小時之間、在約24小時與約30小時之間、在約30小時與約36小時之間、在約36小時與約42小時之間、在約42小時與約48小時之間、在約48小時與約60小時之間、在約60小時與約3天之間、在約3天與約4天之間、在約4天與約5天之間、在約5天與約6天之間、在約6天與約7天之間施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。

在一些實施方案中,在施用所述細胞因子之前約7天、約10天、約14天、約18天、約21天、約24天、約28天、約30天、約35天、約40天、約45天或約50天施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。在一些實施方案中,在施用所述細胞因子之前在約7天至約10天之間、在約10天與約14天之間、在約14天與約18天之間、在約18天與約21天之間、在約21天與約24天之間、在約24天與約28天之間、在約28天與約30天之間、在約30天與約35天之間、在約35天與約40天之間、在約40天與約45天之間或在約45天與約50天之間施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。

在一些實施方案中,在施用所述細胞因子之后施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。例如,在施用所述細胞因子之后約1小時至約1周施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。例如,在一些實施方案中,在施用所述細胞因子之后約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。在一些實施方案中,在施用所述細胞因子之后在約1小時與約2小時之間、在約2小時與約3小時之間、在約3小時與約4小時之間、在約4小時與約6小時之間、在約6小時與約8小時之間、在約8小時與約10小時之間、在約10小時與約12小時之間、在約12小時與約14小時之間、在約14小時與約16小時之間、在約16小時與約18小時之間、在約18小時與約20小時之間、在約20小時與約24小時之間、在約24小時與約30小時之間、在約30小時與約36小時之間、在約36小時與約42小時之間、在約42小時與約48小時之間、在約48小時與約60小時之間、在約60小時與約3天之間、在約3天與約4天之間、在約4天與約5天之間、在約5天與約6天之間、在約6天與約7天之間施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。

示例性細胞因子包括但不限于趨化因子、干擾素、白介素、淋巴因子和腫瘤壞死因子。在一些實施方案中,所述細胞因子增強細胞免疫應答。在一些實施方案中,所述細胞因子增強抗體應答。在一些實施方案中,所述細胞因子是I型細胞因子。在一些實施方案中,所述細胞因子是2型細胞因子。在一些實施方案中,所述細胞因子包括以下中的一種或多種:IL-2、IL-15、IL-10、IL-12、IFN-a或IL-21。在一些實施方案中,所述細胞因子包括IL-15。

可以將化學療法與本文描述的多種經修飾的PBMC中的任一種組合使用以實現針對癌癥(例如,HPV相關癌癥)的累加或協同作用。在一些實施方案中,將包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物與化學療法的施用組合施用。在一些實施方案中,同時施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物和所述化學療法。在一些實施方案中,依序施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物和所述化學療法。

在一些實施方案中,在施用所述化學療法之前施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。在一些實施方案中,在施用所述化學療法之后施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。例如,在施用所述化學療法之前約1小時至約1周施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。例如,在一些實施方案中,在施用所述化學療法之前約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。在一些實施方案中,在施用所述化學療法之前在約1小時與約2小時之間、在約2小時與約3小時之間、在約3小時與約4小時之間、在約4小時與約6小時之間、在約6小時與約8小時之間、在約8小時與約10小時之間、在約10小時與約12小時之間、在約12小時與約14小時之間、在約14小時與約16小時之間、在約16小時與約18小時之間、在約18小時與約20小時之間、在約20小時與約24小時之間、在約24小時與約30小時之間、在約30小時與約36小時之間、在約36小時與約42小時之間、在約42小時與約48小時之間、在約48小時與約60小時之間、在約60小時與約3天之間、在約3天與約4天之間、在約4天與約5天之間、在約5天與約6天之間、在約6天與約7天之間施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。

在一些實施方案中,在施用所述化學療法之后施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。例如,在施用所述化學療法之后約1小時至約1周施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。例如,在一些實施方案中,在施用所述化學療法之后約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。在一些實施方案中,在施用所述化學療法之后在約1小時與約2小時之間、在約2小時與約3小時之間、在約3小時與約4小時之間、在約4小時與約6小時之間、在約6小時與約8小時之間、在約8小時與約10小時之間、在約10小時與約12小時之間、在約12小時與約14小時之間、在約14小時與約16小時之間、在約16小時與約18小時之間、在約18小時與約20小時之間、在約20小時與約24小時之間、在約24小時與約30小時之間、在約30小時與約36小時之間、在約36小時與約42小時之間、在約42小時與約48小時之間、在約48小時與約60小時之間、在約60小時與約3天之間、在約3天與約4天之間、在約4天與約5天之間、在約5天與約6天之間、在約6天與約7天之間施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。

在一些實施方案中,在施用所述化學療法之后約7天、約10天、約14天、約18天、約21天、約24天、約28天、約30天、約35天、約40天、約45天或約50天施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。在一些實施方案中,在施用所述化學療法之后在約7天至約10天之間、在約10天與約14天之間、在約14天與約18天之間、在約18天與約21天之間、在約21天與約24天之間、在約24天與約28天之間、在約28天與約30天之間、在約30天與約35天之間、在約35天與約40天之間、在約40天與約45天之間或在約45天與約50天之間施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。

在一些實施方案中,所述方法包括多次施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物和/或多次施用所述化學療法。例如,在一些實施方案中,所述方法包括兩次施用、三次施用、四種施用、五次施用、六次施用、七次施用、八次施用、九次施用、十次施用、十一次施用、十二次施用、十三次施用、十四次施用或十五次施用包含所述經修飾的PBMC的所述組合物和/或所述化學療法。例如,在一些實施方案中,所述方法包括少于五次施用、少于十次施用、少于十五次施用、少于二十次施用、少于二十五次施用、少于三十次施用、少于五十次施用、少于七十次-五次施用、少于一百次或少于兩百次施用包含所述經修飾的PBMC的所述組合物和/或所述化學療法。

示例性化學療法可以是細胞周期依賴性的或非細胞周期依賴性的。在一些實施方案中,所述化學療法包含一種或多種化學治療劑。在一些實施方案中,化學治療劑可以靶向癌癥的細胞分裂、DNA或代謝中的一種或多種。在一些實施方案中,化學治療劑是基于鉑的藥劑,諸如但不限于順鉑、奧沙利鉑或卡鉑。在一些實施方案中,化學治療劑是紫杉烷(諸如多西他賽或紫杉醇)。在一些實施方案中,化學治療劑是5-氟尿嘧啶、阿霉素或伊立替康。在一些實施方案中,化學治療劑是以下的一種或多種:烷基化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、拓撲異構酶抑制劑或有絲分裂抑制劑。在一些實施方案中,化學療法包含順鉑。

可以將放射療法與本文描述的多種經修飾的PBMC中的任一種組合使用以實現針對癌癥(例如,HPV相關癌癥)的累加或協同作用。在一些實施方案中,將包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物與放射療法的施用組合施用。在一些實施方案中,同時施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物和所述放射療法。在一些實施方案中,依序施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物和所述放射療法。在一些實施方案中,將包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物與放射療法的施用組合、與化學療法組合和/或與免疫檢查點抑制劑組合施用。

在一些實施方案中,在施用所述放射療法之前施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。在一些實施方案中,在施用所述放射療法之后施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。例如,在施用所述放射療法之前約1小時至約1周施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。例如,在一些實施方案中,在施用所述放射療法之前約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。在一些實施方案中,在施用所述放射療法之前在約1小時與約2小時之間、在約2小時與約3小時之間、在約3小時與約4小時之間、在約4小時與約6小時之間、在約6小時與約8小時之間、在約8小時與約10小時之間、在約10小時與約12小時之間、在約12小時與約14小時之間、在約14小時與約16小時之間、在約16小時與約18小時之間、在約18小時與約20小時之間、在約20小時與約24小時之間、在約24小時與約30小時之間、在約30小時與約36小時之間、在約36小時與約42小時之間、在約42小時與約48小時之間、在約48小時與約60小時之間、在約60小時與約3天之間、在約3天與約4天之間、在約4天與約5天之間、在約5天與約6天之間、在約6天與約7天之間施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。

在一些實施方案中,在施用所述放射療法之后施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。例如,在施用所述放射療法之后約1小時至約1周施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。例如,在一些實施方案中,在施用所述放射療法之后約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。在一些實施方案中,在施用所述放射療法之后在約1小時與約2小時之間、在約2小時與約3小時之間、在約3小時與約4小時之間、在約4小時與約6小時之間、在約6小時與約8小時之間、在約8小時與約10小時之間、在約10小時與約12小時之間、在約12小時與約14小時之間、在約14小時與約16小時之間、在約16小時與約18小時之間、在約18小時與約20小時之間、在約20小時與約24小時之間、在約24小時與約30小時之間、在約30小時與約36小時之間、在約36小時與約42小時之間、在約42小時與約48小時之間、在約48小時與約60小時之間、在約60小時與約3天之間、在約3天與約4天之間、在約4天與約5天之間、在約5天與約6天之間、在約6天與約7天之間施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。

在一些實施方案中,在施用所述放射療法之后約7天、約10天、約14天、約18天、約21天、約24天、約28天、約30天、約35天、約40天、約45天或約50天施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。在一些實施方案中,在施用所述放射療法之后在約7天至約10天之間、在約10天與約14天之間、在約14天與約18天之間、在約18天與約21天之間、在約21天與約24天之間、在約24天與約28天之間、在約28天與約30天之間、在約30天與約35天之間、在約35天與約40天之間、在約40天與約45天之間或在約45天與約50天之間施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物。

在一些實施方案中,所述方法包括多次施用包含所述多種經修飾的PBMC的所述組合物和/或多次施用所述放射療法。例如,在一些實施方案中,所述方法包括兩次施用、三次施用、四種施用、五次施用、六次施用、七次施用、八次施用、九次施用、十次施用、十一次施用、十二次施用、十三次施用、十四次施用或十五次施用包含所述經修飾的PBMC的所述組合物和/或所述放射療法。例如,在一些實施方案中,所述方法包括少于五次施用、少于十次施用、少于十五次施用、少于二十次施用、少于二十五次施用、少于三十次施用、少于五十次施用、少于七十次-五次施用、少于一百次或少于兩百次施用包含所述經修飾的PBMC的所述組合物和/或所述放射療法。

在一些實施方案中,提供了包含抗原的多種PBMC,其用于在根據本文描述的任一種方法的刺激個體的免疫應答的方法中使用。

在根據本文描述的方法中的任一種的一些方法中,所述方法刺激個體的針對HPV抗原的免疫應答。乳頭瘤病毒是病毒粒子大小為直徑約55nm的小型無包膜DNA病毒。已完全表征了超過100種HPV基因型,并且推測存在更高的數量。HPV是子宮頸癌以及一些外陰癌、陰道癌、陰莖癌、口咽癌、肛門癌和直腸癌的已知病因。盡管大多數HPV感染是無癥狀的并且自發清除,但是一種致癌性HPV類型的持續性感染可能發展為癌前期或癌癥。其他HPV相關疾病可以包括尋常疣、足底疣、扁平疣、肛門生殖器疣、肛門病變、表皮發育不良、局灶性上皮增生、口腔乳頭瘤、疣狀囊腫、喉乳頭瘤病、鱗狀上皮內病變(SIL)、子宮頸上皮內瘤樣病變(CIN)、外陰上皮內瘤樣病變(VIN)和陰道上皮內瘤樣病變(VAIN)。許多已知的人乳頭瘤病毒(HPV)類型會引起良性病變,其一個亞組是致癌的?;诹餍胁W和系統發育關系,HPV類型分為15種“高風險類型”(HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82)和三種“可能的高風險類型”(HPV 26、53和66),已知它們共同表現為低級和高級子宮頸變化和癌癥以及其他肛門生殖器癌(諸如外陰癌、陰道癌、陰莖癌、肛門癌和肛周癌)以及頭頸癌。最近,還描述了高風險型HPV 16和18與乳腺癌的相關性。已知被歸類為“低風險型”的11種HPV類型(HPV 6、11、40、42、43、44、54、61、70、72和81)表現為良性低級子宮頸變化、生殖器疣和復發性呼吸道乳頭瘤病。皮膚HPV類型5、8和92與皮膚癌有關。在一些HPV相關癌癥中,免疫系統受到抑制,并且相應地抗腫瘤應答顯著受損。參見Suresh和Burtness,Am J Hematol Oncol 13(6):20-27(2017)。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述多種PBMC包含編碼抗原的核酸。在一些實施方案中,所述多種PBMC包含編碼抗原的mRNA。

PBMC組合物

如本文所用,可以通過白細胞單采術從獲自個體的全血中分離出PBMC。還提供了PBMC組合物,其通過將來自同一個體或不同個體的不同PBMC集合混合來重構。在其他例子中,也可以通過將不同的細胞群體混合成具有產生譜的混合細胞組合物中來重構PBMC。在一些實施方案中,用于重構PBMC的細胞群體是混合細胞群體(諸如T細胞、B細胞、NK細胞或單核細胞中的一種或多種的混合物)。在一些實施方案中,用于重構PBMC的細胞群體是純化的細胞群體(諸如純化的T細胞、B細胞、NK細胞或單核細胞)。在另外的例子中,用于重構PBMC組合物的不同細胞群可以從同一個體分離(例如自體的)或從不同個體分離(例如同種異體和/或異源的)。

因此,在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述多種輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核細胞、樹突細胞或NK-T細胞中的一種或多種。在一些實施方案中,所述多種輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核細胞、樹突細胞或NK-T細胞。在一些實施方案中,所述多種輸入PBMC包含CD3+ T細胞、CD20+ B細胞、CD14+單核細胞、CD56+ NK細胞中的一種或多種。在一些實施方案中,所述多種輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞,并且所述多種輸入PBMC中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率基本上與全血中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率相同。在一些實施方案中,所述多種輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞,并且所述多種輸入PBMC中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率基本上與來自全血的白細胞單采術產物中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率相同。在一些實施方案中,所述多種輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞,并且所述多種輸入PBMC中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率與全血中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率相差不超過以下中的任一個:1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%或50%。在一些實施方案中,所述多種輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞,并且所述多種輸入PBMC中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率與全血中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率相差不超過10%中的任一個。在一些實施方案中,所述多種輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞,并且所述多種輸入PBMC中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率與來自全血的白細胞單采術產物中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率相差不超過以下中的任一個:1%、2%、5%、10%15%、20%、25%、30%、40%或50%。在一些實施方案中,所述多種輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞,并且所述多種輸入PBMC中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率與來自全血的白細胞單采術產物中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率相差不超過10%中的任一個。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,約25%至約70%的所述經修飾的PBMC是T細胞。在一些實施方案中,約2.5%至約14%的所述經修飾的PBMC是B細胞。在一些實施方案中,約3.5%至約35%的所述經修飾的PBMC是NK細胞。在一些實施方案中,約4%至約25%的所述經修飾的PBMC是NK細胞。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,至少約90%至約99%的所述輸入PBMC由T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞組成。在一些實施方案中,至少約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%或約95%至約99%中的任一個的所述輸入PBMC由T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞組成。在一些實施方案中,至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中的任一個的所述輸入PBMC由T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞組成。在一些實施方案中,至少約90%的輸入PBMC由T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞組成。在一些實施方案中,所述輸入PBMC由T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞組成。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,至少約90%至約99%的所述經修飾的PBMC由T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞組成。在一些實施方案中,至少約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%或約95%至約99%中的任一個的所述經修飾的PBMC由T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞組成。在一些實施方案中,至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中的任一個的所述經修飾的PBMC由T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞組成。在一些實施方案中,至少約90%的所述經修飾的PBMC由T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞組成。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC由T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞組成。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,至少約15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%中的任一個的所述輸入PBMC是T細胞。在一些實施方案中,至少約25%的所述輸入PBMC是T細胞。在一些實施方案中,至少約0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、6%、7%、7.5%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%或30%中的任一個的所述輸入PBMC是B細胞。在一些實施方案中,至少約2.5%的輸入PBMC是B細胞。在一些實施方案中,至少約0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、6%、7%、7.5%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%或30%中的任一個的所述輸入PBMC是NK細胞。在一些實施方案中,至少約3.5%的所述輸入PBMC是NK細胞。在一些實施方案中,至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、12%、14%、16%、18%、20%、25%、30%、35%或40%中的任一個的所述輸入PBMC是單核細胞。在一些實施方案中,至少約4%的輸入PBMC是單核細胞。在一些實施方案中,至少約25%的輸入PBMC是T細胞;至少約2.5%的輸入PBMC是B細胞;至少約3.5%的輸入PBMC是NK細胞;并且至少約4%的輸入PBMC是單核細胞。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%或70%中的任一個的所述經修飾的PBMC是T細胞。在一些實施方案中,至少約20%的所述經修飾的PBMC是T細胞。在一些實施方案中,至少約0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、6%、7%、7.5%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%或30%中的任一個的所述經修飾的PBMC是B細胞。在一些實施方案中,至少約2%的所述經修飾的PBMC是B細胞。在一些實施方案中,至少約0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、6%、7%、7.5%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%或30%中的任一個的所述經修飾的PBMC是NK細胞。在一些實施方案中,至少約3%的所述經修飾的PBMC是NK細胞。在一些實施方案中,至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、12%、14%、16%、18%、20%、25%、30%、35%或40%中的任一個的所述經修飾的PBMC是單核細胞。在一些實施方案中,至少約3%的所述經修飾的PBMC是單核細胞。在一些實施方案中,至少約20%的所述經修飾的PBMC是T細胞;至少約2%的所述經修飾的PBMC是B細胞;至少約3%的所述經修飾的PBMC是NK細胞;并且至少約3%的所述經修飾的PBMC是單核細胞。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,不超過約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%中的任一個的所述輸入PBMC是T細胞。在一些實施方案中,不超過約70%的所述輸入PBMC是T細胞。在一些實施方案中,不超過約5%、10%、12%、14%、16%、18%、20%、22%、25%、30%、35%、40%或50%中的任一個的所述輸入PBMC是B細胞。在一些實施方案中,不超過約14%的所述輸入PBMC是B細胞。在一些實施方案中,不超過約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或60%中的任一個的所述輸入PBMC是NK細胞。在一些實施方案中,不超過約35%的所述輸入PBMC是NK細胞。在一些實施方案中,不超過約5%、10%、12%、14%、16%、18%、20%、22%、25%、30%、35%、40%或50%中的任一個的所述輸入PBMC是單核細胞。在一些實施方案中,不超過約4%的所述輸入PBMC是單核細胞。在一些實施方案中,不超過約25%的所述輸入PBMC是T細胞;不超過約2.5%的所述輸入PBMC是B細胞;不超過約3.5%的所述輸入PBMC是NK細胞;并且不超過約4%的所述輸入PBMC是單核細胞。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,不超過約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%或70%中的任一個的所述經修飾的PBMC是T細胞。在一些實施方案中,不超過約20%的所述經修飾的PBMC是T細胞。在一些實施方案中,不超過約0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、6%、7%、7.5%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%或30%中的任一個的所述經修飾的PBMC是B細胞。在一些實施方案中,不超過約2%的所述經修飾的PBMC是B細胞。在一些實施方案中,不超過約0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、6%、7%、7.5%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%或30%中的任一個的所述經修飾的PBMC是NK細胞。在一些實施方案中,不超過約3%的所述經修飾的PBMC是NK細胞。在一些實施方案中,不超過約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、12%、14%、16%、18%、20%、25%、30%、35%或40%中的任一個的所述經修飾的PBMC是單核細胞。在一些實施方案中,不超過約3%的所述經修飾的PBMC是單核細胞。在一些實施方案中,不超過約20%的所述經修飾的PBMC是T細胞;不超過約2%的所述經修飾的PBMC是B細胞;不超過約3%的所述經修飾的PBMC是NK細胞;并且不超過約3%的所述經修飾的PBMC是單核細胞。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,約20%至25%、25%至30%、30%至35%、35%至40%、40%至45%、45%至50%、50%至55%、55%至60%、60%至65%、65%至70%或70%至75%中的任一個的所述經修飾的PBMC是T細胞。在一些實施方案中,約25%至約70%的所述經修飾的PBMC是T細胞。在一些實施方案中,約1%至2.5%、2.5%至4%、4%至6%、6%至8%、8%至10%、10%至12%、12%至14%、14%至16%、16%至20%或20%至25%中的任一個的所述經修飾的PBMC是B細胞。在一些實施方案中,約2.5%至約14%的所述經修飾的PBMC是B細胞。在一些實施方案中,約1%至2%、2%至3.5%、3.5%至5%、5%至8%、8%至10%、10%至12%、12%至14%、14%至16%、16%至20%或20%至25%中的任一個的所述經修飾的PBMC是B細胞。在一些實施方案中,約3.5%至約35%的所述經修飾的PBMC是NK細胞。在一些實施方案中,約2%至4%、4%至6%、6%至8%、8%至10%、10%至12%、12%至14%、14%至16%、16%至20%、20%至25%、25%至30%、30%至35%或35%至40%中的任一個的所述經修飾的PBMC是單核細胞。在一些實施方案中,約4%至約25%的所述經修飾的PBMC是單核細胞。在一些實施方案中,約25%至約70%的所述經修飾的PBMC是T細胞,約2.5%至約14%的所述經修飾的PBMC是B細胞,約3.5%至約35%的所述經修飾的PBMC是NK細胞,并且約4%至約25%的所述經修飾的PBMC是NK細胞。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,約20%至25%、25%至30%、30%至35%、35%至40%、40%至45%、45%至50%、50%至55%、55%至60%、60%至65%、65%至70%或70%至75%中的任一個的所述經修飾的PBMC是T細胞。在一些實施方案中,約25%至約70%的所述經修飾的PBMC是T細胞。在一些實施方案中,約1%至2.5%、2.5%至4%、4%至6%、6%至8%、8%至10%、10%至12%、12%至14%、14%至16%、16%至20%或20%至25%中的任一個的所述經修飾的PBMC是B細胞。在一些實施方案中,約2.5%至約14%的所述經修飾的PBMC是B細胞。在一些實施方案中,約1%至2%、2%至3.5%、3.5%至5%、5%至8%、8%至10%、10%至12%、12%至14%、14%至16%、16%至20%或20%至25%中的任一個的所述經修飾的PBMC是NK細胞。在一些實施方案中,約3.5%至約35%的所述經修飾的PBMC是NK細胞。在一些實施方案中,約2%至4%、4%至6%、6%至8%、8%至10%、10%至12%、12%至14%、14%至16%、16%至20%、20%至25%、25%至30%、30%至35%或35%至40%中的任一個的所述經修飾的PBMC是單核細胞。在一些實施方案中,約4%至約25%的所述經修飾的PBMC是單核細胞。在一些實施方案中,約25%至約70%的所述經修飾的PBMC是T細胞,約2.5%至約14%的所述經修飾的PBMC是B細胞,約3.5%至約35%的所述經修飾的PBMC是NK細胞,并且約4%至約25%的所述經修飾的PBMC是NK細胞。

如本文所使用的,PBMC也可以在操縱單核血細胞(諸如淋巴細胞和單核細胞)的混合細胞群體的組成之后產生。在一些情況下,在減少(諸如耗盡)單核血細胞的混合細胞群體內的某些亞群(諸如B細胞)之后,產生輸入PBMC??梢詫€體中單核血細胞的混合細胞群體中的組成進行操縱,以使所述細胞群體更類似于來自同一個體中的全血的白細胞單采術產物。在其他例子中,還可以操縱單核血細胞(例如,小鼠脾細胞)的混合細胞群體中的組成,以使所述細胞群體更類似于從來自人全血的白細胞單采術產物中分離的人PBMC。

在一些實施方案中,構建介導的遞送不以顯著方式差異性地調節PBMC內的不同亞群(諸如B細胞、T細胞、NK細胞或單核細胞)的活力。在一些實施方案中,調理過程不以顯著的方式差異性地調節PBMC內的不同亞群的活力。在一些實施方案中,進一步添加藥劑(包括但不限于以下中的任一種:生物保存劑或增強PBMC的功能和/或活力的藥劑)不以顯著的方式差異性地調節PBMC內的各種亞群的活力。因此,在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述多種經修飾的PBMC內T細胞的百分比和所述多種輸入PBMC內T細胞的百分比相差按數量計不超過約10%。在一些實施方案中,所述多種經修飾的PBMC內T細胞的百分比和所述多種輸入PBMC內T細胞的百分比相差按數量計不超過約5%、8%、10%、12%、14%、16%、18%或20%中的任一個。在一些實施方案中,所述多種經修飾的PBMC內B細胞的百分比和所述多種輸入PBMC內B細胞的百分比相差按數量計不超過約10%。在一些實施方案中,所述多種經修飾的PBMC內B細胞的百分比和所述多種輸入PBMC內B細胞的百分比相差按數量計不超過約5%、8%、10%、12%、14%、16%、18%或20%中的任一個。在一些實施方案中,所述多種經修飾的PBMC內NK細胞的百分比和所述多種輸入PBMC內NK細胞的百分比相差按數量計不超過約10%。在一些實施方案中,所述多種經修飾的PBMC內NK細胞的百分比和所述多種輸入PBMC內NK細胞的百分比相差按數量計不超過約5%、8%、10%、12%、14%、16%、18%或20%中的任一個。在一些實施方案中,所述多種經修飾的PBMC內單核細胞的百分比和所述多種輸入PBMC內單核細胞的百分比相差按數量計不超過約10%。在一些實施方案中,所述多種經修飾的PBMC內單核細胞的百分比和所述多種輸入PBMC內單核細胞的百分比相差按數量計不超過約5%、8%、10%、12%、14%、16%、18%或20%中的任一個。

抗原

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述抗原是疾病相關抗原。在一些實施方案中,所述抗原源自從患病細胞分離的肽或mRNA。在一些實施方案中,所述抗原是非自身抗原。在一些實施方案中,所述抗原是腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或真菌抗原。在一些實施方案中,所述抗原源自裂解物,諸如疾病細胞的裂解物。在一些實施方案中,所述抗原源自腫瘤裂解物。在一些實施方案中,所述抗原是腫瘤抗原或腫瘤相關抗原。在一些實施方案中,所述抗原與癌癥相關。在一些實施方案中,所述癌癥是頭頸癌、子宮頸癌、外陰癌、陰道癌、陰莖癌、肛門癌、肛周癌、肛門生殖器癌、口腔癌或唾液腺癌。在一些實施方案中,所述抗原是頭頸癌抗原、子宮頸癌抗原、外陰癌抗原、陰道癌抗原、陰莖癌抗原、肛門癌抗原、肛周癌抗原、肛門生殖器癌抗原、口腔癌抗原、唾液腺癌抗原、乳腺癌抗原、皮膚癌抗原、膀胱癌抗原、結腸癌、直腸癌抗原、子宮內膜癌抗原、腎癌抗原、白血病抗原、肺癌抗原、黑色素瘤抗原、非霍奇金淋巴瘤抗原、胰腺癌抗原、前列腺癌抗原或甲狀腺癌抗原,在一些實施方案中,所述癌癥是實體癌癥。在一些實施方案中,所述癌癥是血液學癌癥。在一些實施方案中,所述癌癥是病毒相關癌癥。在一些實施方案中,所述癌癥是HPV相關癌癥。在一些實施方案中,所述癌癥是局部癌癥。在一些實施方案中,所述癌癥是轉移性癌癥。在一些實施方案中,所述抗原與感染性疾病相關。在一些實施方案中,所述感染性疾病與HIV、HPV、EBV、MCV、HBV或HCV相關。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述抗原是人乳頭瘤病毒(HPV)抗原。乳頭瘤病毒是病毒粒子大小為直徑約55nm的小型無包膜DNA病毒。已完全表征了超過100種HPV基因型,并且推測存在更高的數量。HPV是子宮頸癌以及一些外陰癌、陰道癌、陰莖癌、口咽癌、肛門癌和直腸癌的已知病因。盡管大多數HPV感染是無癥狀的并且自發清除,但是一種致癌性HPV類型的持續性感染可能發展為癌前期或癌癥。其他HPV相關疾病可以包括尋常疣、足底疣、扁平疣、肛門生殖器疣、肛門病變、表皮發育不良、局灶性上皮增生、口腔乳頭瘤、疣狀囊腫、喉乳頭瘤病、鱗狀上皮內病變(SIL)、子宮頸上皮內瘤樣病變(CIN)、外陰上皮內瘤樣病變(VIN)和陰道上皮內瘤樣病變(VAIN)。許多已知的人乳頭瘤病毒(HPV)類型會引起良性病變,其一個亞組是致癌的?;诹餍胁W和系統發育關系,HPV類型分為15種“高風險類型”(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82)和三種“可能的高風險類型”(HPV 26、53和66),已知它們共同表現為低級和高級子宮頸變化和癌癥以及其他肛門生殖器癌(諸如外陰癌、陰道癌、陰莖癌、肛門癌和肛周癌)以及頭頸癌。最近,還描述了高風險型HPV 16和18與乳腺癌的相關性。已知被歸類為“低風險型”的11種HPV類型(HPV 6、11、40、42、43、44、54、61、70、72和81)表現為良性低級子宮頸變化、生殖器疣和復發性呼吸道乳頭瘤病。皮膚HPV類型5、8和92與皮膚癌有關。在一些HPV相關癌癥中,免疫系統受到抑制,并且相應地抗腫瘤應答顯著受損。參見Suresh和Burtness,Am J Hematol Oncol 13(6):20-27(2017)。在一些實施方案中,所述抗原是引發針對相同和或不同抗原的應答的多種多肽的集合。在一些實施方案中,所述多種抗原的集合中的抗原不降低針對所述多種抗原的集合中的其他抗原的免疫應答。在一些實施方案中,所述HPV抗原是包含抗原性HPV表位和一個或多個異源肽序列的多肽。在一些實施方案中,所述HPV抗原與其自身、與其他抗原或與所述佐劑復合。在一些實施方案中,所述HPV是HPV-16或HPV-18。在一些實施方案中,所述HPV抗原由HLA-A2特異性表位構成。在一些實施方案中,所述HPV抗原是HPV E6抗原或HPV E7抗原。在一些實施方案中,所述抗原包含源自HPV E6和/或E7的肽。在一些實施方案中,所述抗原包含源自HPV E6和/或E7的HLA-A2限制性肽。在一些實施方案中,所述HLA-A2限制性肽包含SEQ ID NO:1-4中任一個的氨基酸序列。在一些實施方案中,所述HPV抗原包含具有與SEQ ID NO:18-25中任一個至少90%相似性的氨基酸序列。在一些實施方案中,所述HPV抗原包含具有與SEQ ID NO:19至少90%相似性的氨基酸序列。在一些實施方案中,所述HPV抗原包含具有與SEQ ID NO:23至少90%相似性的氨基酸序列。在一些實施方案中,所述HPV抗原包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一個優選的實施方案中,所述HPV抗原由SEQ ID NO:19的氨基酸序列組成。在一些實施方案中,所述HPV抗原包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一個優選的實施方案中,所述HPV抗原由SEQ ID NO:23的氨基酸序列組成。在一些實施方案中,所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任一個的氨基酸序列。在一些實施方案中,所述抗原是包含SEQ ID NO:18-25中任一個的氨基酸序列中的至少一個的多種抗原。在一些實施方案中,所述抗原是包含SEQ ID NO 18-25中任一個的氨基酸序列中的2、3、4、5、6、7或8個的多種抗原。在一些實施方案中,所述抗原是包含具有與SEQ ID NO:19至少90%相似性的氨基酸序列和具有與SEQ ID NO:23至少90%相似性的氨基酸序列的多種抗原。在一個優選的實施方案中,所述抗原是包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列和SEQ ID NO:23的氨基酸序列的多種抗原。在一些實施方案中,所述多種抗原包含在非共價連接的肽的集合內。在一些實施方案中,所述多種抗原包含在非共價連接的肽的集合內,其中每種肽包含不超過一種抗原。在一些實施方案中,所述多種抗原包含在非共價連接的肽的集合內,其中SEQ ID NO:19的氨基酸序列和SEQ ID NO:23的氨基酸序列包含在單獨的肽內。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含含有多個免疫原性表位的多種抗原。在進一步的實施方案中,在向個體施用包含含有所述多種免疫原性表位的所述多種抗原的所述經修飾的PBMC之后,所述多種免疫原性表位都不降低所述個體對任何其他免疫原性表位的免疫應答。在一些實施方案中,所述抗原是多肽并且所述免疫原性表位是免疫原性肽表位。在一些實施方案中,所述免疫原性肽表位與N末端側翼多肽和/或C末端側翼多肽融合。在一些實施方案中,所述抗原是包含免疫原性肽表位和一個或多個異源肽序列的多肽。在一些實施方案中,所述抗原是包含免疫原性肽表位的多肽,所述免疫原性肽表位在N末端和/或C末端側接異源肽序列。在一些實施方案中,所述側翼異源肽序列源自疾病相關免疫原性肽。在一些實施方案中,所述側翼異源肽序列是非天然存在的序列。在一些實施方案中,所述側翼異源肽序列源自免疫原性合成長肽(SLP)。在一些實施方案中,所述N末端側翼多肽包含SEQ ID NO:5-10中任一個的氨基酸序列和/或所述C末端側翼多肽包含SEQ ID NO:11-17中任一個的氨基酸序列。在一些實施方案中,所述抗原能夠被加工為MHC I類限制性肽和/或MHC II類限制性肽。

佐劑

如本文所用,術語“佐劑”可以是指直接或間接調節和/或引起免疫應答的物質。在本發明的一些實施方案中,將佐劑用于調理PBMC群體(即,在施用至個體之前將所述PBMC與佐劑一起孵育)。在一些情況下,將所述佐劑與抗原結合施用,以實現如與單獨的抗原相比,針對所述抗原的免疫應答的增強。因此,佐劑可以用于加強對針對抗原的免疫細胞應答(例如,T細胞應答)的引發。在一些實施方案中,本發明提供了被修飾為在細胞內包含抗原(諸如HPV抗原)并且在細胞內包含佐劑的PBMC。在一些實施方案中,將如本文所述擾動的PBMC與所述抗原和佐劑兩者一起孵育。示例性佐劑包括但不限于干擾素基因刺激因子(STING)激動劑,視黃酸誘導基因I(RIG-I)激動劑,以及針對TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9的激動劑。示例性佐劑包括但不限于CpG ODN、干擾素-α(IFN-α)、聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)、咪喹莫特(R837)、瑞喹莫德(R848)或脂多糖(LPS)。在一些實施方案中,所述佐劑是CpG ODN、LPS、IFN-α、STING激動劑、RIG-I激動劑、聚I:C、R837、R848、TLR3激動劑、TLR4激動劑或TLR 9激動劑。在具體實施方案中,所述佐劑是CpG ODN。在一些實施方案中,所述佐劑是CpG ODN。在一些實施方案中,所述CpG ODN是A類CpG ODN、B類CpG ODN或C類CpG ODN。在一些實施方案中,所述CpG ODN佐劑包含來自以下的組的選擇:CpG ODN 1018、CpG ODN 1585、CpG ODN 2216、CpG ODN 2336、CpG ODN 1668、CpG ODN 1826、CPG ODN 2006、CpG ODN2007、CpG ODN BW006、CpG ODN D-SL01、CpG ODN 2395、CpG ODN M362、CpG ODN D-SL03。在一些實施方案中,所述CpG ODN佐劑是CpG ODN 1826(TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO:30))或CpG ODN2006(也稱為CpG ODN 7909)(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:31))寡核苷酸。在一些實施方案中,所述佐劑是CpG 7909。在一些實施方案中,所述RIG-I激動劑包含聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)。還可以結合抗原使用多種佐劑以增強免疫應答的引發。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含多于一種佐劑。還可以結合抗原使用多種佐劑以增強免疫應答的引發。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含多于一種佐劑。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含佐劑CpG ODN、LPS、IFN-α、STING激動劑、RIG-I激動劑、聚I:C、R837、R848、TLR3激動劑、TLR4激動劑或TLR 9激動劑的任何組合。

在本文描述的任何實施方案中,除非另有指示,否則佐劑可以是指(a)與擾動的輸入PBMC一起孵育并通過所述擾動的輸入PBMC的佐劑,(b)與PBMC一起孵育以調理PBMC的佐劑,(c)與經修飾的PBMC共同施用至個體的佐劑。

在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的佐劑的濃度在約0.01μM與約10mM之間。例如,在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的佐劑的濃度是以下中的任一個:小于約0.01μM、約0.1μM、約1μM、約10μM、約100μM、約1mM或約10mM。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的佐劑的濃度大于約10mM。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的佐劑的濃度是以下中的任一個:約0.01μM與約0.1μM之間、在約0.1μM與約1μM之間、在約1μM與約10μM之間、在約10μM與約100μM之間、在約100μM與約1mM之間或在1mM與約10mM之間。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的佐劑的濃度在約0.1μM與約1mM之間。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的佐劑的濃度在約0.1μM與約10μM之間。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的佐劑的濃度是1μM。

在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的抗原的濃度在約0.01μM與約10mM之間。例如,在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的抗原的濃度是以下中的任一個:小于約0.01μM、約0.1μM、約1μM、約10μM、約100μM、約1mM或約10mM。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的抗原的濃度大于約10mM。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的抗原的濃度是以下中的任一個:在約0.01μM與約0.1μM之間、在約0.1μM與約1μM之間、在約1μM與約10μM之間、在約10μM與約100μM之間、在約100μM與約1mM之間或在1mM與約10mM之間。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的抗原的濃度在約0.1μM與約1mM之間。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的抗原的濃度在約0.1μM與約10μM之間。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的抗原的濃度是1μM。

在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的抗原與佐劑的摩爾比是在約10000:1至約1:10000之間的任一個。例如,在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的抗原與佐劑的摩爾比是約以下中的任一個:10000:1、約1000:1、約100:1、約10:1、約1:1、約1:10、約1:100、約1:1000或約1:10000。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的抗原與佐劑的摩爾比是以下中的任一個:在約10000:1與約1000:1之間、在約1000:1與約100:1之間、在約100:1與約10:1之間、在約10:1與約1:1之間、在約1:1與約1:10之間、在約1:10與約1:100之間、在約1:100與約1:1000之間、在約1:1000與約1:10000之間。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的抗原與佐劑的摩爾比是約200:1。在一些實施方案中,與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的抗原與佐劑的摩爾比是約20:1。

在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含濃度在約1nM與約1mM之間的所述佐劑。例如,在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含濃度為以下中的任一個的所述佐劑:小于約0.01μM、約0.1μM、約1μM、約10μM、約100μM、約1mM或約10mM。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含濃度大于約10mM中的任一個的所述佐劑。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含濃度為以下中的任一個的所述佐劑:在約1nM至約10nM、約0.1μM與約1μM之間、在約1μM與約10μM之間、在約10μM與約100μM之間、在約100μM與約1mM或在1mM與約10mM之間。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含濃度在約0.1μM與約1mM之間的所述佐劑。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含濃度為約1μM的所述佐劑。

在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含濃度在約1nM與約1mM之間的所述抗原。例如,在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含濃度為以下中的任一個的所述抗原:小于約0.01μM、約0.1μM、約1μM、約10μM、約100μM、約1mM或約10mM。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含濃度大于約10mM的所述抗原。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含濃度為以下中的任一個的所述抗原:在約1nM至約10nM、約0.1μM與約1μM之間、在約1μM與約10μM之間、在約10μM與約100μM之間、在約100μM與約1mM或在1mM與約10mM之間。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含濃度在約0.1μM與約1mM之間的所述抗原。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含濃度為約1μM的所述抗原。

在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含濃度在約1nM與約1mM之間的編碼所述抗原的核酸。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含濃度為以下中的任一個的編碼所述抗原的核酸:小于約0.1nM、約1nM、約0.01μM、約0.1μM、約1μM、約10μM、約100μM、約1mM或約10mM。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含濃度大于約10mM的編碼所述抗原的核酸。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含濃度為以下中的任一個的編碼所述抗原的核酸:在約0.1nM至約1nM、約1nM至約10nM、約10nM至約100nM之間、在約0.1μM與約1μM之間、在約1μM與約10μM之間、在約10μM與約100μM之間、在約100μM與約1mM或在1mM與約10mM之間。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含濃度在約10nM與約100nM之間的編碼所述抗原的核酸。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含濃度在約1nM與約10nM之間的編碼所述抗原的核酸。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含濃度為約50nM的所述抗原。在一些實施方案中,所述核酸是mRNA。

在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含濃度在約0.01μg/mL至約10mg/mL之間的編碼所述抗原的核酸。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含濃度為以下中的任一個的編碼所述抗原的核酸:小于約0.01μg/mL、約0.1μg/mL、約1μg/mL、約10μg/mL、約100μg/mL、約1mg/mL或約10mg/mL。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含濃度大于約10μg/mL的編碼所述抗原的核酸。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含濃度為以下中的任一個的編碼所述抗原的核酸:在約0.001μg/mL至約0.1μg/mL、約0.1μg/mL與約1μg/mL之間、在約1μg/mL與約10μg/mL之間、在約10μg/mL與約100μg/mL之間、在約100μg/mL與約1mg/mL之間或在1mg/mL與約10mg/mL之間。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含濃度在約0.1μg/mL與約1mg/mL之間的編碼所述抗原的核酸。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含濃度為以下中的任一個的所述抗原:約1μg/mL、約2μg/mL、約5μg/mL、約10μg/mL、約20μg/mL、約25mg/mL、約40μg/mL、約50μg/mL、約70μg/mL、約100μg/mL、約200μg/mL或約300μg/mL或約500μg/mL。在一些實施方案中,所述核酸是mRNA。

在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC中抗原與佐劑的摩爾比是在約10000:1至約1:10000之間的任一個。例如,在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC中抗原與佐劑的摩爾比是約以下中的任一個:10000:1、約1000:1、約100:1、約10:1、約1:1、約1:10、約1:100、約1:1000或約1:10000。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC中抗原與佐劑的摩爾比是以下中的任一個:在約10000:1與約1000:1之間、在約1000:1與約100:1之間、在約100:1與約10:1之間、在約10:1與約1:1之間、在約1:1與約1:10之間、在約1:10與約1:100之間、在約1:100與約1:1000之間、在約1:1000與約1:10000之間。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC中抗原與佐劑的摩爾比是約200:1。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC中抗原與佐劑的摩爾比是約20:1。

在一些實施方案中,所述抗原與其自身、與其他抗原或與所述佐劑復合。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含復合物,所述復合物包含:a)所述抗原,b)所述抗原和至少一種其他抗原,和/或c)所述抗原和所述佐劑。

PBMC特征的進一步修飾

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述多種經修飾的PBMC還包含如下藥劑,與不包含所述藥劑的相應多種經修飾的PBMC相比,所述藥劑增強所述經修飾的PBMC的活力和/或功能。在一些實施方案中,所述多種經修飾的PBMC還包含如下藥劑,與不包含所述藥劑的相應多種經修飾的PBMC相比,所述藥劑在凍-融循環后增強所述經修飾的PBMC的活力和/或功能。在一些實施方案中,所述藥劑是冷凍保存劑和/或低溫保存劑。在一些實施方案中,在任何凍-融循環之前,與不包含所述藥劑的相應多種PBMC相比,冷凍保存劑或低溫保存劑均不會引起包含所述藥劑的多種PBMC中超過10%或20%的細胞死亡。在一些實施方案中,在多達1、2、3、4、5個凍-融循環之后,至少約70%、約80%或約90%的所述多種經修飾的PBMC是有活力的。在一些實施方案中,所述藥劑是增強內吞作用的化合物、穩定劑或輔助因子。在一些實施方案中,所述藥劑是白蛋白。在一些實施方案中,所述白蛋白是小鼠、?;蛉税椎鞍?。在一些實施方案中,所述藥劑是人白蛋白。在一些實施方案中,所述藥劑是以下中的一種或多種:二價金屬陽離子、葡萄糖、ATP、鉀、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精氨酸、L-谷氨酰胺或EDTA。在一些實施方案中,所述二價金屬陽離子是Mg2+、Zn2+或Ca2+中的一種或多種。在一些實施方案中,所述藥劑是以下中的一種或多種:丙酮酸鈉、腺嘌呤、海藻糖、右旋糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、DMSO、HEPES、甘油、谷胱甘肽、肌苷、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鈉金屬離子、鉀金屬離子、鎂金屬離子、氯化物、乙酸鹽、葡糖酸鹽、蔗糖、氫氧化鉀或氫氧化鈉。在一些實施方案中,所述藥劑是以下中的一種或多種:丙酮酸鈉、腺嘌呤、海藻糖、右旋糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、DMSO、CS2、CS5、CS10、CS15、HEPES、甘油、谷胱甘肽、

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,將所述經修飾的PBMC進一步修飾以增加一種或多種共刺激分子的表達。在一些實施方案中,所述共刺激分子是B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。在一些實施方案中,所述多種經修飾的PBMC包含導致所述一種或多種共刺激分子的表達增加的核酸。在一些實施方案中,所述多種經修飾的PBMC包含導致所述一種或多種共刺激分子的表達增加的mRNA。在一些實施方案中,所述共刺激分子是在刺激T細胞激活中的信號2效應子。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,將所述經修飾的PBMC進一步修飾以增加一種或多種細胞因子的表達。在一些實施方案中,所述細胞因子是IL-2、IL-12、IL-21或IFNα2中的一種或多種。在一些實施方案中,所述多種經修飾的PBMC包含導致所述一種或多種細胞因子的表達和/或分泌增加的核酸。在一些實施方案中,所述細胞因子是在刺激T細胞激活中的信號3效應子。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述多種經修飾的PBMC中的至少一種細胞對于HLA-A2的表達是陽性的。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含進一步修飾以調節MHC I類表達。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含進一步修飾以調節HLA-A02I類MHC的表達。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC包含進一步修飾以調節MHC II類表達。在一些實施方案中,與響應于在同種異體背景下施用不包含所述進一步修飾的相應經修飾的PBMC而在個體中產生的先天性免疫應答相比,響應于在同種異體背景下施用所述經修飾的PBMC而在個體中產生的先天性免疫應答降低。在一些實施方案中,與不包含所述進一步修飾的相應經修飾的PBMC在其施用的個體中的循環半衰期相比,所述經修飾的PBMC在其施用的個體中的循環半衰期增加。在一些實施方案中,與不包含所述進一步修飾的相應經修飾的PBMC在其施用的個體中的循環半衰期相比,所述經修飾的PBMC在其施用的個體中的循環半衰期增加約以下中的任一個:10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多。在一些實施方案中,所述經修飾的PBMC在其施用的個體中的循環半衰期基本上與不包含所述進一步修飾的相應經修飾的PBMC在其施用的個體中的循環半衰期相同。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述方法還包括以下步驟:將所述輸入PBMC和/或所述經修飾的PBMC與如下藥劑一起孵育,與在沒有所述進一步孵育步驟的情況下制備的相應經修飾的PBMC相比,所述藥劑增強所述經修飾的PBMC的活力和/或功能。

PBMC的調理

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中;所述多種經修飾的PBMC是經調理的。在進一步的實施方案中,所述多種經修飾的PBMC是成熟化的。在一些實施方案中,在縮窄部介導的遞送之后調理所述多種PBMC。在一些實施方案中,將包含所述抗原和/或佐劑的所述多種經修飾的PBMC與第二佐劑一起孵育足夠的時間,以調理包含所述縮窄部遞送的抗原和/或佐劑的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原和/或所述佐劑的經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,在與所述第二佐劑一起孵育以調理所述經修飾的PBMC之前,從所述細胞懸浮液中分離出包含所述抗原和/或所述佐劑的所述多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,在縮窄部介導的遞送之后調理所述多種PBMC。在一些實施方案中,將包含所述縮窄部遞送的抗原和/或佐劑的所述多種經修飾的PBMC與第二佐劑一起孵育足夠的時間,以調理包含所述縮窄部遞送的抗原和/或佐劑的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原和/或所述佐劑的經調理的多種經修飾的PBMC。在一些方面,提供了包含抗原和/或佐劑的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原和/或所述佐劑通過以形成多種擾動的輸入PBMC;b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原和/或所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和/或所述佐劑的多種經修飾的PBMC;以及c)將包含所述縮窄部遞送的抗原和/或佐劑的所述多種經修飾的PBMC與第二佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述縮窄部遞送的抗原和/或佐劑的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原和/或所述佐劑的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述方法還包括在與所述第二佐劑一起孵育以調理所述經修飾的PBMC之前,從所述細胞懸浮液中分離出包含所述抗原和/或所述佐劑的所述多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述縮窄部遞送的佐劑與所述調理佐劑相同。在一些實施方案中,所述縮窄部遞送的佐劑不同于所述調理佐劑。

在一些實施方案中,與所述經修飾的PBMC一起孵育的抗原的濃度在約0.01μM與約10mM之間。例如,在一些實施方案中,與所述經修飾的PBMC一起孵育的抗原的濃度是以下中的任一個:小于約0.01μM、約0.1μM、約1μM、約10μM、約100μM、約1mM或約10mM。在一些實施方案中,與所述經修飾的PBMC一起孵育的抗原的濃度大于約10mM。在一些實施方案中,與所述經修飾的PBMC一起孵育的抗原的濃度是以下中的任一個:在約0.01μM與約0.1μM之間、在約0.1μM與約1μM之間、在約1μM與約10μM之間、在約10μM與約100μM之間、在約100μM與約1mM之間或在1mM與約10mM之間。在一些實施方案中,與所述經修飾的PBMC一起孵育的抗原的濃度在約0.1μM與約1mM之間。在一些實施方案中,與所述經修飾的PBMC一起孵育的抗原的濃度在約0.1μM與約10μM之間。在一些實施方案中,與所述經修飾的PBMC一起孵育的抗原的濃度是1μM。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,將所述多種經修飾的PBMC與所述佐劑一起孵育約1至約24小時以調理所述經修飾的PBMC。在一些實施方案中,將所述多種經修飾的PBMC與所述佐劑一起孵育約2至約10小時以調理所述經修飾的PBMC。在一些實施方案中,將所述多種經修飾的PBMC與所述佐劑一起孵育約3至約6小時以調理所述經修飾的PBMC。在一些實施方案中,將所述多種經修飾的PBMC與所述佐劑一起孵育以下中的任一個以調理所述經修飾的PBMC:約1小時、2小時、3小時、3.5小時、4小時、4.5小時、5小時、5.5小時、6小時、8小時、12小時、16小時、20小時或24小時。在一些實施方案中,將所述多種經修飾的PBMC與所述佐劑一起孵育約4小時以調理所述經修飾的PBMC。

在一些實施方案中,在縮窄部介導的遞送之前調理所述多種PBMC。在一些實施方案中,將所述多種輸入PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述輸入PBMC,從而產生經調理的多種輸入PBMC。在一些實施方案中,提供了包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)將多種輸入PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述輸入PBMC,從而產生經調理的多種輸入PBMC;b)使包含所述經調理的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成經調理的多種擾動的輸入PBMC;以及c)將所述經調理的多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述方法還包括在使所述經調理的多種輸入PBMC通過細胞變形縮窄部之前,將所述經調理的多種輸入PBMC與所述調理佐劑分離。在一些實施方案中,提供了包含抗原和/或佐劑的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:a)將多種輸入PBMC與調理佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述輸入PBMC,從而產生經調理的多種輸入PBMC;b)使包含所述經調理的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原和/或所述佐劑通過以形成經調理的多種擾動的輸入PBMC;以及c)將所述經調理的多種擾動的輸入PBMC與所述抗原和/或所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原和/或所述佐劑進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和/或所述佐劑的所述經調理的多種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述方法還包括在使所述經調理的多種輸入PBMC通過細胞變形縮窄部之前,將所述經調理的多種輸入PBMC與所述調理佐劑分離。在一些實施方案中,所述縮窄部遞送的佐劑與所述調理佐劑相同。在一些實施方案中,所述縮窄部遞送的佐劑不同于所述調理佐劑。

在一些實施方案中,與輸入PBMC一起孵育的抗原的濃度在約0.01μM與約10mM之間。例如,在一些實施方案中,與所述輸入PBMC一起孵育的抗原的濃度是以下中的任一個:小于約0.01μM、約0.1μM、約1μM、約10μM、約100μM、約1mM或約10mM。在一些實施方案中,與輸入PBMC一起孵育的抗原的濃度大于約10mM。在一些實施方案中,與所述輸入PBMC一起孵育的抗原的濃度是以下中的任一個:在約0.01μM與約0.1μM之間、在約0.1μM與約1μM之間、在約1μM與約10μM之間、在約10μM與約100μM之間、在約100μM與約1mM之間或在1mM與約10mM之間。在一些實施方案中,與輸入PBMC一起孵育的抗原的濃度在約0.1μM與約1mM之間。在一些實施方案中,與輸入PBMC一起孵育的抗原的濃度在約0.1μM與約10μM之間。在一些實施方案中,與輸入PBMC一起孵育的抗原的濃度是1μM。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,將所述多種輸入PBMC與所述佐劑一起孵育約1至約24小時以調理所述輸入PBMC。在一些實施方案中,將多種輸入PBMC與佐劑一起孵育約2至約10小時以調理所述輸入PBMC。在一些實施方案中,將多種輸入PBMC與佐劑一起孵育約3至約6小時以調理所述輸入PBMC。在一些實施方案中,將所述多種輸入PBMC與所述佐劑一起孵育以下中的任一個以調理所述輸入PBMC:約1小時、2小時、3小時、3.5小時、4小時、4.5小時、5小時、5.5小時、6小時、8小時、12小時、16小時、20小時或24小時。在一些實施方案中,將所述多種輸入PBMC與所述佐劑一起孵育約4小時以調理所述輸入PBMC。

在一些實施方案中,提供了包含抗原的經調理的多種PBMC,其通過以下方式制備:將包含所述抗原的所述多種PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種PBMC。在一些實施方案中,提供了包含抗原的經調理的多種PBMC,其通過以下方式制備:將所述多種PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述PBMC,然后將所述抗原引入所述PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種PBMC。

在根據上文描述的方法、組合物或多種PBMC中的任一種的一些實施方案中,與所述PBMC一起孵育的抗原的濃度在約0.01μM與約10mM之間。例如,在一些實施方案中,與所述PBMC一起孵育的抗原的濃度是以下中的任一個:小于約0.01μM、約0.1μM、約1μM、約10μM、約100μM、約1mM或約10mM。在一些實施方案中,與PBMC一起孵育的抗原的濃度大于約10mM。在一些實施方案中,與所述PBMC一起孵育的抗原的濃度是以下中的任一個:在約0.01μM與約0.1μM之間、在約0.1μM與約1μM之間、在約1μM與約10μM之間、在約10μM與約100μM之間、在約100μM與約1mM之間或在1mM與約10mM之間。在一些實施方案中,與PBMC一起孵育的抗原的濃度在約0.1μM與約1mM之間。在一些實施方案中,與PBMC一起孵育的抗原的濃度在約0.1μM與約10μM之間。在一些實施方案中,與PBMC一起孵育的抗原的濃度是1μM。

在根據本文描述的經調理的多種PBMC中的任一種的一些實施方案中,將所述多種PBMC與所述佐劑一起孵育約1至約24小時以調理所述PBMC。在一些實施方案中,將多種PBMC與佐劑一起孵育約2至約10小時以調理所述PBMC。在一些實施方案中,將多種PBMC與佐劑一起孵育約3至約6小時以調理所述PBMC。在一些實施方案中,將所述多種PBMC與所述佐劑一起孵育以下中的任一個以調理所述PBMC:約1小時、2小時、3小時、3.5小時、4小時、4.5小時、5小時、5.5小時、6小時、8小時、12小時、16小時、20小時或24小時。在一些實施方案中,將多種PBMC與佐劑一起孵育約4小時以調理所述PBMC。

在根據本文描述的經調理的多種PBMC中的任一種的一些實施方案中,與未經調理的多種經修飾的PBMC相比,所述經調理的多種經修飾的PBMC中一種或多種共刺激分子被上調。在一些實施方案中,與未經調理的多種經修飾的PBMC中的細胞亞群相比,所述經調理的多種經修飾的PBMC中的細胞亞群中一種或多種共刺激分子被上調。在一些實施方案中,與未經調理的多種經修飾的PBMC中的B細胞相比,所述經調理的多種經修飾的PBMC的B細胞中一種或多種共刺激分子被上調。在一些實施方案中,所述共刺激分子是CD80和/或CD86。在一些實施方案中,所述共刺激分子是CD86。在一些實施方案中,與未經調理的多種經修飾的PBMC中的B細胞相比,所述經調理的多種經修飾的PBMC的B細胞中CD80和/或CD86被上調超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。在一些實施方案中,與未經調理的多種經修飾的PBMC中的B細胞相比,所述經調理的多種經修飾的PBMC的B細胞中CD80和/或CD86被上調以下中的任一個:約1.2倍至約1.5倍、約1.5倍至約1.8倍、約1.8倍至約2倍、約2倍至約3倍、約3倍至約4倍、約4倍至約5倍、約5倍至約8倍、約8倍至約10倍、約10倍至約20倍、約20倍至約50倍、約50倍至約100倍、約100倍至約200倍、約200倍至約500倍或超過約500倍。在一些實施方案中,與未經調理的多種經修飾的PBMC相比,所述經調理的多種經修飾的PBMC中IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一種或多種的表達增加。在一些實施方案中,與未經調理的多種經修飾的PBMC中的細胞亞群相比,所述經調理的多種細胞中的細胞亞群中IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一種或多種的表達增加。在一些實施方案中,與未經調理的多種經修飾的PBMC相比,所述經調理的多種經修飾的PBMC中IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一種或多種的表達增加約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。在一些實施方案中,與未經調理的多種經修飾的PBMC相比,所述經調理的多種經修飾的PBMC中IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一種或多種的表達增加以下中的任一個:約1.2倍至約1.5倍、約1.5倍至約1.8倍、約1.8倍至約2倍、約2倍至約3倍、約3倍至約4倍、約4倍至約5倍、約5倍至約8倍、約8倍至約10倍、約10倍至約20倍、約20倍至約50倍、約50倍至約100倍、約100倍至約200倍、約200倍至約500倍或超過約500倍。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述多種PBMC包含編碼抗原的核酸。在一些實施方案中,所述多種PBMC包含編碼抗原的mRNA。

微流體系統及其部件

用于提供細胞變形縮窄部的微流體通道

在一些實施方案中,本發明提供了用于通過使包含PBMC的細胞懸浮液通過所述縮窄部來調節免疫應答的方法,其中所述縮窄部使所述P BMC變形,從而引起所述PBMC的擾動,使得抗原和/或佐劑進入所述PBMC,其中所述縮窄部包含在微流體通道內。在一些實施方案中,可以在所述微流體通道內平行和/或串聯放置多個縮窄部。用于在本文公開的方法中使用的含有細胞變形縮窄部的示例性微流體通道描述于WO 2013059343中。用于在本文公開的方法中使用的具有孔的示例性表面描述于WO 2017041050中。

在一些實施方案中,所述微流體通道包括內腔并且被配置使得懸浮于緩沖液中的PBMC可以通過,其中所述微流體通道包括縮窄部。所述微流體通道可以由多種材料中的任一種制成,所述材料包括硅、金屬(例如,不銹鋼)、塑料(例如,聚苯乙烯)、陶瓷、玻璃、晶體襯底、無定形襯底或聚合物(例如,聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、PDMS、環烯烴共聚物(COC)等)。所述微流體通道的制造可通過本領域已知的任何方法進行,所述方法包括干法蝕刻、濕法蝕刻、光刻、注射模制、激光燒蝕或SU-8掩模。

在一些實施方案中,所述微流體通道內的所述縮窄部包括入口部分、中心點和出口部分。在一些實施方案中,所述微流體通道內的所述縮窄部的長度、深度和寬度可以變化。在一些實施方案中,所述微流體通道內的所述縮窄部的直徑隨輸入PBMC的直徑而變化。確定PBMC的直徑的方法在本領域中是已知的;例如,高內涵成像、細胞計數器或流式細胞術。在一些實施方案中,所述微流體通道內的所述縮窄部的直徑是多種輸入PBMC的平均直徑的約20%至約99%。在一些實施方案中,縮窄部大小是PBMC的平均直徑或PBMC的亞群的平均直徑的約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約99%。在一些實施方案中,縮窄部大小是所述多種輸入PBMC的最小橫截面距離均值的約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約99%。在一些實施方案中,所述通道包括在約2μm與約10μm之間或為其間的任何寬度或寬度范圍的縮窄部寬度。在一些實施方案中,所述通道包括在約3μm與約10μm之間的縮窄部寬度。在一些實施方案中,所述通道包括在約3μm與約6μm之間的縮窄部寬度。在一些實施方案中,所述通道包括在約4.2μm與約4.8μm之間的縮窄部寬度。例如,縮窄部寬度可以是以下中的一個:約2μm、約2.5μm、約3μm、約3.5μm、約4μm、約4.5μm、約5μm、約5.5μm、約6μm、約6.5μm或約7μm。在一些實施方案中,所述通道包含約10μm的縮窄部長度和約3.5μm的縮窄部寬度。在一些實施方案中,所述通道包含約10μm的縮窄部長度和約4μm的縮窄部寬度。在一些實施方案中,所述通道包含約10μm的縮窄部長度和約4.5μm的縮窄部寬度。所述通道的橫截面、入口部分、中心點和出口部分也可以變化。例如,橫截面的形狀可以是環形、橢圓形、細長狹縫、正方形、六邊形或三角形。入口部分限定縮窄部角度,其中所述縮窄部角度被優化以減少通道的堵塞并且被優化用于增強化合物向所述PBMC中的遞送。出口部分的角度也可以變化。例如,出口部分的角度被配置成減小可導致非層流的湍流的可能性。在一些實施方案中,入口部分和/或出口部分的壁是線性的。在其他實施方案中,入口部分和/或出口部分的壁是彎曲的。

用于提供細胞變形縮窄部的具有孔的表面

在一些實施方案中,本發明提供了用于通過使包含多種PBMC的細胞懸浮液通過所述縮窄部來調節免疫應答的方法,其中所述縮窄部使所述PBMC變形,從而引起所述PBMC的擾動,使得抗原和/或佐劑進入所述PBMC,其中所述縮窄部是孔或包含在孔內。在一些實施方案中,孔被包含在表面中。用于在本文公開的方法中使用的具有孔的示例性表面描述于WO2017041050中。

如本文公開的表面可以由許多材料中的任一種制成,并且采取多種形式中的任一種。在一些實施方案中,表面是過濾器。在一些實施方案中,表面是膜。在一些實施方案中,過濾器是切向流動過濾器。在一些實施方案中,表面是海綿或海綿狀基質。在一些實施方案中,表面是基質。

在一些實施方案中,表面是曲折路徑表面。在一些實施方案中,曲折路徑表面包含醋酸纖維素。在一些實施方案中,表面包含選自但不限于以下的材料:合成或天然的聚合物、聚碳酸酯、硅、玻璃、金屬、合金、硝酸纖維素、銀、醋酸纖維素、尼龍、聚酯、聚醚砜、聚丙烯腈(PAN)、聚丙烯、PVDF、聚四氟乙烯、混合的纖維素酯、瓷和陶瓷。

本文公開的表面可以具有本領域已知的任何形狀;例如3維形狀。表面的2維形狀可以是但不限于環形、橢圓形、圓形、方形、星形、三角形、多邊形、五邊形、六邊形、七邊形或八邊形。在一些實施方案中,表面的形狀是圓形的。在一些實施方案中,表面的3維形狀是圓柱形、圓錐形或立方形。

表面可以具有各種橫截面寬度和厚度。在一些實施方案中,表面橫截面寬度是在約1mm與約1m之間或其間的任何橫截面寬度或橫截面寬度范圍。在一些實施方案中,表面具有限定的厚度。在一些實施方案中,表面厚度是均一的。在一些實施方案中,表面厚度是可變的。例如,在一些實施方案中,表面的一些部分比表面的其他部分更厚或更薄。在一些實施方案中,表面厚度變化約1%至約90%或其間的任何百分比或百分比范圍。在一些實施方案中,表面的厚度是在約0.01μm至約5mm之間或其間的任何厚度或厚度范圍。

孔通道的入口和出口可以具有各種角度??捉嵌瓤梢员贿x擇為使在PBMC穿過時所述孔的堵塞最小化。在一些實施方案中,通過表面的流速是在約0.001mL/cm2/s至約100L/cm2/s之間或其間的任何速率或速率范圍。例如,入口或出口部分的角度可以在約0度與約90度之間。在一些實施方案中,入口或出口部分可以大于90度。在一些實施方案中,所述孔具有相同的入口角度和出口角度。在一些實施方案中,所述孔具有不同的入口角度和出口角度。在一些實施方案中,所述孔邊緣是平滑的,例如圓形的或彎曲的。光滑的孔邊緣具有連續、平坦且均勻的表面,沒有隆起、脊狀物或不均勻的部分。在一些實施方案中,孔邊緣是尖銳的。尖銳的孔邊緣具有尖的或呈銳角的薄邊緣。在一些實施方案中,孔通道是直的。直的孔通道不含有彎曲處、曲部、角度或其他不規則性。在一些實施方案中,孔通道是彎曲的。彎曲的孔通道是彎的或偏離直線。在一些實施方案中,孔通道具有多個彎曲處,例如約2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個彎曲處。

所述孔可以具有本領域已知的任何形狀,包括2維或3維形狀??椎男螤?例如,橫截面形狀)可以是但不限于環形、橢圓形、圓形、方形、星形、三角形、多邊形、五邊形、六邊形、七邊形和八邊形。在一些實施方案中,所述孔的橫截面的形狀為圓形。在一些實施方案中,所述孔的3維形狀是圓柱形或圓錐形。在一些實施方案中,孔具有帶凹槽的入口和出口形狀。在一些實施方案中,孔形狀在給定表面內的孔之間是均勻的(即一致的或規則的)。在一些實施方案中,孔形狀在給定表面內的孔之間是不均勻的(即混合的或變化的)。

本文所述的表面可以具有一系列總孔數量。在一些實施方案中,孔涵蓋總表面積的約10%至約80%。在一些實施方案中,表面含有約1.0x105至約1.0x1030個總孔或其間的任何數量或數量范圍。在一些實施方案中,表面包含約10與約1.0x1015個孔/mm2表面積之間。

孔可以在給定表面內以多種方式分布。在一些實施方案中,孔在給定表面內平行分布。在一個這種例子中,孔在給定表面內在同一方向上并排分布并且相隔相同距離。在一些實施方案中,孔分布是有序的或均勻的。在一個這種例子中,孔在給定表面內以規則的系統的模式分布,或者相隔相同距離。在一些實施方案中,孔分布是隨機的或不均勻的。在一個這種例子中,孔在給定表面內以不規則的無序模式分布,或者相隔不同距離。在一些實施方案中,多個表面串聯分布。所述多個表面的表面大小、形狀和/或粗糙度可以是均勻的或不均勻的。所述多個表面還可以含有具有均勻或不均勻孔大小、形狀和/或數量的孔,從而使得能夠將一系列化合物同時遞送至不同的PBMC類型中。

在一些實施方案中,單獨的孔具有均勻的寬度尺寸(即,沿著孔通道的長度恒定的寬度)。在一些實施方案中,單獨的孔具有可變的寬度(即,沿著孔通道的長度增大或減小寬度)。在一些實施方案中,在給定表面內的孔具有相同的單獨的孔深度。在一些實施方案中,在給定表面內的孔具有不同的單獨的孔深度。在一些實施方案中,所述孔彼此之間緊鄰。在一些實施方案中,所述孔彼此隔開一定距離。在一些實施方案中,所述孔彼此隔開約0.001μm至約30mm的距離或其間的任何距離或距離范圍。

在一些實施方案中,表面涂覆有材料。所述材料可以選自本領域已知的任何材料,包括但不限于特氟隆(Teflon)、粘合劑涂層、表面活性劑、蛋白質、粘附分子、抗體、抗凝血劑、調節細胞功能的因子、核酸、脂質、碳水化合物或跨膜蛋白。在一些實施方案中,表面涂覆有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在一些實施方案中,所述材料共價附接至所述表面。在一些實施方案中,所述材料非共價附接或吸附于表面。在一些實施方案中,表面分子在所述PBMC通過所述孔時被釋放。

在一些實施方案中,表面具有經修飾的化學特性。在一些實施方案中,表面是極性的。在一些實施方案中,表面是親水的。在一些實施方案中,表面是非極性的。在一些實施方案中,表面是疏水的。在一些實施方案中,表面是帶電的。在一些實施方案中,表面帶正電和/或帶負電。在一些實施方案中,表面可以在一些區域帶正電并在其他區域帶負電。在一些實施方案中,表面具有總體正電荷或總體負電荷。在一些實施方案中,表面可以是光滑的、電解拋光的、粗糙的或經等離子體處理中的任一種。在一些實施方案中,表面包含兩性離子或偶極化合物。在一些實施方案中,表面是經等離子體處理的。

在一些實施方案中,表面包含在較大的模塊內。在一些實施方案中,表面包含在注射器(諸如塑料或玻璃注射器)內。在一些實施方案中,表面包含在塑料過濾器支架內。在一些實施方案中,表面包含在移液管尖端內。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述一種或多種核酸被攜帶在一種或多種媒介物中,其中所述一種或多種媒介物被遞送至所述輸入PBMC。在一些實施方案中,所述媒介物是病毒或病毒相關顆粒。在一些實施方案中,所述病毒包含以下中的一種或多種:腺病毒、腺相關病毒(AAV)、桿狀病毒、皰疹病毒或逆轉錄病毒。在一些實施方案中,所述病毒包括AAV。在一些實施方案中,所述媒介物是基于脂質的媒介物,例如脂質體。在一些實施方案中,所述媒介物是納米顆粒。

細胞擾動

在一些實施方案中,本發明提供了用于通過使包含PBMC的細胞懸浮液通過所述縮窄部來調節免疫應答的方法,其中所述縮窄部使所述PBMC變形,從而引起所述PBMC的擾動,使得抗原和/或佐劑進入所述PBMC,其中所述PBMC中的擾動是所述PBMC中的缺口,所述缺口允許材料從所述PBMC的外部移動到所述PBMC中(例如,洞、裂縫、空腔、孔口、孔、斷裂、間隙、穿孔)。變形可以由例如機械應變和/或機械應變和剪切力引起。在一些實施方案中,所述擾動是PBMC細胞膜內的擾動。在一些實施方案中,所述擾動是瞬時的。在一些實施方案中,所述PBMC擾動持續約1.0x10-9秒至約2小時或其間的任何時間或時間范圍。在一些實施方案中,所述PBMC擾動持續約1.0x10-9秒至約1秒、約1秒至約1分鐘或約1分鐘至約1小時。在一些實施方案中,所述PBMC擾動持續以下中的任一個之間:約1.0x10-9至約1.0x10-1、約1.0x10-9至約1.0x10-2、約1.0x10-9至約1.0x10-3、約1.0x10-9至約1.0x10-4、約1.0x10-9至約1.0x10-5、約1.0x10-9至約1.0x10-6、約1.0x10-9至約1.0x10-7或約1.0x10-9至約1.0x10-8秒。在一些實施方案中,所述PBMC擾動持續以下中的任一個:約1.0x10-8至約1.0x10-1、約1.0x10-7至約1.0x10-1、約1.0x10-6至約1.0x10-1、約1.0x10-5至約1.0x10-1、約1.0x10-4至約1.0x10-1、約1.0x10-3至約1.0x10-1或約1.0x10-2至約1.0x10-1秒。通過本文描述的方法產生的PBMC擾動(例如,孔或洞)不是由于蛋白質亞基組裝形成多聚體孔結構(諸如由補體或細菌溶血素產生的)而形成。

當所述PBMC通過所述縮窄部時,所述縮窄部暫時對PBMC膜造成損傷,從而允許材料通過擾動被動擴散。在一些實施方案中,使所述PBMC變形僅持續大約100μs的短暫時間段,以最小化通過細胞信號傳導機制激活凋亡途徑的機會,但是其他持續時間是可能的(例如,從數納秒至數小時的范圍)。在一些實施方案中,使所述PBMC變形持續約1.0x10-9秒至約2小時或其間的任何時間或時間范圍。在一些實施方案中,使所述PBMC變形持續約1.0x10-9至約1秒、約1秒至約1分鐘或約1分鐘至約1小時。在一些實施方案中,使所述PBMC變形持續以下中的任一個之間:約1.0x10-9至約1.0x10-1、約1.0x10-9至約1.0x10-2、約1.0x10-9至約1.0x10-3、約1.0x10-9至約1.0x10-4、約1.0x10-9至約1.0x10-5、約1.0x10-9至約1.0x10-6、約1.0x10-9至約1.0x10-7或約1.0x10-9至約1.0x10-8秒。在一些實施方案中,使所述PBMC變形持續以下中的任一個:約1.0x10-8至約1.0x10-1、約1.0x10-7至約1.0x10-1、約1.0x10-6至約1.0x10-1、約1.0x10-5至約1.0x10-1、約1.0x10-4至約1.0x10-1、約1.0x10-3至約1.0x10-1或約1.0x10-2至約1.0x10-1秒。在一些實施方案中,使所述PBMC變形包括使所述PBMC變形持續一段時間,所述時間的范圍是但不限于約1μs至至少約750μs,例如至少約1μs、10μs、50μs、100μs、500μs或750μs。

在一些實施方案中,所述抗原和/或佐劑穿過至所述PBMC中與所述PBMC通過所述縮窄部和/或所述PBMC的擾動同時發生。在一些實施方案中,所述化合物穿過至所述PBMC中發生在所述PBMC通過所述縮窄部之后。在一些實施方案中,所述化合物穿過至所述PBMC中發生在所述PBMC通過所述縮窄部之后大約幾分鐘。在一些實施方案中,所述化合物穿過至所述PBMC中發生在所述PBMC通過所述縮窄部之后約1.0x10-2秒至至少約30分鐘。例如,所述化合物穿過至所述PBMC中發生在所述PBMC通過所述縮窄部之后約1.0x10-2秒至約1秒、約1秒至約1分鐘或約1分鐘至約30分鐘。在一些實施方案中,所述化合物穿過至所述PBMC中發生在所述PBMC通過所述縮窄部之后約1.0x10-2秒至約10分鐘、約1.0x10-2秒至約5分鐘、約1.0x10-2秒至約1分鐘、約1.0x10-2秒至約30秒、約1.0x10-2秒至約10秒、約1.0x10-2秒至約1秒或約1.0x10-2秒至約0.1秒。在一些實施方案中,所述化合物穿過至所述PBMC中發生在所述PBMC通過所述縮窄部之后約1.0x10-1秒至約10分鐘、約1秒至約10分鐘、約10秒至約10分鐘、約50秒至約10分鐘、約1分鐘至約10分鐘或約5分鐘至約10分鐘。在一些實施方案中,所述PBMC中在其通過所述縮窄部之后的擾動在所述PBMC通過所述縮窄部之后大約五分鐘內被糾正。

在一些實施方案中,通過所述縮窄部之后的細胞活力是約5%至約100%。在一些實施方案中,通過所述縮窄部之后的細胞活力是至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。在一些實施方案中,在所述PBMC通過所述縮窄部之后約1.0x10-2秒至至少約10天測量細胞活力。例如,在所述PBMC通過所述縮窄部之后約1.0x10-2秒至約1秒、約1秒至約1分鐘、約1分鐘至約30分鐘或約30分鐘至約2小時測量細胞活力。在一些實施方案中,在所述PBMC通過所述縮窄部之后約1.0x10-2秒至約2小時、約1.0x10-2秒至約1小時、約1.0x10-2秒至約30分鐘、約1.0x10-2秒至約1分鐘、約1.0x10-2秒至約30秒、約1.0x10-2秒至約1秒或約1.0x10-2秒至約0.1秒測量細胞活力。在一些實施方案中,在所述PBMC通過所述縮窄部之后約1.5小時至約2小時、約1小時至約2小時、約30分鐘至約2小時、約15分鐘至約2小時、約1分鐘至約2小時、約30秒至約2小時或約1秒至約2小時測量細胞活力。在一些實施方案中,在所述PBMC通過所述縮窄部之后約2小時至約5小時、約5小時至約12小時、約12小時至約24小時或約24小時至約10天測量細胞活力。

遞送參數

許多參數可能影響通過本文描述的方法將化合物遞送至PBMC以供調節免疫應答。在一些實施方案中,細胞懸浮液在通過所述縮窄部之前、同時或之后與所述化合物接觸。所述PBMC可以通過懸浮于包含待遞送的化合物的溶液中的縮窄部,但是可以在所述PBMC通過所述縮窄部之后將所述化合物添加至所述細胞懸浮液中。在一些實施方案中,將待遞送的化合物涂覆在縮窄部上。

可能影響將所述化合物遞送至所述PBMC中的參數的例子包括但不限于縮窄部的尺寸、縮窄部的入口角度、縮窄部的表面特性(例如,粗糙度、化學修飾、親水性、疏水性等)、操作流速(例如,通過所述縮窄部的細胞傳輸時間)、PBMC濃度、細胞懸浮液中化合物的濃度,并且所述PBMC在通過所述縮窄部之后恢復或孵育的時間量可以影響將遞送的化合物穿過至所述PBMC中。影響將所述化合物遞送至所述PBMC中的另外參數可以包括所述PBMC在縮窄部中的速度、縮窄部中的剪切速率、細胞懸浮液的粘度、與流動速度垂直的速度分量以及在縮窄部中的時間。此外,串聯和/或平行的包括通道的多個芯片可能影響向PBMC的遞送。平行的多個芯片可能有用于提高通過量??梢栽O計此類參數以控制所述化合物的遞送。在一些實施方案中,PBMC濃度范圍為約10至至少約1012個細胞/mL或其間的任何濃度或濃度范圍。在一些實施方案中,遞送化合物濃度的范圍可以為約10ng/mL至約1g/mL或其間的任何濃度或濃度范圍。在一些實施方案中,遞送化合物濃度的范圍可以為約1pM至至少約2M或其間的任何濃度或濃度范圍。

可以調整本公開文本的方法中使用的溫度以影響化合物遞送和細胞活力。在一些實施方案中,所述方法是在約-5℃與約45℃之間進行。例如,所述方法可以在室溫(例如,約20℃)、生理溫度(例如,約37℃)、高于生理溫度(例如,大于約37℃至45℃或更高)、或降低的溫度(例如,約-5℃至約4℃)、或在這些示例性溫度之間的溫度下進行。

可以利用各種方法來驅動所述PBMC通過所述縮窄部。例如,可以在入口側通過泵(例如,壓縮機)施加壓力,可以在出口側通過真空泵施加真空,可以通過管施加毛細管作用,和/或系統可以是重力進給。也可以使用基于位移的流動系統(例如,注射泵、蠕動泵、手動注射器或移液器、活塞等)。在一些實施方案中,通過正壓或負壓使所述PBMC通過所述縮窄部。在一些實施方案中,通過恒定壓力或可變壓力使所述PBMC通過所述縮窄部。在一些實施方案中,使用注射器施加壓力。在一些實施方案中,壓力是使用氣體(例如,來自氣瓶)施加的正壓。在一些實施方案中,使用泵施加壓力。在一些實施方案中,泵是蠕動泵或隔膜泵。在一些實施方案中,使用真空施加壓力。在一些實施方案中,通過重力使所述PBMC通過所述縮窄部。在一些實施方案中,通過離心力使所述PBMC通過所述縮窄部。在一些實施方案中,通過毛細管壓力使所述PBMC通過所述縮窄部。

在一些實施方案中,流體流動引導所述PBMC通過所述縮窄部。在一些實施方案中,在所述PBMC通過所述縮窄部之前,流體流動是湍流。湍流是如下流體流動,其中在給定點的速度在大小和方向上不規律地變化。在一些實施方案中,通過所述縮窄部的流體流動是層流。層流涉及在固體邊界附近不間斷的流體流動,其中每個點的流動方向保持不變。在一些實施方案中,在所述PBMC通過所述縮窄部之后,流體流動是湍流。所述PBMC通過所述縮窄部的速度可以變化。在一些實施方案中,所述PBMC以均一的細胞速度通過所述縮窄部。在一些實施方案中,所述PBMC以波動的細胞速度通過所述縮窄部。

在其他實施方案中,使用組合處理通過以下方式調節免疫應答:使包含PBMC的細胞懸浮液通過所述縮窄部來,其中所述縮窄部使所述PBMC變形,從而引起所述PBMC的擾動,使得抗原和/或佐劑進入所述PBMC,例如本文描述的方法,之后暴露于在所述縮窄部下游的電場中。在一些實施方案中,在通過所述縮窄部之后,使所述PBMC通過由至少一個電極產生的電場。在一些實施方案中,電場有助于將化合物遞送至所述PBMC內部的第二位置,諸如PBMC核。例如,細胞變形縮窄部與電場的組合將編碼抗體的質粒遞送至所述PBMC(例如,細胞核)中,從而導致抗體的從頭產生。在一些實施方案中,一個或多個電極靠近細胞變形縮窄部以產生電場。在一些實施方案中,電場是在約0.1kV/m至約100MV/m之間或其間的任何數字或數字范圍。在一些實施方案中,使用集成電路來提供電信號以驅動電極。在一些實施方案中,使所述PBMC暴露于電場,其脈沖寬在約1ns至約1s之間,并且時間段在約100ns至約10s之間或其間的任何時間或時間范圍。用于遞送至PBMC的細胞懸浮液

細胞懸浮液可以是混合或純化的PBMC群體或多種PBMC。在一些實施方案中,細胞懸浮液是混合細胞群體,諸如全血。在一些實施方案中,細胞懸浮液是純化的細胞群體,諸如純化的PBMC群體(例如,多種PBMC)。在其他實施方案中,使PBMC群體(例如,多種PBMC)耗盡了一種或多種細胞。在一些實施方案中,使PBMC群體耗盡了T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞或樹突細胞中的一種或多種。

細胞懸浮液的組成(例如,摩爾滲透壓濃度、鹽濃度、血清含量、細胞濃度、pH等)可以影響用于調節免疫應答的化合物的遞送。在一些實施方案中,懸浮液包含全血??商娲?,細胞懸浮液是生理鹽水溶液或除血液之外的生理介質中的細胞混合物。在一些實施方案中,細胞懸浮液包含水性溶液。在一些實施方案中,水性溶液包含細胞培養基、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、鹽、金屬離子、糖、生長因子、動物來源產品、增量材料、表面活性劑、潤滑劑、脂質、維生素、氨基酸、蛋白質、細胞周期抑制劑和/或影響肌動蛋白聚合的藥劑。在一些實施方案中,細胞培養基是DMEM、IMDM、RPMI、X-Vivo 10TM和X-Vivo 15TM。另外,溶液緩沖液可以包含一種或多種潤滑劑(或其他表面活性劑),其可以設計例如用于減少或消除縮窄部或孔的堵塞并且改善細胞活力。示例性表面活性劑包括但不限于泊洛沙姆、聚山梨醇酯、糖或糖醇(諸如甘露醇、山梨醇)、動物來源的血清和白蛋白。

在用某些類型的PBMC的一些配置中,可以將所述PBMC在一種或多種有助于將所述化合物遞送至所述PBMC內部的溶液中孵育。在一些實施方案中,水性溶液包含影響肌動蛋白聚合的試劑。在一些實施方案中,影響肌動蛋白聚合的試劑是拉春庫林A、細胞松弛素和/或秋水仙堿。例如,可以在遞送之前將所述PBMC在解聚溶液諸如拉春庫林A(0.lμg/mL)中孵育1小時以使肌動蛋白細胞骨架解聚。作為另外的例子,可以在遞送之前將所述PBMC在10μM秋水仙堿(Sigma)中孵育2小時以使微管網絡解聚。

細胞懸浮液的粘度也可影響本文公開的方法。在一些實施方案中,細胞懸浮液的粘度的范圍為約8.9x10-4Pa·s至約4.0x10-3Pa·s或其間的任何值或值范圍。在一些實施方案中,粘度范圍在以下中的任一個之間:約8.9x10-4Pa·s至約4.0x10-3Pa·s、約8.9x10-4Pa·s至約3.0x10-3Pa·s、約8.9x10-4Pa·s至約2.0x10-3Pa·s或約8.9x10-3Pa·s至約1.0x10-3Pa·s。在一些實施方案中,粘度范圍在以下中的任一個之間:約0.89cP至約4.0cP、約0.89cP至約3.0cP、約0.89cP至約2.0cP或約0.89cP至約1.0cP。在一些實施方案中,觀察到剪切稀化效應,其中細胞懸浮液的粘度在剪切應變條件下降低。粘度可以通過本領域已知的任何方法測量,所述方法包括但不限于粘度計(諸如玻璃毛細管粘度計)或流變儀。粘度計在一種流動條件下測量粘度,而流變儀用于測量隨流動條件變化的粘度。在一些實施方案中,測量剪切稀化溶液(諸如血液)的粘度。在一些實施方案中,在約-5℃與約45℃之間測量粘度。例如,在室溫(例如,約20℃)、生理溫度(例如,約37℃)、高于生理溫度(例如,大于約37℃至45℃或更高)、降低的溫度(例如,約-5℃至約4℃)、或在這些示例性溫度之間的溫度下測量粘度。

縮窄部介導的遞送

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述縮窄部的直徑隨所述PBMC的直徑(諸如多種PBMC的平均直徑或多種所述PBMC內的亞群的平均直徑)而變化。在一些實施方案中,細胞的直徑通過所述細胞(例如,所述多種PBMC內的細胞)的最小橫截面距離來測量。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是所述輸入PBMC的平均直徑的約10%至約99%。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是以下中的任一個:所述多種輸入PBMC的平均直徑的約10%至約90%、約10%至約80%、約10%至約70%、約20%至約60%、約40%至約60%或約30%至約45%。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是以下中的任一個:所述多種輸入PBMC的平均直徑的約10%至約20%、約20%至約30%、約30%至約40%、約40%至約50%、約50%至約60%、約60%至約70%、約70%至約80%、約80%至約90%或約90%至約99%。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是以下中的任一個:所述多種輸入PBMC的平均直徑的約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約10%至約99%。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是以下中的任一個:在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約10%至約90%、約10%至約80%、約10%至約70%、約20%至約60%、約40%至約60%、約30%至約45%、約50%至約99%、約50%至約90%、約50%至約80%、約50%至約70%、約60%至約90%、約60%至約80%或約60%至約70%。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是以下中的任一個:在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約10%至約20%、約20%至約30%、約30%至約40%、約40%至約50%、約50%至約60%、約60%至約70%、約70%至約80%、約80%至約90%或約90%至約99%。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是以下中的任一個:在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。在一些實施方案中,在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的所述細胞亞群是淋巴細胞群體,其中所述淋巴細胞群體的直徑是約6μm至約10μm。在一些實施方案中,所述淋巴細胞群體的平均直徑是約7μm。在一些實施方案中,所述淋巴細胞群體是T細胞群體。在一些實施方案中,所述淋巴細胞是T細胞。在一些實施方案中,在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的所述細胞亞群是T細胞。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最大直徑的細胞亞群的平均直徑的約10%至約99%。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是以下中的任一個:在所述多種輸入PBMC內具有最大直徑的細胞亞群的平均直徑的約10%至約90%、約10%至約80%、約10%至約70%、約20%至約60%、約40%至約60%、約30%至約45%、約15%至約30%、約15%至約20%、約20%至約25%、約25%至約30%、約20%至約30%、約30%至約70%或約30%至約60%。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是以下中的任一個:在所述多種輸入PBMC內具有最大直徑的細胞亞群的平均直徑的約5%至約10%、約10%至約20%、約20%至約30%、約30%至約40%、約40%至約50%、約50%至約60%、約60%至約70%、約70%至約80%、約80%至約90%或約90%至約99%。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是以下中的任一個:在所述多種輸入PBMC內具有最大直徑的細胞亞群的平均直徑的約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。在一些實施方案中,在所述多種輸入PBMC內具有最大直徑的所述細胞亞群是單核細胞群體,其中所述單核細胞群體的直徑是約15μm至約25μm。在一些實施方案中,所述單核細胞群體的平均直徑是約20μm。在一些實施方案中,在所述多種輸入PBMC內具有最大直徑的所述細胞亞群是單核細胞。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是約3μm至約15μm。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是約3μm至約6μm。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是約4μm至約10μm。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是約4.2μm至約6μm。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是約4.2μm至約4.8μm。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是以下中的任一個:約2μm至約14μm、約4μm至約12μm、約6μm至約9μm、約4μm至約6μm、約4μm至約5μm、約3.5μm至約7μm、約3.5μm至約6.3μm、約3.5μm至約5.6μm、約3.5μm至約4.9μm、約4.2μm至約6.3μm、約4.2μm至約5.6μm或約4.2μm至約4.9μm。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是以下中的任一個:約2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm、10μm、10.5μm、11μm、11.5μm、12μm、12.5μm、13μm、13.5μm、14μm、14.5μm或15μm。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是以下中的任一個:約4.0μm、4.1μm、4.2μm、4.3μm、4.4μm、4.5μm、4.6μm、4.7μm、4.8μm、4.9μm或5.0μm。在一些實施方案中,所述縮窄部的直徑是約4.5μm。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,使所述多種輸入PBMC在范圍為約20psi至約150psi的壓力下通過所述縮窄部。在一些實施方案中,使所述多種輸入PBMC在范圍為約30psi至約120psi的壓力下通過所述縮窄部。在一些實施方案中,使所述多種輸入PBMC在范圍為約60psi至約90psi的壓力下通過所述縮窄部。在一些實施方案中,使所述多種輸入PBMC在范圍為以下中的任一個的壓力下通過所述縮窄部:約30psi至約40psi、約40psi至約50psi、約50psi至約60psi、約60psi至約70psi、約70psi至約80psi、約80psi至約90psi、約90psi至約100psi、約100psi至約110psi或約110psi至約120psi。在一些實施方案中,使所述多種輸入PBMC在約以下中的任一個的壓力下通過所述縮窄部:20psi、25psi、30psi、35psi、40psi、45psi、50psi、55psi、60psi、65psi、70psi、75psi、80psi、85psi、90psi、95psi、100psi、105psi、110psi、115psi或120psi。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,使所述多種輸入PBMC在范圍為約150kPa至約1000kPa的壓力下通過所述縮窄部。在一些實施方案中,使所述多種輸入PBMC在范圍為約207kPa至約830kPa的壓力下通過所述縮窄部。在一些實施方案中,使所述多種輸入PBMC在范圍為約415kPa至約621kPa的壓力下通過所述縮窄部。在一些實施方案中,使所述多種輸入PBMC在范圍為以下中的任一個的壓力下通過所述縮窄部:約200kPa至約250kPa、約250kPa至約300kPa、300kPa至約350kPa、約350kPa至約400kPa、400kPa至約450kPa、約450kPa至約500kPa、500kPa至約550kPa、約550kPa至約600kPa、600kPa至約650kPa、約650kPa至約700kPa、700kPa至約750kPa、約750kPa至約800kPa、800kPa至約850kPa、約850kPa至約900kPa、900kPa至約950kPa、約950kPa至約1000kPa。在一些實施方案中,使所述多種輸入PBMC在約以下中的任一個的壓力下通過所述縮窄部:200kPa、250kPa、300kPa、350kPa、400kPa、415kPa、450kPa、500kPa、550kPa、600kPa、612kPa、650kPa、700kPa、750kPa、800kPa或850kPa。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,使所述多種輸入PBMC在范圍為約0℃至約37℃的溫度下通過所述縮窄部。在一些實施方案中,使所述多種輸入PBMC在范圍為約0℃至約10℃的溫度下通過所述縮窄部。在一些實施方案中,使所述多種輸入PBMC在范圍為約2℃至約8℃的溫度下通過所述縮窄部。在一些實施方案中,使所述多種輸入PBMC在范圍為以下中的任一個的溫度下通過所述縮窄部:約2℃至約6℃、約5℃至約10℃、約10℃至約15℃、約15℃至約20℃、約20℃至約25℃、約25℃至約30℃、約30℃至約35℃或約35℃至約37℃。在一些實施方案中,使所述多種輸入PBMC在以下中的任一個的溫度下通過所述縮窄部:約0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃或37℃。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,在通過所述縮窄部之后,將所述多種經修飾的PBMC在37℃的溫度下孵育足夠的時間,以允許所述經修飾的PBMC正?;?7℃。在一些實施方案中,在通過所述縮窄部之后,將所述多種經修飾的PBMC在25℃的溫度下孵育足夠的時間,以允許所述經修飾的PBMC正?;?5℃。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,使所述輸入PBMC以在約0.001mL/min至約200mL/min之間或其間任何速率或速率范圍的流速通過所述縮窄部。在一些實施方案中,流速在約0.001mL/min至約175mL/min、約0.001mL/min至約150mL/min、約0.001mL/min至約125mL/min、約0.001mL/min至約100mL/min、約0.001mL/min至約50mL/min、約0.001mL/min至約25mL/min、約0.001mL/min至約10mL/min、約0.001mL/min至約7.5mL/min、約0.001mL/min至約5.0mL/min、約0.001mL/min至約2.5mL/min、約0.001mL/min至約1mL/min、約0.001mL/min至約0.1mL/min或約0.001mL/min至約0.01mL/min之間。在一些實施方案中,流速在約0.001mL/min至約200mL/min、約0.01mL/min至約200mL/min、約0.1mL/min至約200mL/min、約1mL/min至約200mL/min、約10mL/min至約200mL/min、約50mL/min至約200mL/min、約75mL/min至約200mL/min、約100mL/min至約200mL/min、約150mL/min至約200mL/min、約0.5mL/min至約200mL/min、約1mL/min至約200mL/min、約2.5mL/min至約200mL/min、約5mL/min至約200mL/min、約7.5mL/min至約200mL/min、約10mL/min至約200mL/min、約25mL/min至約200mL/min或約175mL/min至約200mL/min之間。在一些實施方案中,使所述多種輸入PBMC以在約10mL/min至約200mL/min之間的流速通過所述縮窄部。在一些實施方案中,使所述多種輸入PBMC以約100mL/min的流速通過所述縮窄部。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述縮窄部可以具有本領域已知的任何形狀;例如,3維形狀或2維形狀。所述縮窄部的2維形狀(諸如橫截面形狀)可以是但不限于環狀、橢圓形、圓形、方形、星形、三角形、多邊形、五邊形、六邊形、七邊形或八邊形。所述縮窄部的3維形狀可以是但不限于圓柱形、圓錐形或立方形。在一些實施方案中,所述縮窄部的橫截面形狀是矩形。在一些實施方案中,所述縮窄部的橫截面形狀是狹縫。在一些實施方案中,所述縮窄部的橫截面形狀是包含約3μm至約10μm的寬度和/或約1μm至約200μm的深度的狹縫。在一些實施方案中,所述縮窄部的橫截面形狀是包含約3μm至約6μm的寬度和/或約20μm至約120μm的深度的狹縫。在一些實施方案中,所述縮窄部的橫截面形狀是包含約4.2μm至約6μm的寬度和/或約20μm至約120μm的深度的狹縫。在一些實施方案中,所述縮窄部的橫截面形狀是包含約4.2μm至約6μm的寬度和/或約40μm至約100μm的深度的狹縫。在一些實施方案中,所述縮窄部的橫截面形狀是包含約4.2μm至約6μm的寬度和/或約20μm至約80μm的深度的狹縫。在一些實施方案中,所述縮窄部的橫截面形狀是包含約4.5μm的寬度和/或約80μm的深度的狹縫。在一些實施方案中,狹縫包含約10μm至約30μm的長度。在一些實施方案中,狹縫包含約2μm至約50μm的長度。在一些實施方案中,狹縫包含以下中的任一個的長度:約2μm至約5μm、約5μm至約10μm、約10μm至約15μm、約15μm至約20μm、約20μm至約25μm、約25μm至約30μm、約30μm至約35μm、約35μm至約40μm、約40μm至約45μm或約45μm至約50μm。在一些實施方案中,狹縫包含約10μm的長度。

在一些實施方案中,所述縮窄部包括入口部分和出口部分。所述縮窄部的入口和出口可以具有多個角度。在一些實施方案中,所述縮窄部具有相同的入口角度和出口角度。在一些實施方案中,所述縮窄部具有不同的入口角度和出口角度??梢赃x擇縮窄部角度以使在PBMC通過時所述縮窄部的堵塞最小化。在一些實施方案中,通過表面的流速是在約0.001mL/min至約100mL/min之間或其間的任何流速或流速范圍。在一些例子中,入口和/或出口部分的角度可以在約0與約90度之間。在一些實施方案中,入口和/或出口部分可以超過90度。在一些實施方案中,入口部分限定入口角度并且入口角度在約0度至約90度之間。在一些實施方案中,入口角度是以下中的任一個:在約10度至約40度之間、在約12度至約45度之間、在約15度至約30度之間。在一些實施方案中,入口角度在約20度至約22度之間。在一些實施方案中,出口部分限定出口角度并且出口角度在約0度至約90度之間。在一些實施方案中,出口角度是以下中的任一個:在約10度至約40度之間、在約12度至約45度之間、在約15度至約30度之間。在一些實施方案中,出口角度在約20度至約22度之間。在一些實施方案中,入口部分限定入口角度并且入口角度在約20度至約22度之間,并且出口部分限定出口角度并且出口角度在約20度至約22度之間。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,縮窄部邊緣是平滑的,例如圓形的或彎曲的。平滑縮窄部邊緣具有連續、平坦且均勻的表面,沒有隆起、脊狀物或不均勻的部分。在一些實施方案中,縮窄部邊緣是尖銳的。尖銳縮窄部邊緣具有尖的或呈銳角的薄邊緣。在一些實施方案中,縮窄部通道是直的。直的縮窄部通道不含彎曲處、曲部、角度或其他不規則性。在一些實施方案中,縮窄部通道是彎曲的。彎曲的縮窄部通道是彎的或者偏離直線。在一些實施方案中,縮窄部通道具有多個彎曲處,例如約2、3、4、5、6、7、8、9、10條或更多個彎曲處。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,使包含所述多種輸入PBMC的所述細胞懸浮液通過多個縮窄部,其中所述多個縮窄部串聯和/或平行排列。在一些實施方案中,所述多個縮窄部是串聯排列。在一些實施方案中,所述多個縮窄部是平行排列。在一些實施方案中,所述多個縮窄部是串聯和/或平行排列。在一些實施方案中,串聯排列的所述多個縮窄部包含串聯的約以下中的任一項:2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、75、100、500、1,000或更多個縮窄部。在一些實施方案中,平行排列的所述多個縮窄部可以包含串聯的約以下中的任一項:2、5、10、50、75、100、500、1,000或更多個縮窄部。

用于在本文公開的方法中使用的含有細胞變形縮窄部的示例性微流體通道描述于WO 2013059343中。用于在本文公開的方法中使用的具有孔的示例性表面描述于WO 2017041050中。

系統和試劑盒

在一些方面,本發明提供了一種系統,其包含根據本文描述的任何實施方案的縮窄部、PBMC懸浮液、抗原或佐劑中的一種或多種,所述系統如用于在本文描述的任何方法中使用。所述系統可以包括針對本文公開的物質組合物和方法描述的任何實施方案,包括在以上標題為“微流體系統及其部件”的章節中所公開的那些。在一些實施方案中,所述細胞變形縮窄部被定大小用于遞送至PBMC。在一些實施方案中,優化遞送參數,諸如操作流速、細胞和化合物濃度、溫度、細胞在縮窄部中的速度以及細胞懸浮液的組成(例如,摩爾滲透壓濃度、鹽濃度、血清含量、細胞濃度、pH等),以獲得化合物調節免疫應答的最大反應。

還提供了用于在調節個體的免疫應答中使用的試劑盒或制品。在一些實施方案中,所述試劑盒包含含有抗原和/或佐劑的經修飾的PBMC,包括本文描述的任一種經修飾的PBMC。在一些實施方案中,所述試劑盒包含用于產生經修飾的PBMC的縮窄部、PBMC懸浮液、抗原或佐劑中的一種或多種,用于在調節個體的免疫應答中使用。在一些實施方案中,所述試劑盒包含在合適的包裝中的本文描述的組分(例如,微流體通道或含有孔的表面、細胞懸浮液和/或化合物)。合適的包裝材料是本領域已知的,并且包括例如小瓶(諸如密封小瓶)、器皿、安瓿、瓶、罐、軟包裝(例如,密封的Mylar袋或塑料袋)等??梢赃M一步將這些制品滅菌和/或密封。

本發明還提供了試劑盒,其包含本文描述的方法的組分并且還可以包含用于進行所述方法以調節個體的免疫應答的說明書和/或用于將抗原和/或佐劑引入PBMC的說明書。本文所述的試劑盒還可以包括其他材料,包括緩沖液、稀釋劑、過濾器、針、注射器和包裝插頁,所述包裝插頁具有用于進行本文所述的任何方法的說明書;例如,用于調節個體的免疫應答的說明書或用于修飾PBMC以含有抗原和/或佐劑的說明書。

HPV和HPV相關疾病。

在根據本文描述的系統和試劑盒中的任一種的一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。

其他實施方案

其他實施方案提供了本文描述的實施方案中的任一種,但具有以下前提條件中的一個或多個:

-所述抗原不是HPV抗原

-所述抗原不是HPV E6抗原

-所述抗原不是HPV E7抗原

-所述抗原不是HPV E6抗原并且不是HPV E7抗原

-佐劑不與所述抗原一起引入所述PBMC中

-佐劑不存在于包含所述抗原的所述PBMC的胞質溶膠中

-不將所述佐劑施用至個體

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述多種經修飾的PBMC不表達HPV抗原。在一些實施方案中,所述多種經修飾的PBMC不包含編碼HPV抗原的核酸。在一些實施方案中,所述多種經修飾的PBMC不包含HPV E6抗原。在一些實施方案中,所述多種經修飾的PBMC不包含編碼HPV E6抗原的核酸。在一些實施方案中,所述多種經修飾的PBMC不包含HPV E7抗原。在一些實施方案中,所述多種經修飾的PBMC不包含編碼HPV E7抗原的核酸。

在一些實施方案中,所述多種經修飾的PBMC不包含HPV E6抗原并且不包含HPV E7抗原。在一些實施方案中,所述多種經修飾的PBMC不包含編碼HPV E6抗原的核酸,并且不包含編碼HPV E7抗原的核酸。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述多種PBMC確實包含編碼抗原的核酸。在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述多種PBMC不表達抗原。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述抗原包含一種或多種蛋白質。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種核酸編碼,并且以一種或多種核酸(諸如但不限于DNA、cDNA、mRNA和質粒)的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述抗原由一種或多種mRNA編碼,并且以一種或多種mRNA的形式進入所述PBMC。在一些實施方案中,所述多種PBMC包含編碼抗原的核酸。在一些實施方案中,所述多種PBMC包含編碼抗原的mRNA。

在根據本文描述的方法、組合物或多種經修飾的PBMC中的任一種的一些實施方案中,所述多種PBMC不誘導個體的耐受性。在一些實施方案中,所述多種PBMC不阻抑個體的免疫應答。在一些實施方案中,所述多種PBMC不包含致耐受性因子。在一些實施方案中,所述多種PBMC不與致耐受性因子組合施用。在一些實施方案中,在施用致耐受性因子之前、同時或之后不施用所述多種PBMC。

在本申請的一些實施方案中,術語“經調理”和“成熟化”可以互換使用。

示例性實施方案

本發明提供了以下列舉的實施方案。

1.包含抗原的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原對于所述經修飾的PBMC是外源的。

2.包含抗原的多種經修飾的PMBC,其中所述抗原對于所述經修飾的PBMC是外源的,其中所述抗原是癌癥抗原、感染性疾病抗原或病毒疾病相關抗原。

3.包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原對于所述經修飾的PBMC是外源的。

4.包含抗原的經調理的多種經修飾的PMBC,其中所述抗原對于所述經修飾的PBMC是外源的,其中所述抗原是癌癥抗原、感染性疾病抗原或病毒疾病相關抗原。

5.包含抗原和佐劑的經調理的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原對于所述經修飾的PBMC是外源的。

6.包含抗原的多種經修飾的PBMC,所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任一個的氨基酸序列。

7.包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任一個的氨基酸序列。

8.包含抗原的經調理的多種PBMC,其通過以下方式制備:將包含所述抗原的所述多種PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種PBMC。

9.包含抗原的經調理的多種PBMC,其通過以下方式制備:將所述多種PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述PBMC,然后將所述抗原引入所述PBMC,從而產生包含抗原的經調理的多種PBMC。

10.包含抗原的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC。

11.包含抗原的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使編碼所述抗原的核酸通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動輸入PBMC與編碼所述抗原的核酸一起孵育足夠的時間,以允許編碼所述抗原的核酸進入所述擾動的輸入PBMC,

其中所述核酸在所述PBMC中表達以產生所述抗原,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC。

12.包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

13.包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使編碼所述抗原的核酸通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與編碼所述抗原的核酸一起孵育足夠的時間,以允許編碼所述抗原的核酸進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含編碼所述抗原的核酸的多種經修飾的PBMC;以及

c)將具有編碼所述抗原的核酸的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間,以調理包含編碼所述抗原的核酸的所述經修飾的PBMC,

其中所述核酸在所述PBMC中表達以產生所述抗原,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

14.根據實施方案12或13所述的包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其中所述方法還包括:在與所述佐劑一起孵育以調理所述經修飾的PBMC之前,從所述細胞懸浮液中分離出包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC。

15.包含抗原和佐劑的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原和所述佐劑通過以形成多種擾動的輸入PBMC;以及

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原和所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原和所述佐劑進入所述擾動的輸入PBMC;

從而產生包含所述抗原和佐劑的所述多種經修飾的PBMC。

16.包含抗原和佐劑的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使編碼所述抗原的核酸和所述佐劑通過以形成多種擾動的輸入PBMC;以及

b)將所述多種擾動輸入PBMC與編碼所述抗原的核酸并與所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許編碼所述抗原的核酸和所述佐劑進入所述擾動的輸入PBMC;

其中所述核酸在所述PBMC中表達以產生所述抗原,從而產生包含所述抗原和佐劑的所述多種經修飾的PBMC。

17根據實施方案15或16所述的多種經修飾的PBMC,其中與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原的濃度在約0.1μM與約1mM之間和/或與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度在約0.1μM與約1mM之間。

18.根據實施方案15-17中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中:(a)與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原的濃度在約0.1μM與約10μM之間和/或與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度在約0.1μM與約10μM之間。

19.根據實施方案15-18中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原的濃度是約1μM和/或與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度是約1μM。

20.根據實施方案15-19中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原與所述佐劑的比率在約10000:1至約1:10000之間。

21.根據實施方案15-20中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原與所述佐劑的比率是約200:1。

22.包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:

a)將多種輸入PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述輸入PBMC,從而產生經調理的多種輸入PBMC;

b)使包含所述經調理的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成經調理的多種擾動的輸入PBMC;以及

c)將所述經調理的多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

23.根據實施方案22所述的多種經修飾的PBMC,其中與所述輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度在約0.1μM與約1mM之間。

24.根據實施方案22或23所述的多種經修飾的PBMC,其中與所述輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度在約0.1μM與約10μM之間。

25.根據實施方案22-24中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中與所述輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度是約1μM。

26.包含抗原和佐劑的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含含有所述佐劑的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;以及

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和所述佐劑的所述多種經修飾的PBMC。

27.包含抗原和佐劑的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含含有所述抗原的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述佐劑通過以形成多種擾動的輸入PBMC;以及

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許所述佐劑進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和所述佐劑的所述多種經修飾的PBMC。

28.根據實施方案10-14和22-27中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原的濃度在約0.1μM與約1mM之間。

29.根據實施方案10-14和22-28中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原的濃度在約0.1μM與約10μM之間。

30.根據實施方案10-14和22-29中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原的濃度是約1μM。

31.根據實施方案15-21和26-30中任一項所述的包含抗原和/或佐劑的多種經修飾的PBMC,其中所述方法還包括:

將包含所述抗原和/或佐劑的所述多種經修飾的PBMC與第二佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原和/或所述佐劑的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

32.根據實施方案31所述的包含抗原和/或佐劑的多種經修飾的PBMC,其中所述方法還包括:在與所述佐劑一起孵育以調理所述經修飾的PBMC之前,從所述細胞懸浮液中分離出包含所述抗原和/或所述佐劑的所述多種經修飾的PBMC。

33.根據實施方案8-31中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中與所述經修飾的PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度是約0.1μM與約1mM之間。

34.根據實施方案8-33中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中與所述經修飾的PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度是約0.1μM與約10μM之間。

35.根據實施方案8-34中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中與所述經修飾的PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度是約1μM。

36.根據實施方案8-35中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述方法還包括以下步驟:將所述輸入PBMC和/或所述經修飾的PBMC與如下藥劑一起孵育,與在沒有所述進一步孵育步驟的情況下制備的相應經修飾的PBMC相比,所述藥劑增強所述經修飾的PBMC的活力和/或功能。

37.根據實施方案10-36中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是所述多種輸入PBMC的平均直徑的約10%至約99%。

38.根據實施方案10-37中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是所述多種輸入PBMC的平均直徑的約10%至約70%。

39.根據實施方案10-38中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是所述多種輸入PBMC的平均直徑的約20%至約60%。

40.根據實施方案10-39中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是所述多種輸入PBMC的平均直徑的約40%至約60%。

41.根據實施方案10-40中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是所述多種輸入PBMC的平均直徑的約30%至約45%。

42.根據實施方案10-36中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約10%至約99%。

43.根據實施方案10-36和42中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約10%至約70%。

44.根據實施方案10-36、42和43中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約20%至約60%。

45.根據實施方案10-36和42-44中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約30%至約45%。

46.根據實施方案10-36中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約50%至約99%。

47.根據實施方案10-36和46中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約50%至約90%。

48.根據實施方案10-36、46和47中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約50%至約80%。

49.根據實施方案10-36和46-48中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約50%至約70%。

50.根據實施方案10-36中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約60%至約90%。

51.根據實施方案10-36和50中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約60%至約80%。

52.根據實施方案10-36、50和51中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約60%至約70%。

53.根據實施方案10-52中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最大直徑的細胞亞群的平均直徑的約10%至約99%。

54.根據實施方案10-53中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最大直徑的細胞亞群的平均直徑的約10%至約70%。

55.根據實施方案10-54中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最大直徑的細胞亞群的平均直徑的約20%至約60%。

56.根據實施方案10-55中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最大直徑的細胞亞群的平均直徑的約20%至約30%。

57.根據實施方案10-56中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最大直徑的細胞亞群的平均直徑的約20%至約25%。

58.根據實施方案10-55中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最大直徑的細胞亞群的平均直徑的約30%至約70%。

59.根據實施方案10-55和58中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最大直徑的細胞亞群的平均直徑的約30%至約60%。

60.根據實施方案10-55、58和59中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最大直徑的細胞亞群的平均直徑的約30%至約45%。

61.根據實施方案42-60中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的所述細胞亞群是T細胞。

62.根據實施方案53-61中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中在所述多種輸入PBMC內具有最大直徑的所述細胞亞群是單核細胞。

63.根據實施方案10-62中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm。

64.根據實施方案10-63中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是約4μm至約10μm。

65.根據實施方案10-63中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約6μm。

66.根據實施方案10-65中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是約4.2μm至約6μm。

67.根據實施方案10-66中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是約4.5μm。

68.根據實施方案10-67中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中使所述多種輸入PBMC在范圍為約30psi至約120psi或約60psi至約90psi的壓力下通過所述縮窄部。

69.根據實施方案10-67中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中使所述多種輸入PBMC在范圍為約207kPa至約830kPa或約415kPa至約621kPa的壓力下通過所述縮窄部。

70.根據實施方案10-67中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中使所述多種輸入PBMC以在約0.001mL/cm2/s至約200L/cm2/s之間的流速通過所述縮窄部。

71.根據實施方案10-67中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中使所述多種輸入PBMC以在約0.1mL/cm2/s至約150L/cm2/s之間的流速通過所述縮窄部。

72.根據實施方案10-67中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中使所述多種輸入PBMC以約100mL/cm2/s的流速通過所述縮窄部。

73.根據實施方案10-72中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中使所述多種輸入PBMC在范圍為約0℃至約37℃的溫度下通過所述縮窄部。

74.根據實施方案10-73中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中在通過所述縮窄部之后,將所述多種經修飾的PBMC在37℃的溫度下孵育足夠的時間,以允許所述經修飾的PBMC正?;?7℃。

75.根據實施方案10-74中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中在通過所述縮窄部之后,將所述多種經修飾的PBMC在25℃的溫度下孵育足夠的時間,以允許所述經修飾的PBMC正?;?5℃。

76.根據實施方案10-75中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的橫截面形狀選自:環形、橢圓形、圓形、正方形、矩形、星形、三角形、多邊形、五邊形、六角形、七邊形和八邊形。

77.根據實施方案10-76中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的橫截面形狀是狹縫。

78.根據實施方案77所述的多種經修飾的PBMC,其中狹縫包含約3μm-6μm的寬度和/或約20μm-120μm的深度。

79.根據實施方案78所述的多種經修飾的PBMC,其中所述狹縫包含約4.2μm-6μm的寬度和/或約20μm-120μm的深度。

80.根據實施方案77-79中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述狹縫包含約4.5μm的寬度和/或約80μm的深度。

81.根據實施方案10-80中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中使包含所述多種輸入PBMC的所述細胞懸浮液通過多個縮窄部,其中所述多個縮窄部串聯和/或平行排列。

82.根據實施方案10-80中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部包括入口部分和出口部分,其中:

(a)所述入口部分限定入口角度并且所述入口角度在約0度至約90度之間或在約20-22度之間;并且/或者

(b)所述出口部分限定出口角度并且所述出口角度在約0度至約90度之間或在約20-22度之間;

對于(a)和(b)優選在約20-22度之間。

83.根據實施方案10-82中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中使包含所述多種輸入PBMC的所述細胞懸浮液通過多個縮窄部,其中所述多個縮窄部串聯和/或平行排列。

84.根據實施方案12-14、22-25、31-83中任一項所述的經調理的多種經修飾的PBMC,其中將所述多種經修飾的PBMC與所述佐劑一起孵育約1至約24小時以調理所述經修飾的PBMC。

85.根據實施方案12-14、22-25、31-84中任一項所述的經調理的多種經修飾的PBMC,其中將所述多種經修飾的PBMC與所述佐劑一起孵育約2至約10小時以調理所述經修飾的PBMC。

86.根據實施方案12-14、22-25、31-85中任一項所述的經調理的多種經修飾的PBMC,其中將所述多種經修飾的PBMC與所述佐劑一起孵育約3至約6小時以調理所述經修飾的PBMC。

87.根據實施方案12-14、22-25、31-86中任一項所述的經調理的多種經修飾的PBMC,其中將所述多種經修飾的PBMC與所述佐劑一起孵育約4小時以調理所述經修飾的PBMC。

88.根據實施方案1-87中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原、編碼所述抗原的核酸和/或佐劑存在于所述多種經修飾的PBMC中的細胞的胞質溶膠和/或囊泡中。

89.根據實施方案1-88中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原和/或編碼所述抗原的核酸存在于所述多種經修飾的PBMC中的細胞的胞質溶膠中,并且所述佐劑存在于所述細胞的囊泡中。

90.根據實施方案88或89所述的多種經修飾的PBMC,其中所述囊泡是內體。

91.根據實施方案1-90中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原、編碼所述抗原的核酸和/或所述佐劑存在于所述多種經修飾的PBMC中的細胞的多個區室中。

92.根據實施方案1-91中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原、編碼所述抗原的核酸和/或所述佐劑存在于所述多種PBMC中的至少約70%的細胞中。

93.根據實施方案1-92中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原、編碼所述抗原的核酸和/或所述佐劑存在于所述多種PBMC中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞中的每一種的至少約70%中。

94.根據實施方案1-93中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原結合至所述多種經修飾的PBMC中的細胞的表面。

95.根據實施方案5-94中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述佐劑是CpG寡脫氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激動劑、RIG-I激動劑、聚I:C、R837、R848、TLR3激動劑、TLR4激動劑或TLR 9激動劑。

96.根據實施方案95所述的多種經修飾的PBMC,其中所述佐劑是CpG ODN。

97.根據實施方案96所述的多種經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是A類CpG ODN、B類CpG ODN或C類CpG ODN。

98.根據實施方案1-97中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原是疾病相關抗原。

99.根據實施方案98所述的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原源自從患病細胞分離的肽或mRNA。

100.根據實施方案1-99中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原是非自身抗原。

101.根據實施方案1-100中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原是腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或真菌抗原。

102.根據實施方案1-5和8-101中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原源自腫瘤裂解物。

103.根據實施方案1-101中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原是人乳頭瘤病毒(HPV)抗原。

104.根據實施方案103所述的多種經修飾的PBMC,其中所述HPV是HPV-16或HPV-18。

105.根據實施方案103或104所述的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原包含源自HPV E6和/或E7的肽。

106.根據實施方案103或104所述的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原包含源自HPV E6和/或E7的HLA-A2限制性肽。

107.根據實施方案106所述的多種經修飾的PBMC,其中所述HLA-A2限制性肽包含SEQ ID NO:1-4中任一個的氨基酸序列。

108.根據實施方案107所述的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任一個的氨基酸序列。

109.根據實施方案1-108中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述經修飾的PBMC包含含有多種免疫原性表位的多種抗原。

110.根據實施方案109所述的多種經修飾的PBMC,其中在向個體施用包含含有所述多種免疫原性表位的所述多種抗原的所述經修飾的PBMC之后,所述多種免疫原性表位都不降低所述個體對任何其他免疫原性表位的免疫應答。

111.根據實施方案110所述的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原是多肽并且所述免疫原性表位是免疫原性肽表位。

112.根據實施方案111所述的多種經修飾的PBMC,其中所述免疫原性肽表位與N末端側翼多肽和/或C末端側翼多肽融合。

113.根據實施方案111所述的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原是包含免疫原性肽表位和一個或多個異源肽序列的多肽。

114.根據實施方案111所述的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原是包含免疫原性肽表位的多肽,所述免疫原性肽表位在N末端和/或C末端側接異源肽序列。

115.根據實施方案114所述的多種經修飾的PBMC,其中所述側翼異源肽序列源自疾病相關免疫原性肽。

116.根據實施方案112所述的多種經修飾的PBMC,其中所述N末端側翼多肽包含SEQ ID NO:5-10中任一個的氨基酸序列和/或所述C末端側翼多肽包含SEQ ID NO:11-17中任一個的氨基酸序列。

117.根據實施方案1-116中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原能夠被加工成MHC I類限制性肽和/或MHC II類限制性肽。

118.根據實施方案5、15-21和26-117中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述經修飾的PBMC包含濃度在約1nM與約1mM之間的所述佐劑。

119.根據實施方案1-118中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述經修飾的PBMC包含濃度在約1nM與約1mM之間的所述抗原。

120.根據實施方案1-119中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原與所述佐劑的比率在約10000:1至約1:10000之間。

121.根據實施方案1-120中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原與所述佐劑的比率是約200:1。

122.根據實施方案1-118中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述經修飾的PBMC包含復合物,所述復合物包含:a)所述抗原,b)所述抗原和至少一種其他抗原,c)所述抗原和所述佐劑,d)編碼所述抗原的核酸,e)編碼所述抗原的核酸和編碼一種其他抗原的至少一種其他核酸,和/或f)編碼所述抗原的核酸和所述佐劑。

123.根據實施方案3-5、7-9、12-14、22-25和31-122中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述多種經修飾的PBMC還包含如下藥劑,與不包含所述藥劑的相應多種經修飾的PBMC相比,所述藥劑增強所述多種經修飾的PBMC的活力和/或功能。

124.根據實施方案3-5、7-9、12-14、22-25和31-123中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述多種經修飾的PBMC還包含如下藥劑,與不包含所述藥劑的相應多種經修飾的PBMC相比,所述藥劑在凍-融循環后增強所述多種經修飾的PBMC的活力和/或功能。

125.根據實施方案3-5、7-9、12-14、22-25和31-124中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中在多達1、2、3、4、5個凍-融循環之后,至少約70%、約80%或約90%的所述經調理的多種經修飾的PBMC是有活力的。

126.根據實施方案123-125中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述藥劑是增強內吞作用的化合物、穩定劑或輔助因子。

127.根據實施方案123-126中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述藥劑是白蛋白。

128.根據實施方案127所述的多種經修飾的PBMC,其中所述白蛋白是小鼠、?;蛉税椎鞍?。

129.根據實施方案123-125中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述藥劑是以下中的一種或多種:二價金屬陽離子、葡萄糖、ATP、鉀、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精氨酸、L-谷氨酰胺或EDTA。

130.根據實施方案123-125中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述藥劑是以下中的一種或多種:丙酮酸鈉、腺嘌呤、海藻糖、右旋糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、DMSO、CS2、CS5、CS10、CS15、HEPES、甘油、谷胱甘肽、

131.根據實施方案128所述的多種經修飾的PBMC,其中所述藥劑包含小鼠血清白蛋白(MSA)。

132.根據實施方案128所述的多種經修飾的PBMC,其中所述藥劑包含人血清白蛋白(HSA)。

133.根據實施方案1-132中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中將所述細胞進一步修飾以增加一種或多種共刺激分子的表達。

134.根據實施方案133所述的多種經修飾的PBMC,其中所述共刺激分子是B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。

135.根據實施方案133所述的多種經修飾的PBMC,其中所述共刺激分子是信號2效應子。

136.根據實施方案133-135中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述細胞包含導致所述一種或多種共刺激分子的表達增加的核酸(例如,mRNA)。

137.根據實施方案136所述的多種經修飾的PBMC,其中所述核酸編碼所述共刺激分子。

138.根據實施方案1-137中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中將所述細胞進一步修飾以增加一種或多種細胞因子的表達。

139.根據實施方案138所述的多種經修飾的PBMC,其中所述細胞因子是IL-12、IL-2、IFN-α或IL-21。

140.根據實施方案133所述的多種經修飾的PBMC,其中所述共刺激分子是信號3效應子。

141.根據實施方案138-140中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述細胞包含導致所述一種或多種細胞因子的表達增加的核酸(例如,mRNA)。

142.根據實施方案141所述的多種經修飾的PBMC,其中所述核酸編碼所述細胞因子。

143.根據實施方案1-142中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述多種經修飾的PBMC中的至少一種細胞對于HLA-A2的表達是陽性的。

144.根據實施方案1-142中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述經修飾的PBMC包含進一步修飾以調節I類MHC表達。

145.根據實施方案1-142中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述經修飾的PBMC包含進一步修飾以調節HLA-A02MHC I。

146.根據實施方案1-145中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述經修飾的PBMC包含進一步修飾以調節II類MHC表達。

147.根據實施方案145所述的多種經修飾的PBMC,其中與響應于在同種異體背景下施用不包含所述進一步修飾的相應經修飾的PBMC而在個體中產生的先天性免疫應答相比,響應于在同種異體背景下施用所述經修飾的PBMC而在個體中產生的先天性免疫應答降低。

148.根據實施方案1-147中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中與不包含所述進一步修飾的相應經修飾的PBMC在其施用的個體中的循環半衰期相比,所述經修飾的PBMC在其施用的個體中的循環半衰期增加。

149.根據實施方案1-147中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述經修飾的PBMC在其施用的個體中的循環半衰期基本上與不包含所述進一步修飾的相應經修飾的PBMC在其施用的個體中的循環半衰期相同。

150.根據實施方案1-147中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述經修飾的PBMC在其施用的個體中的循環半衰期基本上與相應的未經修飾的PBMC在其施用的個體中的循環半衰期相同。

151.根據實施方案1-150中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述多種PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核細胞、樹突細胞或NK-T細胞中的一種或多種。

152.根據實施方案1-151中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述多種PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核細胞、樹突細胞或NK-T細胞中的兩種或更多種。

153.根據實施方案1-152中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述多種PBMC包含CD3+ T細胞、CD20+ B細胞、CD14+單核細胞、CD56+ NK細胞中的一種或多種。

154.根據實施方案10-153中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述多種輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞,并且其中所述多種輸入PBMC中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率基本上與全血中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率相同。

155.根據實施方案10-153中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述多種輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞,并且其中所述多種輸入PBMC中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率基本上與來自全血的白細胞單采術產物中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率相同。

156.根據實施方案10-153中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述多種輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞,并且其中所述多種輸入PBMC中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率與全血中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率相差不超過10%。

157.根據實施方案10-153中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中所述多種輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞,并且其中所述多種輸入PBMC中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率與來自全血的白細胞單采術產物中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率相差不超過10%。

158.根據實施方案10-157中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中:

(a)至少約25%的所述輸入PBMC是T細胞;

(b)至少約2.5%的所述輸入PBMC是B細胞;

(c)至少約3.5%的所述輸入PBMC是NK細胞;或者

(d)至少約4%的所述輸入PBMC是單核細胞。

159.根據實施方案1-158中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中:

(a)至少約20%的所述經修飾的PBMC是T細胞;

(b)至少約2%的所述經修飾的PBMC是B細胞;

(c)至少約3%的所述經修飾的PBMC是NK細胞;或者

(d)至少約3%的所述經修飾的PBMC是單核細胞。

160.根據實施方案1-159中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中:

(a)不超過約70%的所述輸入PBMC是T細胞;

(b)不超過約14%的所述輸入PBMC是B細胞;

(c)不超過約35%的所述輸入PBMC是NK細胞;或者

(d)不超過約25%的所述輸入PBMC是單核細胞。

161.根據實施方案1-160中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中:

(a)不超過約80%的所述經修飾的PBMC是T細胞;

(b)不超過約16%的所述經修飾的PBMC是B細胞;

(c)不超過約40%的所述經修飾的PBMC是NK細胞;或者

(d)不超過約30%的所述經修飾的PBMC是單核細胞。

162.根據實施方案1-161中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中:

(a)約25%至約70%的所述經修飾的PBMC是T細胞;

(b)約2.5%至約14%的所述經修飾的PBMC是B細胞;

(c)約3.5%至約35%的所述經修飾的PBMC是NK細胞;或者

(d)約4%至約25%的所述經修飾的PBMC是單核細胞。

163.根據實施方案1-162中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中:

(a)所述多種經修飾的PBMC內T細胞的百分比和所述多種輸入PBMC內T細胞的百分比相差按數量計不超過約10%;

(b)所述多種經修飾的PBMC內B細胞的百分比和所述多種輸入PBMC內B細胞的百分比相差按數量計不超過約10%;

(c)所述多種經修飾的PBMC內NK細胞的百分比和所述多種輸入PBMC內NK細胞的百分比相差按數量計不超過約10%;并且/或者

(d)所述多種經修飾的PBMC內單核細胞的百分比和所述多種輸入PBMC內單核細胞的百分比相差按數量計不超過約10%。

164.根據實施方案3-9和12-163中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中:與多種未經修飾的PBMC中的B細胞相比,所述經調理的多種經修飾的PBMC的B細胞中一種或多種共刺激分子被上調,其中所述共刺激分子是CD80和/或CD86。

165.根據實施方案164所述的多種經修飾的PBMC,其中與多種未經調理的PBMC中的B細胞相比,所述經調理的多種經修飾的PBMC的B細胞中CD80和/或CD86被上調超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。

166.根據實施方案164或165的多種經修飾的PBMC,其中所述共刺激分子是CD86。

167.根據實施方案3-9和12-166中任一項所述的經調理的多種經修飾的PBMC,其中與多種未經調理的PBMC相比,所述經修飾的PBMC具有IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一種或多種的增加表達。

168.根據實施方案167所述的經調理的多種經修飾的PBMC,其中與所述多種未經調理的PBMC相比,IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一種或多種的表達增加超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。

169.一種包含根據實施方案1-168中任一項所述的多種經修飾的PBMC的組合物。

170.一種包含根據實施方案1-169中任一項所述的多種經修飾的PBMC的組合物,其用作藥物。

171.一種包含根據實施方案1-169中任一項所述的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在通過手術、療法或診斷治療人體或動物體的方法中使用。

172.一種包含根據實施方案1-169中任一項所述的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在治療癌癥、感染性疾病或病毒相關疾病中使用。

173.根據實施方案172所述的組合物,其中所述癌癥是頭頸癌、子宮頸癌、外陰癌、陰道癌、陰莖癌、肛門癌、肛周癌、肛門生殖器癌、口腔癌或唾液腺癌。

174.根據實施方案171-173中任一項所述的組合物,其中在施用免疫檢查點抑制劑之前、同時或之后施用所述經修飾的PBMC。

175.根據實施方案174所述的組合物,其中所述免疫檢查點抑制劑靶向以下中的任一種:PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA。

176.根據實施方案175所述的組合物,其中所述免疫檢查點抑制劑靶向PD-1。

177.根據實施方案175所述的組合物,其中所述免疫檢查點抑制劑靶向PD-L1。

178.根據實施方案171-177中任一項所述的組合物,其中在施用治療劑之前、同時或之后施用所述經修飾的PBMC。

179.根據實施方案178所述的組合物,其中所述治療劑是化學治療劑。

180.根據實施方案172所述的組合物,其中所述感染性疾病與HIV、HPV、EBV、MCV、HBV或HCV相關。

181.一種藥物組合物,其包含根據實施方案1-168中任一項所述的經修飾的PBMC和藥學上可接受的載體。

182.根據實施方案171-181中任一項所述的組合物,其中所述組合物用于治療癌癥或感染性疾病。

183.一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用作藥物,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

184.一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用作藥物,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使編碼所述抗原的核酸通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與編碼所述抗原的核酸一起孵育足夠的時間,以允許編碼所述抗原的核酸進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含編碼所述抗原的核酸的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含編碼所述抗原的核酸的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間,以調理包含編碼所述抗原的核酸的所述經修飾的PBMC,

其中所述核酸在所述PBMC中表達以產生所述抗原,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

185.一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在通過手術、療法或診斷治療人體或動物體的方法中使用,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

186.一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在通過手術、療法或診斷治療人體或動物體的方法中使用,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使編碼所述抗原的核酸通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與編碼所述抗原的核酸一起孵育足夠的時間,以允許編碼所述抗原的核酸進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含編碼抗原的所述核酸的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含編碼所述抗原的核酸的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間,以調理包含編碼所述抗原的核酸的所述經修飾的PBMC,

其中所述核酸在所述PBMC中表達以產生所述抗原,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

187.一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用作藥物,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:

a)將多種輸入PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述輸入PBMC,從而產生經調理的多種輸入PBMC;

b)使包含所述經調理的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成經調理的多種擾動的輸入PBMC;以及

c)將所述經調理的多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

188.一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用作藥物,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:

a)將多種輸入PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述輸入PBMC,從而產生經調理的多種輸入PBMC;

b)使包含所述經調理的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使編碼所述抗原的核酸通過以形成經調理的多種擾動的輸入PBMC;以及

c)將所述經調理的多種擾動輸入PBMC與編碼所述抗原的核酸一起孵育足夠的時間,以允許編碼所述抗原的核酸進入所述擾動的輸入PBMC,

其中所述核酸在所述PBMC中表達以產生所述抗原,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

189.一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在治療人體或動物體的方法中使用,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:

a)將多種輸入PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述輸入PBMC,從而產生經調理的多種輸入PBMC;

b)使包含所述經調理的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成經調理的多種擾動的輸入PBMC;以及

c)將所述經調理的多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

190.一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在治療人體或動物體的方法中使用,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:

a)將多種輸入PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述輸入PBMC,從而產生經調理的多種輸入PBMC;

b)使包含所述經調理的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使編碼所述抗原的核酸通過以形成經調理的多種擾動的輸入PBMC;以及

c)將所述經調理的多種擾動輸入PBMC與編碼所述抗原的核酸一起孵育足夠的時間,以允許編碼所述抗原的核酸進入所述擾動的輸入PBMC,

其中所述核酸在所述PBMC中表達以產生所述抗原,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

191.一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在治療個體的癌癥、感染性疾病或病毒相關疾病的方法中使用,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

192.一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在治療個體的癌癥、感染性疾病或病毒相關疾病的方法中使用,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使編碼所述抗原的核酸通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與編碼所述抗原的核酸一起孵育足夠的時間,以允許編碼所述抗原的核酸進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含編碼所述抗原的核酸的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含編碼所述抗原的核酸的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間,以調理包含編碼所述抗原的核酸的所述經修飾的PBMC,

其中所述核酸在所述PBMC中表達以產生所述抗原,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

193.一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在治療個體的癌癥、感染性疾病或病毒相關疾病中使用,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

194.一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在治療個體的癌癥、感染性疾病或病毒相關疾病中使用,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使編碼所述抗原的核酸通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與編碼所述抗原的核酸一起孵育足夠的時間,以允許編碼所述抗原的核酸進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含編碼所述抗原的核酸的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含編碼抗原的所述核酸的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間,以調理包含編碼所述抗原的核酸的所述經修飾的PBMC,

其中所述核酸在所述PBMC中表達以產生所述抗原,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

195.一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在治療個體的HPV相關疾病的方法中使用,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

196.一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在治療個體的HPV相關疾病的方法中使用,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使編碼所述抗原的核酸通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與編碼所述抗原的核酸一起孵育足夠的時間,以允許編碼所述抗原的核酸進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含編碼所述抗原的核酸的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含編碼所述抗原的核酸的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間,以調理包含編碼所述抗原的核酸的所述經修飾的PBMC,

其中所述核酸在所述PBMC中表達以產生所述抗原,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

197.一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在治療個體的HPV相關疾病中使用,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

198.一種包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物,其用于在治療個體的HPV相關疾病中使用,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使編碼所述抗原的核酸通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與編碼所述抗原的核酸一起孵育足夠的時間,以允許編碼所述抗原的核酸進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含編碼所述抗原的核酸的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間,以調理包含編碼所述抗原的核酸的所述經修飾的PBMC,

其中所述核酸在所述PBMC中表達以產生所述抗原,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

199.包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物在制造用于治療個體的癌癥、感染性疾病或病毒相關疾病的藥物中的用途,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

200.包含含有抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的組合物在制造用于治療HPV相關疾病的藥物中的用途,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

201.包含人乳頭瘤病毒(HPV)抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約4μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

202.包含HPV抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約4μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,

從而產生包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

203.包含HPV抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約4μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

204.包含HPV抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約4μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,

從而產生包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

205.根據實施方案201-204中任一項所述的經調理的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是(a)約4.2μm至約6μm;或(b)約4.5μm。

206.根據實施方案201-205中任一項所述的經調理的多種經修飾的PBMC,其中將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育(a)約2小時至約10小時;(b)約3小時至約6小時;或(c)約4小時。

207.包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

208.包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,

從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

209.包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

210.包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,

從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

211.根據實施方案207-210中任一項所述的經調理的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是約4μm至約10μm。

212.根據實施方案207-211中任一項所述的經調理的多種經修飾的PBMC,所述縮窄部的直徑是約3μm至約6μm。

213.根據實施方案207-212中任一項所述的經調理的多種經修飾的PBMC,其中所述縮窄部的直徑是(a)約4.2μm至約6μm;或(b)約4.5μm。

214.根據實施方案207-213中任一項所述的經調理的多種經修飾的PBMC,其中將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育(a)約2小時至約10小時;(b)約3小時至約6小時;或(c)約4小時。

215.一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括向所述個體施用根據實施方案1-168中任一項所述的多種經修飾的PBMC、根據實施方案169-180所述的組合物、或根據實施方案181所述的藥物組合物。

216.一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:

a)向所述個體施用包含抗原的多種經修飾的PBMC,所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一個的氨基酸序列;以及

b)向所述個體施用佐劑。

217.一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:

a)將包含抗原的多種PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述PBMC,從而產生包含所述抗原的經調理的多種PBMC;

b)向所述個體施用包含所述抗原的所述經調理的多種PBMC。

218.一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:

a)將多種PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述PBMC,從而產生包含抗原的經調理的多種PBMC;

b)將抗原引入所述多種PBMC;以及

c)向所述個體施用包含所述抗原的所述經調理的多種PBMC。

219.一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的經調理的多種經修飾的PBMC;以及

d)向所述個體施用包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

220.一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使編碼抗原的核酸通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與編碼所述抗原的核酸一起孵育足夠的時間,以允許編碼所述抗原的核酸進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含編碼所述抗原的核酸的多種經修飾的PBMC;

c)將包含編碼所述抗原的核酸的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間,以調理包含編碼所述抗原的核酸的所述經修飾的PBMC,

其中所述核酸在所述PBMC中表達以產生所述抗原,從而產生包含所述抗原的經調理的多種經修飾的PBMC;以及

d)向所述個體施用包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

221.根據實施方案220所述的方法,其還包括在與所述佐劑一起孵育之前,從所述細胞懸浮液中分離出包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC。

222.一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原和佐劑通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原和所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原和所述佐劑進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和佐劑的多種經修飾的PBMC;以及

c)向所述個體施用所述多種經修飾的PBMC。

223.一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使編碼抗原的核酸和佐劑通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動輸入PBMC與編碼所述抗原的核酸并與所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許編碼所述抗原的核酸和所述佐劑進入所述擾動的輸入PBMC,

其中所述核酸在所述PBMC中表達以產生所述抗原,從而產生包含所述抗原和佐劑的多種經修飾的PBMC;以及

c)向所述個體施用包含所述抗原和所述佐劑的所述多種經修飾的PBMC。

224.根據實施方案223所述的方法,其中與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原的濃度在約0.1μM與約1mM之間和/或與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度在約0.1μM與約1mM之間。

225.根據實施方案222-224中任一項所述的方法,其中與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原的濃度在約0.1μM與約10μM之間和/或與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度在約0.1μM與約10μM之間。

226.根據實施方案222-225中任一項所述的方法,其中與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原的濃度是約1μM和/或與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度是約1μM。

227.根據實施方案222-226中任一項所述的方法,其中與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原與所述佐劑的比率在約10000:1至約1:10000之間。

228.根據實施方案222-227中任一項所述的方法,其中與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原與所述佐劑的比率是約200:1。

229.一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:

a)將多種輸入PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述輸入PBMC,從而產生經調理的多種輸入PBMC;

b)使包含所述經調理的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原通過以形成經調理的多種擾動的輸入PBMC;

c)將所述經調理的多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC;以及

d)向所述個體施用所述經調理的多種經修飾的PBMC。

230.根據實施方案229所述的方法,其中與所述輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度在約0.1μM與約1mM之間。

231.根據實施方案229或230所述的方法,其中與所述輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度在約0.1μM與約10μM之間。

232.根據實施方案229-231中任一項所述的方法,其中與所述輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度是約1μM。

233.一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:

a)使包含含有佐劑的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和所述佐劑的多種經修飾的PBMC;以及

c)向所述個體施用所述多種經修飾的PBMC。

234.一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:

a)使包含含有抗原的輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使佐劑通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許所述佐劑進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和所述佐劑的多種經修飾的PBMC;以及

c)向所述個體施用所述多種經修飾的PBMC。

235.根據實施方案234所述的方法,其中與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度在約0.1μM與約1mM之間。

236.根據實施方案234或235所述的方法,其中與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度在約0.1μM與約10μM之間。

237.根據實施方案234-236中任一項所述的方法,其中與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述佐劑的濃度是約1μM。

238.一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBM的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;

c)向所述個體施用所述多種經修飾的PBMC;以及

d)向所述個體施用佐劑。

239.一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:

a)使包含含有抗原的輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使佐劑通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許所述佐劑進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和所述佐劑的多種經修飾的PBMC;以及

c)向所述個體施用所述多種經修飾的PBMC;以及

d)向所述個體施用佐劑。

240.根據實施方案219-233、238和239中任一項所述的方法,其中與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原的濃度在約0.1μM與約1mM之間。

241.根據實施方案219-233和238-240中任一項所述的方法,其中與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原的濃度在約0.1μM與約10μM之間。

242.根據實施方案219-233和238-241中任一項所述的方法,其中與所述擾動的輸入PBMC一起孵育的所述抗原的濃度是約1μM。

243.根據實施方案222-228和233-242中任一項所述的方法,其中所述方法還包括:

將包含所述抗原和/或佐劑的所述多種經修飾的PBMC與第二佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原和/或佐劑的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

244根據實施方案243所述的方法,其中與所述經修飾的PBMC一起孵育的所述第二佐劑的濃度在約0.1μM與約1mM之間。

245.根據實施方案243或244所述的方法,其中與所述經修飾的PBMC一起孵育的所述第二佐劑的濃度在約0.1μM與約10μM之間。

246.根據實施方案243-245中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中與所述經修飾的PBMC一起孵育的所述第二佐劑的濃度是約1μM。

247.一種刺激個體的免疫應答的方法,其包括:向所述個體施用與抗原締合的多種PBMC,其中所述多種經修飾的PBMC通過包括以下步驟的方法制備:

a)將多種輸入PBMC與抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原與所述輸入PBMC的細胞表面締合,從而產生與所述抗原締合的所述多種PBMC;以及

b)向所述個體施用所述多種經修飾的PBMC。

248.根據實施方案215-247中任一項所述的方法,其還包括向所述個體施用佐劑。

249.根據實施方案248所述的方法,其中在向所述個體施用所述多種經修飾的PBMC之前、同時或之后施用所述佐劑。

250.包含抗原的多種PBMC,其用于在根據實施方案215-245和247-249中任一項所述的刺激個體的免疫應答的方法中使用。

251.一種用于產生包含抗原的經調理的多種PBMC的方法,其包括將包含所述抗原的多種PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種PBMC。

252.一種用于產生包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

253.一種用于產生包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使編碼所述抗原的核酸通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與編碼所述抗原的核酸一起孵育足夠的時間,以允許編碼所述抗原的核酸進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含編碼所述抗原的核酸的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含編碼所述抗原的核酸的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間,以調理包含編碼所述抗原的核酸的所述經修飾的PBMC,

其中所述核酸在所述PBMC中表達以產生所述抗原,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

254.根據實施方案252所述的方法,其還包括在與所述佐劑一起孵育之前,從所述細胞懸浮液中分離出包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC。

255.根據實施方案253所述的方法,其還包括在與所述佐劑一起孵育之前,從所述細胞懸浮液中分離出包含編碼所述抗原的核酸的所述多種經修飾的PBMC。

256.一種用于產生包含抗原的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;以及

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC。

257.一種用于產生包含抗原的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使編碼所述抗原的核酸通過以形成多種擾動的輸入PBMC;以及

b)將所述多種擾動輸入PBMC與編碼所述抗原的核酸一起孵育足夠的時間,以允許編碼所述抗原的核酸進入所述擾動的輸入PBMC,

其中所述核酸在所述PBMC中表達以產生所述抗原,從而產生包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC。

258.一種用于產生包含抗原和佐劑的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原和所述佐劑通過以形成多種擾動的輸入PBMC;以及

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原和所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原和所述佐劑進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和佐劑的所述多種經修飾的PBMC。

259.一種用于產生包含抗原和佐劑的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使編碼所述抗原的核酸和所述佐劑通過以形成多種擾動的輸入PBMC;以及

b)將所述多種擾動輸入PBMC與編碼所述抗原的核酸并與所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許編碼所述抗原的核酸和所述佐劑進入所述擾動的輸入PBMC,

其中所述核酸在所述PBMC中表達以產生所述抗原,從而產生包含所述抗原和佐劑的所述多種經修飾的PBMC。

260.一種產生包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:

a)將多種輸入PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述輸入PBMC,從而產生經調理的多種輸入PBMC;

b)使包含所述經調理的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成經調理的多種擾動的輸入PBMC;以及

c)將所述經調理的多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

261.一種產生包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:

a)將多種輸入PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理所述輸入PBMC,從而產生經調理的多種輸入PBMC;

b)使包含所述經調理的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使編碼所述抗原的核酸通過以形成經調理的多種擾動的輸入PBMC;以及

c)將所述經調理的多種擾動輸入PBMC與編碼所述抗原的核酸一起孵育足夠的時間,以允許編碼所述抗原的核酸進入所述擾動的輸入PBMC,

其中所述核酸在所述PBMC中表達以產生所述抗原,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

262.一種用于產生包含抗原和佐劑的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:

a)使包含含有佐劑的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;以及

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和所述佐劑的所述多種經修飾的PBMC。

263.一種用于產生包含抗原和佐劑的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:

a)使包含含有佐劑的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使編碼抗原的核酸通過以形成多種擾動的輸入PBMC;以及

b)將所述多種擾動輸入PBMC與編碼所述抗原的核酸一起孵育足夠的時間,以允許編碼所述抗原的核酸進入所述擾動的輸入PBMC,

其中所述核酸在所述PBMC中表達以產生所述抗原,從而產生包含所述抗原和所述佐劑的所述多種經修飾的PBMC。

264.一種用于產生包含抗原和佐劑的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:

a)使包含含有抗原的多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使佐劑通過以形成多種擾動的輸入PBMC;以及b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述佐劑一起孵育足夠的時間,以允許所述佐劑進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原和所述佐劑的所述多種經修飾的PBMC。

265.根據實施方案219-245、247-248和251-264中任一項所述的方法,其中所述方法還包括以下步驟:將所述輸入PBMC和/或所述經修飾的PBMC與如下藥劑一起孵育,與在沒有所述進一步孵育步驟的情況下制備的相應經修飾的PBMC相比,所述藥劑增強所述經修飾的PBMC的活力和/或功能。

266.根據實施方案219-245、247-249和251-265中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是所述多種輸入PBMC的平均直徑的約10%至約99%。

267.根據實施方案219-245、247-249和251-265中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是所述多種輸入PBMC的平均直徑的約10%至約70%。

268.根據實施方案219-245、247-249和251-267中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是所述多種輸入PBMC的平均直徑的約20%至約60%。

269.根據實施方案219-245、247-249和251-268中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是所述多種輸入PBMC的平均直徑的約30%至約45%。

270.根據實施方案219-245、247-249和251-269中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約10%至約99%。

271.根據實施方案219-245、247-249和251-270中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約10%至約70%。

272.根據實施方案219-245、247-249和251-271中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約20%至約60%。

273.根據實施方案219-245、247-249和251-272中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約30%至約45%。

274.根據實施方案219-245、247-249和251-270中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約50%至約99%。

275.根據實施方案219-245、247-249、251-270和274中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約50%至約90%。

276.根據實施方案219-245、247-249、251-270和274-275中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約50%至約80%。

277.根據實施方案219-245、247-249、251-270和274-276中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約50%至約70%。

278.根據實施方案219-245、247-249和251-270中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約60%至約90%。

279.根據實施方案219-245、247-249、251-270和278中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約60%至約80%。

280.根據實施方案219-245、247-249、251-270和278-279中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約60%至約70%。

281.根據實施方案219-245、247-249和251-280中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最大直徑的細胞亞群的平均直徑的約10%至約99%。

282.根據實施方案219-245、247-249和251-281中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最大直徑的細胞亞群的平均直徑的約10%至約70%。

283.根據實施方案219-245、247-249和251-282中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最大直徑的細胞亞群的平均直徑的約20%至約60%。

284.根據實施方案219-245、247-249和251-283中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最大直徑的細胞亞群的平均直徑的約20%至約30%。

285.根據實施方案219-245、247-249和251-284中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最大直徑的細胞亞群的平均直徑的約20%至約25%。

286.根據實施方案219-245、247-249和251-283中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最大直徑的細胞亞群的平均直徑的約30%至約45%。

287.根據實施方案270-286中任一項所述的方法,其中在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的所述細胞亞群是T細胞。

288.根據實施方案281-286中任一項所述的方法,其中在所述多種輸入PBMC內具有最大直徑的所述細胞亞群是單核細胞。

289.根據實施方案219-245、247-249和251-275中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm。

290.根據實施方案219-245、247-249和251-289中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約6μm。

291.根據實施方案219-245、247-249和251-289中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是約4μm至約10μm。

292.根據實施方案219-245、247-249和251-291中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是約4.2μm至約6μm。

293.根據實施方案219-245、247-249和251-292中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是約4.5μm。

294.根據實施方案219-245、247-249和251-293中任一項所述的方法,其中使所述多種輸入PBMC在范圍為約30psi至約90psi的壓力下通過所述縮窄部。

295.根據實施方案219-245、247-249和251-293中任一項所述的方法,其中使所述多種輸入PBMC在范圍為約207kPa至約830kPa或約415kPa至約621kPa的壓力下通過所述縮窄部。

296.根據實施方案219-245、247-249和251-295中任一項所述的方法,其中使所述多種輸入PBMC以在約0.001mL/cm2/s至約200L/cm2/s之間的流速通過所述縮窄部。

297.根據實施方案219-245、247-249和251-295中任一項所述的方法,其中使所述多種輸入PBMC以在約0.1mL/cm2/s至約150L/cm2/s之間的流速通過所述縮窄部。

298.根據實施方案219-245、247-249和251-297中任一項所述的方法,其中所述多種輸入PBMC以約100L/cm2/s的流速通過所述縮窄部。

299.根據實施方案219-245、247-249和251-298中任一項所述的方法,其中使所述多種輸入PBMC在范圍為約0℃至約37℃的溫度下通過所述縮窄部。

300.根據實施方案219-245、247-249和251-299中任一項所述的方法,其中在通過所述縮窄部之后,將所述多種經修飾的PBMC在約37℃的溫度下孵育足夠的時間,以允許所述經修飾的PBMC正?;良s37℃。

301.根據實施方案219-245、247-249和251-300中任一項所述的方法,其中在通過所述縮窄部之后,將所述多種經修飾的PBMC在約25℃的溫度下孵育足夠的時間,以允許所述經修飾的PBMC正?;良s25℃。

302.根據實施方案219-245、247-249和251-301中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的橫截面形狀選自:環形、橢圓形、圓形、正方形、矩形、星形、三角形、多邊形、五邊形、六角形、七邊形和八邊形。

303.根據實施方案219-245、247-249和251-302中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的橫截面形狀是狹縫。

304.根據實施方案303所述的方法,其中狹縫包含約3μm-6μm的寬度和/或約20μm-120μm的深度。

305.根據實施方案303所述的方法,其中所述狹縫包含約4.2μm-6μm的寬度和/或約20-120μm的深度。

306.根據實施方案303-305所述的方法,其中所述狹縫包含4.5μm的寬度和/或80μm的深度。

307.根據實施方案219-245、247-249和251-306中任一項所述的方法,其中使包含所述多種輸入PBMC的所述細胞懸浮液通過多個縮窄部,其中所述多個縮窄部串聯和/或平行排列。

308.根據實施方案219-245、247-249和251-307中任一項所述的方法,其中所述縮窄部包括入口部分和出口部分,其中:

(a)所述入口部分限定入口角度并且所述入口角度在約0度至約90度之間或是約20-22度;并且/或者

(b)所述出口部分限定出口角度并且所述出口角度在約0度至約90度之間或是約20-22度;

對于(a)和(b)優選為約20-22度。

309.根據實施方案219-245、247-249和251-308中任一項所述的方法,其中使包含所述多種輸入PBMC的所述細胞懸浮液通過多個縮窄部,其中所述多個縮窄部串聯和/或平行排列。

310.根據實施方案219-221、229-232、243-245、247-249、251和265-309中任一項所述的方法,其中將所述多種經修飾的PBMC與所述佐劑一起孵育約1至約24小時以調理所述經修飾的PBMC。

311.根據實施方案219-221、229-232、243-245、251和265-310中任一項所述的方法,其中將所述多種經修飾的PBMC與所述佐劑一起孵育約2至約10小時以調理所述經修飾的PBMC。

312.根據實施方案219-221、229-232、243-245、251和265-311中任一項所述的方法,其中將所述多種經修飾的PBMC與所述佐劑一起孵育約3至約6小時以調理所述經修飾的PBMC。

313.根據實施方案219-221、229-232、243-245、251和265-312中任一項所述的方法,其中將所述多種經修飾的PBMC與所述佐劑一起孵育約4小時以調理所述經修飾的PBMC。

314.根據實施方案215-245、247-249和251-313中任一項所述的方法,其中所述抗原和/或佐劑存在于多種經修飾的PBMC中的細胞的胞質溶膠和/或囊泡中。

315.根據實施方案314所述的方法,其中所述囊泡是內體。

316.根據實施方案215-245、247-249和251-315中任一項所述的方法,其中所述抗原和/或所述佐劑存在于多種經修飾的PBMC中的細胞的多個區室中。

317.根據實施方案222-228、233-237、247-249和251-316中任一項所述的方法,其中所述抗原存在于所述多種經修飾的PBMC中的細胞的胞質溶膠中并且所述佐劑存在于所述細胞的囊泡中。

318.根據實施方案215-245、247-249和251-317中任一項所述的方法,其中所述抗原結合至多種經修飾的PBMC中的細胞的表面。

319.根據實施方案215-245、247-249和251-318中任一項所述的方法,其中所述佐劑是CpG寡脫氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激動劑、RIG-I激動劑、聚I:C、R837、R848、TLR3激動劑、TLR4激動劑或TLR9激動劑。

320.根據實施方案319所述的方法,其中所述佐劑是CpG ODN。

321.根據實施方案320所述的方法,其中所述CpG ODN是A類CpG ODN、B類CpG ODN或C類CpG ODN。

322.根據實施方案215-245、247-249和251-315中任一項所述的方法,其中所述抗原是疾病相關抗原。

323.根據實施方案322所述的方法,其中所述抗原源自從患病細胞分離的肽或mRNA。

324.根據實施方案215-245、247-249和251-323中任一項所述的方法,其中所述抗原是非自身抗原。

325.根據實施方案215-245、247-249和251-324中任一項所述的方法,其中所述抗原是腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或真菌抗原。

326.根據實施方案215-245、247-249和251-325中任一項所述的方法,其中所述抗原源自腫瘤裂解物。

327.根據實施方案325所述的方法,其中所述抗原是人乳頭瘤病毒(HPV)抗原。

328.根據實施方案327所述的方法,其中所述HPV是HPV-16或HPV-18。

329.根據實施方案327或328所述的方法,其中所述抗原包含源自HPV E6和/或E7的HLA-A2限制性肽。

330.根據實施方案329所述的方法,其中所述HLA-A2限制性肽包含SEQ ID NO:1-4中任一個的氨基酸序列。

331.根據實施方案330所述的方法,其中所述抗原包含SEQ ID NO:18-25中任一個的氨基酸序列。

332.根據實施方案215-245、247-249和251-315中任一項所述的方法,其中所述經修飾的PBMC包含含有多個免疫原性表位的多種抗原。

333.根據實施方案332所述的方法,其中在向個體施用包含含有所述多種免疫原性表位的所述多種抗原的所述經修飾的PBMC之后,所述多種免疫原性表位都不降低所述個體對任何其他免疫原性表位的免疫應答。

334.根據實施方案215-245、247-249和251-333中任一項所述的方法,其中所述抗原是包含免疫原性肽表位的多肽。

335.根據實施方案334所述的方法,其中所述免疫原性肽表位與N末端側翼多肽和/或C末端側翼多肽融合。

336.根據實施方案334或335所述的方法,其中所述抗原是包含免疫原性肽表位和一個或多個異源肽序列的多肽。

337.根據實施方案334所述的方法,其中所述抗原是包含免疫原性肽表位的多肽,所述免疫原性肽表位在N末端和/或C末端側接異源肽序列。

338.根據實施方案334-337中任一項所述的方法,其中所述側翼異源肽序列源自疾病相關免疫原性肽。

339.根據實施方案334-337中任一項所述的方法,其中所述N末端側翼多肽包含SEQ ID NO:5-10中任一個的氨基酸序列和/或所述C末端側翼多肽包含SEQ ID NO:11-17中任一個的氨基酸序列。

340.根據實施方案215-245、247-249和251-323中任一項所述的方法,其中所述抗原能夠被加工成MHC I類限制性肽和/或MHC II類限制性肽。

341.根據實施方案217、222-227、233、237、239-245、247-249和251-340中任一項所述的方法,其中所述經修飾的PBMC包含濃度在約0.1μM與約1mM之間的所述佐劑。

342.根據實施方案215-245、247-249和251-325中任一項所述的方法,其中所述經修飾的PBMC包含濃度在約0.1μM與約1mM之間的所述抗原。

343.根據實施方案217、222-227、233、237、239-245、247-249和251-342中任一項所述的方法,其中所述抗原與所述佐劑的比率在約10000:1至約1:10000之間。

344.根據實施方案317所述的方法,其中所述抗原與所述佐劑的比率是約200:1。

345.根據實施方案215-245、247-249和251-344中任一項所述的方法,其中所述經修飾的PBMC包含復合物,所述復合物包含:a)所述抗原,b)所述抗原和至少一種其他抗原,c)所述抗原和所述佐劑,d)編碼所述抗原的核酸,e)編碼所述抗原的核酸和編碼一種其他抗原的至少一種其他核酸,和/或f)編碼所述抗原的核酸和所述佐劑。

346.根據實施方案215-245、247-249和251-345中任一項所述的方法,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC還包含如下藥劑,與不包含所述藥劑的相應經修飾的PBMC相比,所述藥劑增強所述經修飾的PBMC的活力和/或功能。

347.根據實施方案215-245、247-249和251-346中任一項所述的方法,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC還包含如下藥劑,與不包含所述藥劑的相應經修飾的PBMC相比,所述藥劑在凍-融循環后增強所述經修飾的PBMC的活力和/或功能。

348.根據實施方案215-245、247-249和251-347中任一項所述的方法,其中在多達1、2、3、4、5個凍-融循環之后,至少約70%、約80%或約90%的所述經調理的多種經修飾的PBMC是有活力的。

349.根據實施方案348所述的方法,其中所述藥劑是增強內吞作用的化合物、穩定劑或輔助因子。

350.根據實施方案349所述的方法,其中所述藥劑是白蛋白。

351.根據實施方案350所述的方法,其中所述白蛋白是小鼠、?;蛉税椎鞍?。

352.根據351所述的方法,其中所述藥劑是以下中的一種或多種:二價金屬陽離子、葡萄糖、ATP、鉀、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精氨酸、L-谷氨酰胺或EDTA。

353.根據實施方案351或352所述的方法,其中所述藥劑是以下中的一種或多種:丙酮酸鈉、腺嘌呤、海藻糖、右旋糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、DMSO、CS2、CS5、CS10、CS15、HEPES、甘油、谷胱甘肽、

354.根據實施方案353所述的方法,其中所述藥劑包含小鼠血清白蛋白(MSA)。

355.根據實施方案354所述的方法,其中所述藥劑包含人血清白蛋白(HSA)。

356.根據實施方案215-245、247-249和251-355中任一項所述的方法,其中將所述細胞進一步修飾以增加一種或多種共刺激分子的表達。

357.根據實施方案356所述的方法,其中所述共刺激分子是B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155、CD112或scFv抗CD28。

358.根據實施方案356所述的方法,其中所述共刺激分子是信號2效應子。

359.根據實施方案356-358中任一項所述的方法,其中所述細胞包含導致所述一種或多種共刺激分子的表達增加的核酸(例如,mRNA)。

360.根據實施方案359所述的方法,其中所述核酸是編碼所述共刺激分子的mRNA。

361.根據實施方案215-245、247-249和251-360中任一項所述的方法,其中所述細胞被進一步修飾以增加細胞因子的表達。

362.根據實施方案361所述的方法,其中所述細胞因子是IL-12、IL-2、IFN-α或IL-21。

363.根據實施方案356所述的方法,其中所述共刺激分子是信號3效應子。

364.根據實施方案361-363中任一項所述的方法,其中所述細胞包含導致所述一種或多種細胞因子的表達增加的核酸(例如,mRNA)。

365.根據實施方案364所述的方法,其中所述核酸是編碼所述細胞因子的mRNA。

366.根據實施方案215-245、247-249和251-365中任一項所述的方法,其中所述經修飾的PBMC包含進一步修飾以調節I類MHC表達。

367.根據實施方案215-245、247-249和251-366中任一項所述的方法,其中所述經修飾的PBMC包含進一步修飾以調節II類MHC表達。

368.根據實施方案366所述的方法,其中與響應于在同種異體背景下施用不包含所述進一步修飾的相應經修飾的PBMC而在個體中產生的先天性免疫應答相比,響應于在同種異體背景下施用所述經修飾的PBMC而在個體中產生的先天性免疫應答降低。

369.根據實施方案366或367所述的方法,其中與不包含所述進一步修飾的相應經修飾的PBMC在其施用的個體中的循環半衰期相比,所述經修飾的PBMC在其施用的個體中的循環半衰期增加。

370.根據實施方案215-245、247-249和251-369中任一項所述的方法,其中所述多種輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核細胞、樹突細胞或NK-T細胞中的一種或多種。

371.根據實施方案215-245、247-249和251-370中任一項所述的方法,其中所述多種輸入PBMC包含CD3+ T細胞、CD20+ B細胞、CD14+單核細胞或CD56+ NK細胞中的一種或多種。

372.根據實施方案215-245、247-249和251-371中任一項所述的方法,其中所述多種輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞,并且其中所述多種輸入PBMC中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率基本上與全血中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率相同。

373.根據實施方案215-245、247-249和251-371中任一項所述的方法,其中所述多種輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞,并且其中所述多種輸入PBMC中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率基本上與來自全血的白細胞單采術產物中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率相同。

374.根據實施方案215-245、247-249和251-373中任一項所述的方法,其中所述多種輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞,并且其中所述多種輸入PBMC中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率與全血中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率相差不超過10%。

375.根據實施方案215-245、247-249和251-374中任一項所述的方法,其中所述多種輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞,并且其中所述多種輸入PBMC中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率與全血中的T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞與總PBMC數量的比率相差不超過10%。

376.根據實施方案215-245、247-249和251-375中任一項所述的方法,其中:

(a)至少約25%的所述輸入PBMC是T細胞;

(b)至少約2.5%的所述輸入PBMC是B細胞;

(c)至少約3.5%的所述輸入PBMC是NK細胞;或者

(d)至少約4%的所述輸入PBMC是單核細胞。

377.根據實施方案215-245、247-249和251-376中任一項所述的方法,其中:

(a)至少約20%的所述經修飾的PBMC是T細胞;

(b)至少約2%的所述經修飾的PBMC是B細胞;

(c)至少約3%的所述經修飾的PBMC是NK細胞;或者

(d)至少約3%的所述經修飾的PBMC是單核細胞。

378.根據實施方案215-245、247-249和251-377中任一項所述的方法,其中:

(a)不超過約70%的所述輸入PBMC是T細胞;

(b)不超過約14%的所述輸入PBMC是B細胞;

(c)不超過約35%的所述輸入PBMC是NK細胞;或者

(d)不超過約25%的所述輸入PBMC是單核細胞。

379.根據實施方案215-245、247-249和251-378中任一項所述的方法,其中:

(a)不超過約80%的所述經修飾的PBMC是T細胞;

(b)不超過約16%的所述經修飾的PBMC是B細胞;

(c)不超過約40%的所述經修飾的PBMC是NK細胞;或者

(d)不超過約30%的所述經修飾的PBMC是單核細胞。

380.根據實施方案215-245、247-249和251-379中任一項所述的方法,其中:

(a)約25%至約70%的所述經修飾的PBMC是T細胞;

(b)約2.5%至約14%的所述經修飾的PBMC是B細胞;

(c)約3.5%至約35%的所述經修飾的PBMC是NK細胞;或者

(d)約4%至約25%的所述經修飾的PBMC是單核細胞。

381.根據實施方案215-245、247-249和251-380中任一項所述的方法,其中:

(a)所述多種經修飾的PBMC內T細胞的百分比和所述多種輸入PBMC內T細胞的百分比相差按數量計不超過10%;

(b)所述多種經修飾的PBMC內B細胞的百分比和所述多種輸入PBMC內B細胞的百分比相差按數量計不超過10%;

(c)所述多種經修飾的PBMC內NK細胞的百分比和所述多種輸入PBMC內NK細胞的百分比相差按數量計不超過10%;并且/或者

(d)所述多種經修飾的PBMC內單核細胞的百分比和所述多種輸入PBMC內單核細胞的百分比相差按數量計不超過10%。

382.根據權利要求215-245、247-249和251-378中任一項所述的方法,其中:

與所述多種輸入PBMC中的B細胞相比,所述經調理的多種經修飾的PBMC的B細胞中一種或多種共刺激分子被上調,其中所述共刺激分子是CD80或CD86。

383.根據實施方案382所述的方法,其中與多種未經調理的PBMC中的B細胞相比,所述經調理的多種經修飾的PBMC的B細胞中CD80和/或CD86被上調超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。

384.根據實施方案382或383所述的方法,其中所述共刺激分子是CD86。

385.根據實施方案382-384中任一項所述的方法,其中與多種未經調理的PBMC相比,所述經調理的經修飾的PBMC具有IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一種或多種的增加表達。

386.根據實施方案385所述的方法,其中與所述多種未經調理的PBMC相比,IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一種或多種的表達增加約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。

387.根據實施方案215-245、247-249和251-385中任一項所述的方法,其中所述經修飾的PBMC對所述個體是同種異體的。

388.根據實施方案215-245、247-249和251-385中任一項所述的方法,其中所述經修飾的PBMC對所述個體是自體的。

389.根據實施方案215-245、247-249和251-388中任一項所述的方法,其中將所述個體預調理以調節炎癥和/或免疫應答。

390.根據實施方案215-245、247-249和251-389中任一項所述的方法,其還包括向所述個體施用第三佐劑。

391.根據實施方案390所述的方法,其中所述第三佐劑是IFN-α或CpG ODN。

392.根據實施方案390所述的方法,其中所述第三佐劑是CpG7909。

393.根據實施方案390-392中任一項所述的方法,其中并行或同時施用所述多種經修飾的PBMC和所述第三佐劑。

394.根據實施方案390-392中任一項所述的方法,其中依序施用所述多種經修飾的PBMC和所述第三佐劑。

395.根據實施方案390-394中任一項所述的方法,其中在施用所述第三佐劑之前施用所述多種經修飾的PBMC。

396.根據實施方案390-395中任一項所述的方法,其中在施用所述第三佐劑之后施用所述多種經修飾的PBMC。

397.根據實施方案215-245、247-249和251-396所述的方法,其中在施用細胞因子之前、同時或之后施用所述經修飾的PBMC。

398.根據實施方案397所述的方法,其中所述細胞因子是以下中的一種或多種:IL-2、IL-7、IL-12a IL-12b或IL-15。

399.根據實施方案215-245、247-249和251-398所述的方法,其中在施用免疫檢查點抑制劑之前、同時或之后施用所述經修飾的PBMC。

400.根據實施方案399所述的方法,其中所述免疫檢查點抑制劑靶向以下中的任一種:PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、VISTA和TIM-3。

401.根據實施方案400所述的方法,其中所述免疫檢查點抑制劑靶向PD-1。

402.根據實施方案400所述的方法,其中所述免疫檢查點抑制劑靶向PD-L1。

403.根據實施方案215-245、247-249和251-402所述的方法,其中在施用治療劑之前、同時或之后施用所述經修飾的PBMC。

404.根據實施方案403所述的方法,其中所述治療劑是化學治療劑。

405.根據實施方案215-245、247-249和251-404中任一項所述的方法,其中向所述個體施用所述經修飾的PBMC導致對所述抗原具有特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的激活和/或擴增。

406.根據實施方案215-245、247-249和251-405中任一項所述的方法,其中向所述個體施用所述經修飾的PBMC導致對所述抗原具有特異性的輔助T(Th)細胞的激活和/或擴增。

407.根據實施方案215-245、247-249和251-406中任一項所述的方法,其中施用至所述個體的所述經修飾的PBMC的量在約1x104個與約1x1012個細胞之間。

408.根據實施方案407所述的方法,其中施用至所述個體的所述經修飾的PBMC的量在約1x105個與約1x1012個細胞之間。

409.根據實施方案407或408所述的方法,其中施用至所述個體的所述經修飾的PBMC的量是約5x105與約2.5x106個細胞/kg體重之間。

410.根據實施方案215-245、247-249和251-409中任一項所述的方法,其中所述方法包括多次施用所述經修飾的PBMC。

411.根據實施方案410所述的方法,其中所述方法包括約3至約9次施用。

412.根據實施方案410或411所述的方法,其中所述多種經修飾的PBMC的兩次連續施用之間的時間間隔在約1天與約30天之間。

413.根據實施方案410-412中任一項所述的方法,其中所述多種經修飾的PBMC的兩次連續施用之間的時間間隔是約21天。

414.根據實施方案215-245、247-249和251-413中任一項所述的方法,其中所述個體對于HLA-A2的表達是陽性的。

415.根據實施方案215-245、247-249和251-414中任一項所述的方法,其中所述多種經修飾的PBMC中的至少一種細胞對于HLA-A2的表達是陽性的。

416.一種用于產生包含人乳頭瘤病毒(HPV)抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

417.一種用于產生包含HPV抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,

從而產生包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

418.一種用于產生包含HPV抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

419.一種用于產生包含HPV抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,

從而產生包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

420.根據實施方案416-419中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是約4μm至約10μm。

421.根據實施方案416-420中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約6μm。

422.根據實施方案416-421中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是(a)約4.2μm至約6μm;或(b)約4.5μm。

423.根據實施方案416-422中任一項所述的方法,其中將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育(a)約2小時至約10小時;(b)約3小時至約6小時;或(c)約4小時。

424.一種用于產生包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

425.一種用于產生包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,

從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

426.一種用于產生包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

427.一種用于產生包含抗原的經調理的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,

從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

428.根據實施方案424-427中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是約4μm至約10μm。

429.根據實施方案424-428中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約6μm。

430.根據實施方案424-429中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是(a)約4.2μm至約6μm;或(b)約4.5μm。

431.根據實施方案424-430中任一項所述的方法,其中將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育(a)約2小時至約10小時;(b)約3小時至約6小時;或(c)約4小時。

432.一種用于刺激個體的針對HPV抗原的免疫應答的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;

c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC;以及

d)向所述個體施用包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

433.一種用于刺激個體的針對HPV抗原的免疫應答的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;

c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,從而產生包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC;以及

d)向所述個體施用包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

434.一種用于刺激個體的針對HPV抗原的免疫應答的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;

c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC;以及

d)向所述個體施用包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

435.一種用于刺激個體的針對HPV抗原的免疫應答的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述HPV抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述HPV抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述HPV抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述HPV抗原的多種經修飾的PBMC;

c)將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述HPV抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,從而產生包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC;以及

d)向所述個體施用包含所述HPV抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

436.根據實施方案432-435中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是約4μm至約10μm。

437.根據實施方案432-436中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約6μm。

438.根據實施方案432-437中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是(a)約4.2μm至約6μm;或(b)約4.5μm。

439.根據實施方案432-438中任一項所述的方法,其中將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育(a)約2小時至約10小時;(b)約3小時至約6小時;或(c)約4小時。

440.一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC;以及

d)向所述個體施用包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

441.一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC;以及

d)向所述個體施用包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

442.一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC;以及

d)向所述個體施用包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

443.一種用于刺激個體的免疫應答的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育約1小時至約24小時以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,其中所述CpG ODN是CpG 7909,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC;以及

d)向所述個體施用包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

444.根據實施方案440-443中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是約4μm至約10μm。

445.根據實施方案440-444中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約6μm。

446.根據實施方案440-445中任一項所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是(a)約4.2μm至約6μm;或(b)約4.5μm。

447.根據實施方案440-446中任一項所述的方法,其中將包含所述HPV抗原的所述多種經修飾的PBMC與CpG ODN一起孵育(a)約2小時至約10小時;(b)約3小時至約6小時;或(c)約4小時。

448.根據實施方案432-447中任一項所述的方法,其還包括向所述個體施用第二佐劑。

449.根據實施方案448所述的方法,其中所述第二佐劑是IFN-α或CpG ODN。

450.根據實施方案449所述的方法,其中所述第二佐劑是CpG7909。

451.根據實施方案432-450中任一項所述的方法,其中所述經調理的多種經修飾的PBMC還包含增強所述經修飾的PBMC的活力和/或功能的藥劑,任選地其中所述藥劑是以下中的一種或多種:丙酮酸鈉、腺嘌呤、海藻糖、右旋糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、DMSO、CS2、CS5、CS10、CS15、HEPES、甘油、谷胱甘肽、

452.根據實施方案432-451中任一項所述的方法,其中在施用免疫檢查點抑制劑之前、同時或之后施用所述經修飾的PBMC。

453.根據實施方案452所述的方法,其中所述免疫檢查點抑制劑靶向以下中的任一種:PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、VISTA和TIM-3。

454.根據實施方案453所述的方法,其中所述免疫檢查點抑制劑靶向PD-1。

455.根據實施方案453所述的方法,其中所述免疫檢查點抑制劑靶向PD-L1。

456.根據實施方案440-455所述的方法,其中在施用治療劑之前、同時或之后施用所述經修飾的PBMC。

457.根據實施方案456所述的方法,其中所述治療劑是化學治療劑。

另外的實施方案

1.包含抗原的多種經修飾的外周血單核細胞(PMBC),其中所述抗原對于所述經修飾的PBMC是外源的,并且其中所述多種經修飾的PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞或單核細胞中的兩種或更多種,特別地其中所述抗原是癌癥抗原,感染性疾病抗原或病毒性疾病相關抗原。

2.根據實施方案1所述的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原存在于所述多種PBMC中的至少約70%的細胞中。

3.根據實施方案1或2所述的多種經修飾的PBMC,其是經調理的多種經修飾的PBMC,特別地其中所述經修飾的PBMC包含佐劑。

4.根據實施方案3所述的多種經修飾的PBMC,其中所述抗原存在于所述多種經修飾的PBMC中的細胞的胞質溶膠中,并且所述佐劑存在于所述細胞的囊泡中。

5.根據實施方案3或4中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中與多種未經調理的PBMC中的B細胞相比,所述多種經調理的PBMC的B細胞中CD80和/或CD86被上調超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。

6.根據實施方案3-5中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中與所述多種未經調理的PBMC相比,所述多種經調理的PBMC的PBMC中IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一種或多種的表達增加超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。

7.根據實施方案1-6中任一項所述的多種經修飾的PMBC,其通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC。

8.根據實施方案3-7中任一項所述的經調理的多種經修飾的PBMC,其通過包括以下步驟的方法制備:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與所述佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的所述經調理的多種經修飾的PBMC。

9.根據實施方案1-8中任一項所述的多種經修飾的PBMC,其中:

(a)所述多種經修飾的PBMC內T細胞的百分比和所述多種輸入PBMC內T細胞的百分比相差不超過約10%;

(b)所述多種經修飾的PBMC內B細胞的百分比和所述多種輸入PBMC內B細胞的百分比相差不超過約10%;

(c)所述多種經修飾的PBMC內NK細胞的百分比和所述多種輸入PBMC內NK細胞的百分比相差不超過約10%;并且/或者

(d)所述多種經修飾的PBMC內單核細胞的百分比和所述多種輸入PBMC內單核細胞的百分比相差不超過約10%。

10.一種用于產生包含抗原的多種經修飾的PBMC的方法,其包括:

a)使包含多種輸入PBMC的細胞懸浮液通過細胞變形縮窄部,其中所述縮窄部的直徑隨所述懸浮液中的所述輸入PBMC的直徑而變化,從而引起所述輸入PBMC的擾動足夠大以使所述抗原通過以形成多種擾動的輸入PBMC;

b)將所述多種擾動的輸入PBMC與所述抗原一起孵育足夠的時間,以允許所述抗原進入所述擾動的輸入PBMC,從而產生包含所述抗原的多種經修飾的PBMC;以及任選地

c)將包含所述抗原的所述多種經修飾的PBMC與佐劑一起孵育足夠的時間以調理包含所述抗原的所述經修飾的PBMC,從而產生包含所述抗原的經調理的多種經修飾的PBMC。

11.根據實施方案7-9中任一項所述的多種經修飾的或經調理的PBMC或根據實施方案10所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最小直徑的細胞亞群的平均直徑的約60%至約90%,和/或其中所述縮窄部的直徑是在所述多種輸入PBMC內具有最大直徑的細胞亞群的平均直徑的約20%至約30%。

12.根據實施方案7-9或11中任一項所述的多種經修飾的或經調理的PBMC,或根據實施方案10或11所述的方法,其中所述縮窄部的直徑是約3μm至約10μm,特別是約3μm至約6μm。

13.根據實施方案8-9或11-12中任一項所述的經調理的多種經修飾的PBMC,或根據實施方案10-12中任一項所述的方法,其中將所述多種經修飾的PBMC與所述佐劑一起孵育約1至約24小時、特別是約2至約10小時以調理所述經修飾的PBMC。

14.根據實施方案3-9或11-13中任一項所述的經調理的多種經修飾的或經調理的PBMC,或根據實施方案10-13中任一項所述的方法,其中所述佐劑是CpG寡脫氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激動劑、RIG-I激動劑、聚I:C、R837、R848、TLR3激動劑、TLR4激動劑或TLR 9激動劑。

15.根據實施方案1-9或11-14中任一項所述的多種經修飾的或經調理的PBMC,或根據實施方案10-14中任一項所述的方法,其中所述抗原是人乳頭瘤病毒(HPV)抗原。

實施例

本領域技術人員將認識到,在本發明的范圍和精神內可以有若干種實施方案?,F在將通過參考以下非-限制性實施例更詳細地描述本發明。以下實施例進一步說明了本發明,但是當然不應該解釋為以任何方式限制本發明的范圍。

實施例1

為了研究包含抗原的經調理的多種PBMC在刺激個體的免疫應答方面的功效,產生包含HPV源性抗原的經調理的多種PBMC并且將其施用至個體。研究包含疾病抗原的經調理的PBMC作為單一療法或當與另外的治療劑(諸如PD-L1抑制劑和/或化學治療劑)組合時用作治療性疫苗的功效。

PBMC-HPV原料藥由自體PBMC組成,所述自體PBMC在MHC-I上呈遞HPV16的HLA-A02限制性E6和E7表位。大多數PBMC(>90%)由T細胞、單核細胞、NK細胞和B細胞組成。PBMC-HPV的結構的圖解呈現在圖1A中,其中所指示的線表示含有HPV16的免疫原性表位的全長E6和E7合成長肽(SLP)。最小表位分別用紅色和綠色標記。一旦被遞送,SLP就被加工以產生最小的表位,隨后在MHC-I上呈遞所述表位。

圖1A中的細胞表示PBMC-HPV細胞類型(T細胞、單核細胞、NK細胞和B細胞)中的任一種。

在PBMC-HPV原料藥的生產中用作起始物質的E6 SLP和E7 SLP示于下文中。這些肽含有HPV16的抗原性表位(以粗體字母示出)。

E6 SLP:

E7 SLP:

在制造過程中被遞送至細胞胞質溶膠中之后,這些肽被細胞處理,并且在各種PBMC細胞的MHC-I上呈遞含有抗原性表位的所得區段。E6SLP是來自天然E6蛋白的25個氨基酸的肽,其被選擇是因為其含有HLA-A2抗原性肽TIHDIILECV(SEQ ID NO:1),其已被引用為E6蛋白中的HLA-A2限制性免疫顯性表位。E7 SLP含有來自E6蛋白的側翼氨基酸內的HLA-A2限制性免疫顯性表位YMLDLQPETT(SEQ ID NO:3)。該E7表位已被廣泛引用為抗原性E7肽。發現與含有天然E7側翼序列的SLP相比,該側翼序列中的E7表位(其與天然E7蛋白不同)在體外更高效地被人抗原呈遞細胞加工和呈遞。

作為PBMC-HPV原料藥制造過程的一部分,將PBMC-HPV細胞用CpG 7909(一種刺激toll樣受體(TLR9)信號傳導的CpG寡脫氧核糖核苷酸(ODN))調理。該成熟化導致PBMC-HPV細胞產生炎性細胞因子(例如IL-6)以及B細胞上的共刺激分子(例如CD86)和MHC-I的上調。在成熟化階段之后,將PBMC-HPV原料藥洗滌以去除CpG 7909和積累的細胞因子,并且隨后配制成包含含有HPV抗原的經調理的多種PBMC的組合物(稱為SQZ-PBMC-HPV藥物產品)。

PBMC-HPV原料藥由具有遞送至胞質溶膠的E6和E7 SLP的細胞組成,并且在CpG 7909使細胞成熟化之后但在即將洗滌除去CpG 7909之前,需要配制和填充以產生SQZ-PBMC-HPV藥物產品。

為了制造藥物產品,將PBMC-HPV原料藥洗滌兩次,且隨后在溶液中配制。例如,所述溶液可以含有50%(v/v)的冷凍保存介質(諸如CS10)、30%(v/v)的低溫保存介質(諸如FRS)和20%(v/v)的白蛋白(諸如AlbukedTM 25(25%人血清白蛋白);NDC#76125-0792-10)。

在白細胞單采術后大約6-8天,患者靜脈內(IV)接受SQZ-PBMC-HPV藥物產品。SQZ PBMC-HPV藥物產品的劑量根據患者的劑量群組而變化,并且基于活細胞/kg進行給藥。

首次人體內(FIH)研究由SQZ-PBMC-HPV和SQZ-PBMC-HPV+阿特珠單抗的遞增階段和擴展階段組成。

SQZ-PBMC-HPV遞增階段包括以下群組:

(1)低細胞劑量群組,其中在初始施用之后施用SQZ-PBMC-HPV的兩次加強劑量,在初始劑量后3周一次并在初始劑量后6周一次,

(2)在低細胞劑量初始施用之后以3周間隔施用SQZ-PBMC-HPV的5次加強劑量,

(3)高細胞劑量群組,其中在初始施用之后施用SQZ-PBMC-HPV的兩次加強劑量,在3個相等的等分試樣的初始劑量后3周一次并在所述初始劑量后6周一次,

(4)高細胞劑量群組,其中在初始施用之后施用SQZ-PBMC-HPV的兩次加強劑量,在初始劑量后3周一次并在初始劑量后6周一次。在該群組中,每次將在SQZ-PBMC-HPV之后共同施用CpG 7909。

雖然FIH研究的主要焦點是評價SQZ-PBMC-HPV的施用,但本研究包括在一個群組(群組4)中評價SQZ-PBMC-HPV和CpG 7909的共同施用。群組4提供了對于后續群組和擴展階段是否共同施用CpG7909的信息。在群組4中,首先通過IV施用SQZ-PBMC-HPV,之后IV施用CpG 7909。

在針對共同施用CpG 7909的安全性、耐受性和影響分析每個群組中的至少4名患者后,與研究者一起決定在SQZ-PBMC-HPV+阿特珠單抗的遞增階段中是否將藥物產品SQZ-PBMC-HPV與CpG 7909共同施用。測試了以下群組:

(5)低細胞劑量群組+阿特珠單抗,其中在初始施用之后施用SQZ-PBMC-HPV+阿特珠單抗的兩次加強劑量,在初始劑量后3周一次并在初始劑量后6周一次,

(6)低細胞劑量群組+阿特珠單抗,其中在初始施用后以3周間隔施用SQZ-PBMC-HPV+阿特珠單抗的至少5次加強劑量(最多9次,取決于所收獲的細胞數量),

(7)高細胞劑量群組+阿特珠單抗,其中在初始施用之后施用SQZ-PBMC-HPV+阿特珠單抗的兩次加強劑量,在初始劑量后3周一次并在初始劑量后6周一次。

圖1B和圖1C分別示出了SQZ-PBMC-HPV單一療法和SQZ-PBMC-HPV+阿特珠單抗組合療法的群組治療的代表性示意圖。

對于擴展階段研究,將SQZ-PMBC-HPV作為單一療法給藥的多達3組(basket)是:

(1)在選擇的推薦階段2劑量(RP2D)方案下的HPV16陽性頭頸部鱗狀細胞癌,

(2)在選擇的推薦階段2劑量(RP2D)方案下的HPV16陽性子宮頸癌,

(3)在選擇的推薦階段2劑量(RP2D)方案下的其他HPV16陽性癌癥,

用于SQZ-PBMC-HPV+阿特珠單抗的多達3組是:

在選擇的SQZ-PBMC-HPV的推薦階段2劑量(RP2D)方案下的HPV16陽性頭頸部鱗狀細胞癌,

在選擇的SQZ-PBMC-HPV的推薦階段2劑量(RP2D)方案下的HPV16陽性子宮頸癌,

在選擇的SQZ-PBMC-HPV的推薦階段2劑量(RP2D)方案下的其他HPV16陽性癌癥

實施例2

為了對SQZ介導的至單獨免疫細胞亞組的遞送進行定量,將小鼠脾細胞負載有熒光示蹤劑分子,并且評估其活力和遞送。

方法

從C57BL/6J雌性小鼠中分離出脾細胞(20M/mL),并且使用SQZ(30、60和90psi;4μm縮窄部)負載有在RPMI中的100μg/mL熒光標記的右旋糖酐(3kDa),并且通過流式細胞術在混合脾細胞群體內測量活力和右旋糖酐向單獨免疫細胞亞組的遞送百分比。

結果

如圖2中所示,隨著壓力的增加,右旋糖酐向脾細胞的遞送百分比顯著增加(P<0.001;相對于內吞作用(Endo)的每種條件),在30和60psi條件下活力僅輕微降低,并且在90psi條件下活力較大降低。細胞群中B細胞和NK細胞尤其具有最高的遞送水平,但是在T細胞和單核細胞中仍存在可觀的遞送量。在產生最高遞送而僅對活力具有最小影響的條件(60psi)下,所有細胞亞組的遞送百分比在約15%內(所有細胞類型中為60%-75%遞送)。這些數據顯示,SQZ可以高效地將分子同時遞送至混合鼠脾細胞群體中的每個免疫細胞亞組,而對活力具有很小影響。

實施例3

為了評價不同佐劑策略的影響,將混合脾細胞和分離的B細胞負載有模型抗原,并且用佐劑進行調理和/或與所述佐劑共同注射,并且通過流式細胞術測量炎性細胞因子IFN-γ+CD8+ T細胞的相對百分比。

方法

在第0天,從雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,與通過免疫磁性分離從一組的脾細胞分離的B細胞一起通過SQZ(60psi;4μm縮窄部)負載有Ova蛋白(400μg/mL),并在單獨的培養基(R10)或具有CpG 1826(1μM)的培養基中孵育16h。在第1天,經眼眶后向雌性C57BL/6J受體小鼠(5只/組)注射100μL的媒介物(PBS)、B細胞(5x106個細胞/mL)、脾細胞(5x106個細胞/mL)或與25μg CpG1826共同注射的脾細胞。在第8天,收獲脾臟,用SIINFEKL(SEQ ID NO:54)(1μg/mL)再刺激,并且通過細胞內細胞因子染色(ICS)確定IFN-γ+CD8+ T細胞的百分比。

結果

如圖3中所示,當將脾細胞用CpG調理16h時,用負載Ova的脾細胞治療的小鼠的IFN-γ+CD8+ T細胞的百分比顯著更高(P<0.005,相對于所有其他條件;數據表示3個獨立的實驗);然而,當向小鼠共同注射CpG或用CpG成熟化的B細胞(BAPC)治療時,IFN-γ+CD8+ T細胞%沒有顯著增加。這些數據顯示,用CpG成熟化、負載Ova的脾細胞治療導致抗原特異性CD8+T細胞中炎性細胞因子產生的顯著增加,而負載Ova的B細胞或與CpG共同注射的脾細胞并沒有引起明顯的應答。

實施例4

為了確定與較低劑量的CpG共同注射的負載抗原的脾細胞是否可以引發抗原特異性應答,將脾細胞負載有模型抗原并用CpG成熟化、與CpG共同注射或用漸增劑量的CpG成熟化并共同注射,并且通過流式細胞術測量炎性細胞因子IFN-γ+CD8+ T細胞的相對百分比。

方法

在第0天,從雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且將其與通過陰性免疫磁性分離耗盡了其B細胞的脾細胞組合,從而產生更代表人PBMC的脾細胞組合物。然后將這些混合的脾細胞通過SQZ(60psi;4μm縮窄部)負載有Ova蛋白(400μg/mL),并且在單獨的培養基(R10)或具有CpG 1826(1μM)的培養基中孵育16h。在第1天經眼眶后向雌性C57BL/6J受體小鼠(5只/組)注射100μL的媒介物(PBS)、用CpG成熟化的脾細胞(1x106個細胞/小鼠)、與25μg CpG1826共同注射的脾細胞或與不同劑量的CpG(0.1-10μg)共同注射的用CpG成熟化的脾細胞。在第8天,收獲脾臟,用SIINFEKL(SEQ ID NO:54)(1μg/mL)再刺激,并且通過細胞內細胞因子染色(ICS)確定IFN-γ+CD8+ T細胞的百分比。

結果

如圖4中所示,當將脾細胞用CpG成熟化16h時,用負載Ova的脾細胞治療的小鼠的IFN-γ+CD8+ T細胞的百分比顯著更高(P<0.05,相對于未經治療的);然而,當向小鼠共同注射CpG時,相對于對照,IFN-γ+CD8+T細胞%沒有顯著增加。另外,與成熟化并與任何劑量的CpG共同注射的脾細胞相比,當將脾細胞用CpG成熟化時IFN-γ+CD8+ T細胞%的百分比沒有統計學上顯著的增加,且在5μg CpG共同注射的情況下具有明顯輕微下降。這些數據顯示,與CpG成熟化、負載Ova的脾細胞組合的CpG的共同注射不導致抗原特異性CD8+ T細胞中炎性細胞因子產生的顯著增加。

實施例5

為了確定與不同佐劑共同注射的負載抗原的脾細胞是否可以引發抗原特異性應答,將脾細胞負載有模型抗原并用CpG成熟化、與CpG共同注射或用CpG成熟化并且與CpG或IFN-α共同注射,并且通過流式細胞術測量炎性細胞因子IFN-γ+CD8+ T細胞的相對百分比。

方法

在第0天,從雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且將其與通過陰性免疫磁性分離耗盡了其B細胞的脾細胞組合,從而產生更代表人PBMC的脾細胞組合物。然后將這些混合的脾細胞通過SQZ(60psi;4μm縮窄部)負載有Ova蛋白(400μg/mL),并且在單獨的培養基(R10)或具有CpG 1826(1μM)的培養基中孵育16h。在第1天經眼眶后向雌性C57BL/6J受體小鼠(5只/組)注射100μL的媒介物(PBS)、用CpG成熟化的脾細胞(1x106個細胞/小鼠)、與1μg CpG1826共同注射的脾細胞或與CpG或10000U IFN-α共同注射的用CpG成熟化的脾細胞。在第8天,收獲脾臟,用SIINFEKL(SEQ ID NO:54)(1μg/mL)再刺激,并且通過細胞內細胞因子染色(ICS)確定IFN-γ+CD8+ T細胞的百分比。

結果

如圖5中所示,當將脾細胞用CpG成熟化16h時,用負載Ova的脾細胞治療的小鼠的IFN-γ+CD8+ T細胞的百分比是最高的,其中與未經治療的(P<0.0001)以及共同注射的CpG(P<0.005)相比時具有顯著增加。用CpG成熟化脾細胞并將其與任一種佐劑共同注射沒有顯著益處,伴有共同注射的佐劑削弱所述效應的趨勢。這些數據顯示,與CpG成熟化、負載Ova的脾細胞組合的CpG或IFN-α的共同注射不導致抗原特異性CD8+ T細胞中炎性細胞因子產生的顯著增加。

實施例6

為了確定加強抗原特異性脾細胞疫苗是否可以引發更大的抗原特異性應答,將脾細胞負載有模型抗原,用CpG成熟化,并將其注射至受體小鼠中一次(初免)或兩次(初免-加強),其中通過流式細胞術測量炎性細胞因子IFN-γ+CD8+ T細胞的相對百分比。

方法

在第-7天,從雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且將其與通過陰性免疫磁性分離耗盡了其B細胞的脾細胞組合,從而產生更代表人PBMC的脾細胞組合物。然后將這些混合的脾細胞通過SQZ(60psi;4μm縮窄部)負載有Ova蛋白(400μg/mL),并且與CpG 1826(1μM,在R10中)一起保持4h。在第-7天和/或第0天經眼眶后向雌性C57BL/6J受體小鼠(5只/組)注射100μL脾細胞(1x105-6個細胞/小鼠)。在第7天,收獲脾臟,用SIINFEKL(SEQ ID NO:54)(1μg/mL)再刺激,并且通過細胞內細胞因子染色(ICS)確定IFN-γ+CD8+ T細胞的百分比。

結果

如圖6中所示,雖然漸增的脾細胞劑量確實導致IFN-γ+CD8+ T細胞的百分比的小幅增加,但是在7天后加強劑量的添加對于所有測試的脾細胞劑量導致IFN-γ+細胞的顯著(P<0.05)增加。有趣的是,加強劑量增強在較低的細胞劑量下最為明顯,其中0.1M劑量展現出抗原特異性應答的8倍增加。這些數據顯示,對于所有測試的劑量,在初免后7天使用加強劑量導致抗原特異性CD8+ T細胞應答的顯著增強。

實施例7

為了評價細胞劑量的重要性和B細胞相對于混合脾細胞疫苗的相對功效,將細胞負載有模型抗原并用佐劑成熟化,并且通過流式細胞術測量炎性細胞因子IFN-γ+CD8+ T細胞的相對百分比。

方法

在第0天,從雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且將其與通過陰性免疫磁性分離耗盡了其B細胞的脾細胞組合,從而產生更代表人PBMC的脾細胞組合物。另外,經由陽性免疫磁性分離從雌性供體小鼠的脾臟中獲得分離的B細胞。通過SQZ(60psi;4μm縮窄部)將這些不同的細胞組合物負載有Ova蛋白(400μg/mL),并且在單獨的培養基(R10)或具有CpG 1826(1μM)的培養基中孵育16h。在第1天,經眼眶后向雌性C57BL/6J受體小鼠(5只/組)注射100μL的媒介物(PBS)、B細胞或脾細胞(0.25-4x106個細胞/mL)。在第8天,收獲脾臟,用SIINFEKL(SEQ ID NO:54)(1μg/mL)再刺激,并且通過細胞內細胞因子染色(ICS)確定IFN-γ+CD8+T細胞的百分比。

結果

如圖7中所示,用負載Ova的B細胞或脾細胞治療的小鼠的IFN-γ+CD8+ T細胞的百分比表現出正劑量應答,其中4M細胞劑量對兩種測試細胞類型均導致最高應答。通常,所有劑量的脾細胞導致的平均應答均高于其BAPC對應物,趨于顯著性。該數據顯示,更高的細胞數量趨向于增加的應答,并且脾細胞可以誘導更高的抗原特異性應答。

實施例8

為了評價CpG成熟化時間對混合脾細胞誘導抗原特異性應答的相對功效的影響,將脾細胞負載有模型抗原并用CpG成熟化不同的時間,并且通過流式細胞術測量炎性細胞因子IFN-γ+CD8+ T細胞的相對百分比。

方法

在第0天,從雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且將其與通過陰性免疫磁性分離耗盡了其B細胞的脾細胞組合,從而產生更代表人PBMC的脾細胞組合物。將脾細胞通過SQZ(60psi;4μm縮窄部)負載有Ova蛋白(400μg/mL),并且在單獨的培養基(R10)或具有CpG 1826(1μM)的培養基中孵育不同的時間。在第1天,經眼眶后向雌性C57BL/6J受體小鼠(5只/組)注射100μL的媒介物(PBS)或脾細胞(1x106個細胞/mL)。在第8天,收獲脾臟,用SIINFEKL(SEQ ID NO:54)(1μg/mL)再刺激,并且通過細胞內細胞因子染色(ICS)確定IFN-γ+CD8+ T細胞的百分比。

結果

如圖8中所示,用負載有Ova的脾細胞治療的小鼠的IFN-γ+CD8+ T細胞的百分比在更長的CpG成熟化時間下有所增加(*P<0.05,**P<0.01,#P<0.005,所有比較都是與無CpG進行的)。在至少4小時的所有成熟化時間下,觀察到應答都有顯著增加。這些數據顯示,需要SQZ后至少4小時的CpG成熟化時間才能誘導顯著的抗原特異性應答。

實施例9

為了確定在治療環境中導致腫瘤生長抑制所需的脾細胞的最小有效細胞劑量,在HPV E7表達TC1腫瘤模型中測試四種不同的脾細胞劑量,并且將腫瘤面積相對于時間作圖。

方法

在第0天,向C57BL/6J雌性小鼠的右后側腹注射TC1腫瘤細胞(50k個細胞/小鼠)。在第7天(初免),從雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且將其與通過陰性免疫磁性分離耗盡了其B細胞的脾細胞組合,從而產生更代表人PBMC的脾細胞組合物。將脾細胞經由SQZ(60psi;4μm縮窄部)負載有預復合的20μM E7 SLP(GQAEPDRAHYNIVTFSSK SDSTLRLSVQSTHVDIR(SEQ ID NO:25))+20μM小鼠血清白蛋白(M SA),并且與CpG 1826(1μM,在R10中)一起孵育4小時。在第7天,經眼眶后向雌性C57BL/6J受體小鼠(10只/組)注射100μL的媒介物(PBS)或脾細胞(0.05-1M細胞/小鼠)。在腫瘤植入后1周開始,每周兩次測量TC-1腫瘤的生長,并且與未經治療小鼠的腫瘤生長進行比較,持續30天。

結果

如圖9中所示,在來自未經治療組(無脾細胞)的小鼠與來自用漸增數量的負載HPV E7的脾細胞治療的組的小鼠之間比較通過公式((長度x寬度2)/2)測量的腫瘤生長。發現脾細胞劑量越大,腫瘤生長抑制作用越好,其中平均1M劑量導致腫瘤完全消退。30天后,在1M治療組中剩余5只無腫瘤的小鼠,而0.25M組具有3只無腫瘤的小鼠。這些數據顯示,在HPV相關癌癥的治療模型中,通過SQZ進行負載的脾細胞可以誘導腫瘤消退。

實施例10

為了確定CpG成熟化對混合群體內的B細胞的影響,將人PBMC和鼠脾細胞用CpG成熟化不同的時間,通過流式細胞術測量B細胞群體中激活標記物CD86的相對量,并且通過多路測定定量細胞因子和趨化因子的水平。

方法

從雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得鼠脾細胞,并且將其與通過陰性免疫磁性分離耗盡了其B細胞的脾細胞組合,從而產生更代表人PBMC的脾細胞組合物。將人PBMC和脾細胞在R10中與不同濃度(1-10μM)的CpG(對于人為CpG 2006,對于鼠為CpG 1826)一起孵育不同的時間(2-24h)。CpG孵育后,將細胞用R10洗滌并且通過流式細胞術評估CD86的水平,同時收集上清液并且使用多路(29路)人細胞因子/趨化因子測定分析細胞因子的水平。

結果

圖10A示出了以下結果:人(頂部)-CpG的較高10μM劑量顯示人PBMC的B細胞群體中的CD86水平在2小時后隨時間降低。較低的1μM劑量導致在所有時間點CD86水平都高于10μM,并且其還展現出雙峰時程,其中水平在2h后降低并且在24h后開始恢復。這些數據顯示,較低的CpG水平可以導致較高的B細胞激活,其中所有劑量都在最早觀察的時間點達到峰值。

鼠(底部)-對于鼠B細胞,在兩種濃度下CD86水平沒有隨時間出現明顯變化。這些數據顯示,鼠B細胞不會響應于CpG成熟化而上調CD86。

如圖10B中所示,細胞因子/趨化因子(圖10B)-來自人和小鼠趨化因子/細胞因子譜的結果表現出相似的趨勢,其中許多相同的蛋白質響應于CpG處理而增加(IFN-γ、IL-6、MIP-1B),但IL-10和IL-13僅在鼠脾細胞中增加。這些結果表明,人PBMC和鼠脾細胞對CpG具有相似的趨化因子/細胞因子應答,其中IL-10和IL-13是值得注意的例外。

實施例11

為了確定SQZ對細胞組成和MHC-I水平的影響,對人PBMC進行細胞擠壓,并且通過流式細胞術評估免疫細胞的相對百分比以及MHC-I的表面表達。

方法

在室溫下,將來自HLA-A2+供體的人PBMC與熒光標記的3kDa右旋糖酐(100μg/mL)一起孵育(內吞作用)或通過SQZ(60psi;3.5-4μm寬度)負載有所述右旋糖酐。然后經由流式細胞術分析負載的PBMC的B細胞、T細胞、NK細胞和單核細胞的相對組成,以及HLA-A2MHC-I表面表達。

結果

如圖11中所示,使用SQZ使人PBMC負載導致B細胞(CD20)、T細胞(CD3)、NK細胞(CD56)和單核細胞(CD14)的小于5%的變化,這與SQZ后MHC-I水平的輕微(12%)降低相一致。對于細胞組成和MHC-I水平兩者,3.5μm縮窄部寬度導致略微更高的改變。一并考慮,這些數據支持通過SQZ使PBMC負載不會明顯改變免疫細胞亞組的相對豐度及其MHC-I表面表達。

實施例12

為了確定SQZ對單獨細胞亞組的遞送和影響,對人PBMC進行細胞擠壓,并且通過流式細胞術評估不同免疫細胞群體的活力和熒光化合物向不同免疫細胞群體的遞送。

方法

在室溫下,將人PBMC與熒光標記的3kDa右旋糖酐(100μg/mL)一起孵育(內吞作用)或通過SQZ(60psi;3.5-4μm寬度)負載有所述右旋糖酐。然后通過流式細胞術分析負載的PBMC的活力和遞送。

結果

如圖12A和圖12B中所示,使用SQZ使人PBMC負載導致B細胞(CD20)、T細胞(CD3)、NK細胞(CD56)和單核細胞(CD14)的活力的小于10%的變化[左側]。對于3.5μm寬度縮窄部,遞送有右旋糖酐的細胞的百分比的范圍在60%(B細胞)到90%(單核細胞)之間,且4μm寬度縮窄部導致在所有細胞類型中遞送的細胞少約10%-20%。對于3.5μm寬度,每個細胞負載的右旋糖酐量對于T細胞和單核細胞有高達35倍增加,并且對于B細胞和NK細胞有約5-10倍增加。相對于3.5μm寬度,4μm寬度縮窄部通常使遞送量降低約2倍。

實施例13

為了確定向單獨細胞亞組的遞送對來自混合群體的總體功能應答的影響,將人PBMC通過SQZ負載有疾病相關抗原和標記的右旋糖酐,并且將測量刺激抗原特異性應答細胞的能力并將其與標記的化合物的遞送進行比較。

方法

在50μM E7 SLP(QLCTELQTYMLDLQPETTYCKQQLL(SEQ ID NO:23))和熒光標記的3kDa右旋糖酐(100μg/mL)的存在下通過SQZ(60psi,室溫)使來自HLA-A02+供體的人PBMC(10M細胞/mL)負載,并且通過流式細胞術對不同縮窄部寬度(3.5和4μm)之間向細胞亞組的遞送水平進行定量。然后將PBMC與E711-20特異性CD8+應答細胞以2:1刺激物:應答細胞的比率共培養,并且在IL-2(10U/mL)的存在下培養,并與未經治療的對照或與最小表位(PP-0.1μM-YMLDLQPETT(SEQ ID NO:3))一起孵育過夜的2:1刺激物:應答細胞進行比較。24h后,從每種條件下收集上清液,并且通過IFN-γELISA評估IFN-γ產生的水平。

結果

如圖13中所示,使用SQZ使人PBMC負載導致通過ELISA評估的IFN-γ產生水平增加高達約4倍(3.5μm)(頂部)。經由4μm縮窄部的遞送表現出大約一半的對E7特異性應答T細胞的抗原特異性應答水平(中間和右側-來自相同樣品的圖11數據的重新分析)。該功能效應與通過3.5μm條件對E7 SLP的較高遞送相關。這些發現顯示,增強的遞送可以導致人PBMC的細胞抗原呈遞功能性的增加。

實施例14

為了確定各種遞送參數對免疫細胞激活抗原特異性應答的能力的影響,將人PBMC通過SQZ負載有疾病相關抗原,并且將在不同SQZ條件下測量并比較刺激抗原特異性應答細胞的能力。

方法

在50μM pp65SLP(PPWQAGILARNLVPMVATVQGQNLK YQEFFWDAND(SEQ ID NO:51))的存在下通過SQZ使來自HLA-A02+供體的人PBMC(10M細胞/mL)負載,并且改變壓力(45、60psi)、溫度(室溫、冰)和縮窄部寬度(3.5-4.5μm)。然后將PBMC與pp65特異性CD8+應答細胞以2:1刺激物:應答細胞的比率共培養,在IL-2(10U/mL)的存在下培養,并與未經治療的對照或與最小表位(PP-0.1μM-NLVPMVATV(SEQ ID NO:55))一起孵育過夜的2:1刺激物:應答細胞進行比較。24h后,從每種條件下收集上清液,并且通過IFN-γELISA評估IFN-γ產生的水平。

結果

如圖14中所示,使用SQZ使人PBMC負載有pp65SLP導致通過ELISA評估的IFN-γ產生水平增加約6-9倍??s窄部寬度越窄(3.5μm)并且壓力越高(60psi)導致應答越高,其中逐漸變寬的芯片導致功能性喪失,并且該現象在室溫(頂部)與冰(底部)條件之間是保守的。一并考慮,在SQZ期間,冰可能存在輕微益處,但是所有條件都導致IFN-γ產生的顯著增加。

實施例15

為了確定CpG成熟化對人免疫細胞激活抗原特異性應答的能力的影響并且將該應答與負載的T細胞APC進行比較,將人PBMC或分離的T細胞通過SQZ負載有疾病相關抗原,并且測量刺激抗原特異性應答細胞的能力,并將其與無CpG成熟化進行比較。

方法

在50μM pp65SLP(PPWQAGILARNLVPMVATVQGQNLK YQEFFWDAND(SEQ ID NO:51))的存在下通過SQZ(45psi;對于PB MC為3μm縮窄部,4.5μm用于T細胞)使人HLA-A02+PBMC或從HLA-A02+供體的PBMC分離的T細胞(10M細胞/mL)負載。然后將PBMC與pp65特異性CD8+應答細胞以2:1刺激物:應答細胞的比率共培養,在IL-2(10U/mL)+/-CpG 2006(1μM)的存在下培養,并與未經治療的對照或與最小表位(PP-0.1μM-NLVPMVATV(SEQ ID NO:55))一起孵育過夜的2:1刺激物:應答細胞進行比較。24h后,從每種條件下收集上清液,并且通過I FN-γELISA評估IFN-γ產生的水平。

結果

如圖15中所示,在伴有或不伴有CpG的情況下,使用SQZ使人PBMC負載有pp65SLP導致比與SLP一起孵育的細胞(內吞作用)更大的IFN-γ產生。另外,相對于不與CpG共培養的情況,與CpG共培養的SQZ負載條件之間存在30%的應答增加(P<0.05;頂部)。T細胞不響應CpG成熟化,因此將T細胞條件直接與將PBMC與CpG共培養的條件進行比較,并且發現在PBMC條件下的應答幾乎加倍(P<0.001;底部)。一并考慮,這些數據顯示,CpG共培養增強了人PBMC的抗原特異性應答,并且當與負載的T細胞相比時,具有CpG的PBMC在引發該應答方面的效力是幾乎兩倍。

實施例16

為了檢查在人背景下佐劑和抗原濃度對抗原特異性應答激活的影響,將人PBMC通過SQZ負載有不同濃度的疾病相關抗原,并且測量刺激抗原特異性應答細胞的能力且在不同佐劑之間進行比較。

方法

在不同濃度的pp65SLP(PPWQAGILARNLVPMVATVQGQN LKYQEFFWDAND(SEQ ID NO:51);1、10和50μM)的存在下通過SQ Z(60psi;3.5μm縮窄部)使來自HLA-A02+供體的人PBMC(10M細胞/mL)負載。然后將PBMC與pp65特異性CD8+應答細胞以2:1刺激物:應答細胞的比率共培養,在IL-2(10U/mL)+/-CpG 2006(1μM)或R837(1μg/mL;咪喹莫特)的存在下培養,并與未經治療的對照或與最小表位(PP-0.1μM-NLVPMVATV(SEQ ID NO:55))一起孵育過夜的2:1刺激物:應答細胞進行比較。24h后,從每種條件下收集上清液,并且通過IFN-γELI SA評估IFN-γ產生的水平。

結果

如圖16中所示,雖然在伴有和不伴有佐劑下,通過SQZ負載有1μM pp65SLP的人PBMC的功能應答之間沒有顯著差異,但較高的濃度確實顯示出與佐劑共培養的顯著益處。相對于不與CpG共培養的情況,10μM pp65SLP條件顯示出在與CpG共培養的PBMC的應答的輕微但不顯著的增加,但是與無佐劑相比,當將PBMC與R837共培養時有顯著的增加(P<0.0001)。當使用50μM SLP時,該效應甚至更加明顯,其中CpG和R837導致抗原特異性應答的顯著增強(P<0.0001)。在所有情況下,在與任一種佐劑共培養均有增加的益處,但R837始終導致最高的應答,并且較高濃度的pp65SLP增強了該效應。一并考慮,這些數據顯示,在共培養期間使用佐劑增強人PBMC的抗原特異性應答,并且該效應取決于所用抗原的濃度。

實施例17

為了檢查在人背景下佐劑組成和成熟化持續時間對抗原特異性應答激活的影響,將人PBMC通過SQZ負載有疾病相關抗原,用不同的佐劑成熟化不同的孵育時間,并且測量刺激抗原特異性應答細胞的能力,并在不同的佐劑之間進行比較。

方法

在50μM pp65SLP(PPWQAGILARNLVPMVATVQGQNLK YQEFFWDAND(SEQ ID NO:51))的存在下通過SQZ(60psi;3.5μm縮窄部)使來自HLA-A02+供體的人PBMC(10M細胞/mL)負載。然后將P BMC用CpG 2006(1μM)、R837(1μg/mL;咪喹莫特)或R848(1μg/m L;瑞喹莫德)成熟化3或24h,之后在IL-2(10U/mL)的存在下與pp65特異性CD8+應答細胞以2:1刺激物:應答細胞的比率共培養,并與未經治療的對照或與最小表位(PP-0.1μM-NLVPMVATV(SEQ ID NO:55))一起孵育過夜的2:1刺激物:應答細胞進行比較。24h后,從每種條件下收集上清液,并且通過IFN-γELISA評估IFN-γ產生的水平。

結果

如圖17中所示,在伴有和不伴有佐劑下,通過SQZ負載有pp65SLP的人PBMC的功能應答之間沒有顯著差異,但用R848處理3或24h的組確實提供了最高的總體應答。這些數據顯示,在SQZ后使用佐劑成熟化PBMC可以增強抗原特異性應答,但未發現該效應導致測試的所有佐劑和時間點的應答的顯著增加。

實施例18

為了定量SQZ前或SQZ后成熟化對抗原特異性應答的影響,將鼠脾細胞負載有模型抗原,用CpG成熟化,并將其注射至受體小鼠中一次(初免)或兩次(初免-加強),且通過流式細胞術測量炎性細胞因子IFN-γ+CD8+T細胞的相對百分比。

方法

在第-1天(成熟化→SQZ)或第0天(SQZ→成熟化),從雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且在第-1天用CpG 1826(1μM,在R10中)成熟化4h(SQZ→成熟化),然后在第0天通過SQZ(30、60、90psi;4μm縮窄部)負載有Ova蛋白(400μg/mL)(SQZ→成熟化),或在第0天通過SQZ負載有Ova,之后與CpG 1826一起孵育4h。在第0天經眼眶后向雌性C57BL/6J受體小鼠(5只/組)注射100μL脾細胞(1x106個細胞/小鼠)。在第7天,收獲脾臟,用SIINFEKL(SEQ ID NO:54)(1μg/mL)再刺激,并且通過細胞內細胞因子染色(ICS)確定IFN-γ+CD8+ T細胞的百分比。

結果

如圖18中所示,雖然用于將Ova負載至脾細胞中的漸增壓力導致IFN-γ+CD8+ T細胞的百分比顯著增加(P<0.05),但是在成熟化然后SQZ負載或SQZ負載然后成熟化的脾細胞之間沒有顯著變化。這些數據顯示,對脾細胞進行負載/成熟化的順序關于體內引發抗原特異性應答的能力沒有顯著差異。

實施例19

為了確定用負載抗原的脾細胞與基于鉑的化學療法的組合共同治療動物是否有益處,在體內治療模型中測量對抗原相關腫瘤細胞的腫瘤生長抑制,且比較了多種脾細胞+/-化學療法治療方案,并將每組中小鼠的存活率相對于時間作圖。

方法

在第0天,向C57BL/6J雌性小鼠的右后側腹注射TC1腫瘤細胞(50k個細胞/小鼠;10只小鼠/組)。在第5天和第7天,根據各組向小鼠注射媒介物或順鉑(5mg/kg)。在第9天,一些動物還接受了從雌性C57BL/6J供體小鼠脾臟中獲得的脾細胞的初免,所述脾細胞經由SQZ(60psi;4μm縮窄部)負載有預復合的20μM E7 SLP(GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTL RLSVQSTHVDIR(SEQ ID NO:25))+20μM小鼠血清白蛋白(MSA),并且與CpG 1826(1μM,在R10中)一起孵育約16h。在第27天和第29天,根據概述的組向未經治療的小鼠或僅在第9天用脾細胞治療的小鼠給予1-2劑順鉑。評估每組的TC1荷瘤小鼠的存活率并將其在120天內作圖。

結果

如圖19中所示,在未經治療、用單獨的負載E7的脾細胞、單獨的1-2劑順鉑或各種組合治療的小鼠之間比較了如通過公式((長度x寬度2)/2)測量的腫瘤生長,并且繪制Kaplan-Meier存活曲線。不僅相比于未經治療的動物,而且相比于接受單獨順鉑的動物,包括脾細胞的四個治療組表現出較大的存活優勢,其中中位存活時間超過50天(并且在脾細胞+順鉑治療的情況下,在120天后仍未達到中位存活時間)。特別值得注意的是,相比于未經治療組和單獨順鉑組,單獨脾細胞治療的小鼠具有約40天的存活優勢,但即使相比于單獨脾細胞組,脾細胞+順鉑組也具有更大的存活優勢。這些數據顯示,通過SQZ負載的脾細胞可以在HPV相關癌癥的治療模型中誘導存活優勢,并且順鉑化學療法的添加進一步增強了脾細胞疫苗的存活優勢。

實施例20

為了確定在臨床規模上使用的情況下不同的SQZ參數對單獨細胞亞組的遞送和影響,在不同的溫度和壓力下對人PBMC進行細胞擠壓,并且通過流式細胞術評估不同免疫細胞群體的活力和熒光化合物向不同免疫細胞群體的遞送。

方法

在室溫下和在冰上,將人PBMC通過SQZ(50-70psi;4.5μm寬度)負載有熒光標記的3kDa右旋糖酐(100μg/mL)。然后通過流式細胞術分析負載的PBMC的活力和遞送。

結果

如圖20A和圖20B中所示,在臨床規模上使用SQZ使人PBMC負載仍然實現高達80%的細胞(冰上的單核細胞-圖20A)的成功遞送,其中在冰上進行的細胞SQZ在所有細胞亞組中導致更高的遞送細胞百分比(30%-50%增加)。相對于50psi,較高的壓力(70psi)提供了最高的遞送細胞百分比,但是在所有測試的情況下,對于整體PBMC群體,活力均高于88%。一并考慮,這些數據顯示,SQZ可用于遞送至混合群體中的多種細胞類型,并且在稍高的壓力下在冰上進行SQZ導致最佳的總體遞送。

實施例21

為了確定佐劑的成熟化+/-共同注射對負載抗原的脾細胞在治療環境中導致腫瘤生長抑制的能力的影響,將脾細胞用佐劑成熟化、與佐劑共同注射或者用佐劑成熟化并與佐劑共同注射并在HPV E7表達TC1腫瘤模型中進行測試,并且將腫瘤面積和存活率相對于時間作圖。

方法

在第0天,向C57BL/6J雌性小鼠的右后側腹注射TC1腫瘤細胞(50k個細胞/小鼠)。在第10天(初免),從雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且將其與通過陰性免疫磁性分離耗盡了其B細胞的脾細胞組合以更好模擬人PBMC,從而產生更代表人PBMC的脾細胞組合物(即,精制脾細胞)。將脾細胞經由SQZ(60psi;4μm縮窄部,室溫)負載有預復合的20μM E7 SLP(GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR(SEQ ID NO:25))+20μM小鼠血清白蛋白(MSA),并且與CpG 1826(1μM,在R10中)一起孵育4小時。在第10天,經眼眶后向雌性C57BL/6J受體小鼠(10只/組)注射100μL的媒介物(PBS)、脾細胞(1M細胞/小鼠)或脾細胞+CpG(1μg/小鼠)。在腫瘤植入后1周開始,每周兩次測量TC-1腫瘤的生長,并且與未經治療小鼠的腫瘤生長進行比較,持續32天。

結果

在來自未經治療組(無脾細胞)的小鼠與用單獨佐劑(CpG)、脾細胞或脾細胞+共同注射的佐劑治療的組的小鼠之間比較如通過公式((長度x寬度2)/2)測量的腫瘤生長。如圖21A和圖21B中所示,雖然在未經治療的動物與用單獨CpG治療的動物的腫瘤生長之間沒有可觀察到的差異(中位存活期分別為28天和32天),但負載有E7的未成熟化的脾細胞對腫瘤生長速率有輕微抑制。然而,接受成熟化、負載的脾細胞+/-共同注射CpG的組導致腫瘤消退,且在研究過程中腫瘤未達到其初始最大值。另外,截至第32天,脾細胞治療組均未達到中位生存期點。這些數據顯示,在HPV相關癌癥的治療模型中,通過SQZ進行負載并用佐劑成熟化(在伴有或不伴有佐劑共同注射下)的脾細胞可以誘導腫瘤消退。

實施例22

為了確定與不同佐劑共同注射的負載抗原的脾細胞是否可以引發抗原特異性應答,將脾細胞負載有模型抗原并用CpG成熟化、與CpG共同注射或用CpG成熟化并且與CpG或IFN-α共同注射,其中小鼠接受初免和加強,并且通過流式細胞術測量炎性細胞因子IFN-γ+CD8+ T細胞的相對百分比。

方法

在第0天,從雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且將其與通過陰性免疫磁性分離耗盡了其B細胞的脾細胞組合,從而產生更代表人PBMC的脾細胞組合物。然后將這些混合的脾細胞通過SQZ(60psi;4μm縮窄部)負載有Ova蛋白(400μg/mL),并且在單獨的培養基(R10)或具有CpG 1826(1μM)的培養基中孵育4h。在第1天經眼眶后向雌性C57BL/6J受體小鼠(5只/組)注射100μL的媒介物(PBS)、用CpG成熟化的脾細胞(1x106個細胞/小鼠)、與1μg CpG1826共同注射的脾細胞或與CpG或10000U IFN-α共同注射的用CpG成熟化的脾細胞。在第7天,以與第0天的初免相同的方式加強受體小鼠。在第14天,收獲脾臟,用SIINFEKL(SEQ ID NO:54)(1μg/mL)再刺激,并且通過細胞內細胞因子染色(ICS)確定IFN-γ+CD8+T細胞的百分比。

結果

如圖22中所示,當在伴有或不伴有CpG共同注射下將脾細胞用CpG成熟化4h時,用負載Ova的脾細胞治療的小鼠的IFN-γ+CD8+ T細胞的百分比是最高的,且在與未經治療的(P<0.0001)、未成熟化脾細胞(P<0.005)以及未成熟化脾細胞+共同注射的CpG(P<0.05)相比時具有顯著增加。雖然IFN-γ+CD8+ T細胞的百分比有輕微增加,但相對于未經治療的,與CpG共同注射的未成熟化脾細胞或與IFN-α共同注射的成熟化脾細胞沒有顯著益處。這些數據顯示,抗原特異性CD8+ T細胞中的炎性細胞因子產生的顯著增加需要CpG成熟化,并且CpG的共同注射比IFN-α的共同注射略好。

實施例23

為了評估在SQZ處理后用CpG 1826成熟化后PBMC中B細胞成熟標記物的上調,在將SQZ處理的鼠脾細胞與CpG1826一起孵育后,通過流式細胞術測量B細胞成熟標記物的上調。

方法

從雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且將其與通過陰性免疫磁性分離耗盡了其B細胞的脾細胞組合,從而產生更代表人PBMC的脾細胞組合物(即,精制脾細胞)。然后在沒有有效負載的情況下對精制鼠脾細胞進行SQZ處理,并且通過流式細胞術測量CD86和H-2Kb的水平。

結果

如通過圖23A-圖23G中的平均熒光強度(MFI)所示,四個獨立實驗證明在CpG 1826成熟化后,精制鼠脾細胞內B220+細胞(B細胞)上的CD86和鼠MHC-I(H-2Kb)表達增加。在用CpG1826成熟化之后,B220+細胞亞組(B細胞)的CD86和H-2Kb表達的增加對于SQZ處理的精制鼠脾細胞(灰色條形)和未經處理的精制鼠脾細胞(黑色條形)是相似的。這些數據表明,SQZ處理沒有改變CpG對精制鼠脾細胞內B220+細胞(B細胞)的成熟化的影響。

實施例24

為了確定與佐劑共同注射的負載抗原的PBMC是否會引發血清細胞因子水平的全身性效應,將鼠脾細胞負載有HPV抗原并用CpG成熟化,并且在伴有或不伴有CpG共同注射下將其引入小鼠中,并且通過多路細胞因子測定測量小鼠中的循環細胞因子。

方法

從雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且將其與通過陰性免疫磁性分離耗盡了其B細胞的脾細胞組合,從而產生更代表人PBMC的脾細胞組合物(即,精制脾細胞)。將精制鼠脾細胞SQZ負載有20μM E7 SLP(GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR(SEQ ID NO:25)),之后在37℃下與CpG 1826(1μM,在R10中)一起孵育4小時。向雌性C57BL/6J受體小鼠注射SQZ負載有E7 SLP的精制鼠脾細胞(M-SQZ-脾-HPV),或注射1μg CpG 1826 IV(無細胞),或注射兩者的組合(M-SQZ-脾-HPV+1μg共同注射的CpG),并且經由鼠多路(25路)細胞因子/趨化因子測定從血液中測量循環細胞因子的水平。

結果

如圖24A至圖24D中所示,在所有時間點,用SQZ負載的精制鼠脾細胞免疫的小鼠中的血清細胞因子濃度范圍(圖24C、圖24D)與在未治療對照小鼠(圖24A)中和在注射1μg CpG 1826 IV的小鼠(無細胞)(圖24B)中測得的血清細胞因子濃度范圍是可比的。這些結果表明,相對于未治療或CpG(無細胞)對照,在伴有或不伴有CpG 1826共同注射下用M-SQZ-脾-HPV免疫未導致促炎性細胞因子的產生或血清濃度的變化。在所有條件下血清細胞因子的存在進一步證明,用M-SQZ-脾-HPV免疫在血清細胞因子產生或分泌方面沒有全身性效應。

實施例25

為了研究SQZ介導的PBMC處理對過繼轉移后的循環動力學的影響,經由靜脈內注射分別將SQZ負載有E7 SLP的小鼠脾細胞(M-SQZ-脾-HPV)和未經處理的鼠脾細胞施用至小鼠,并且通過流式細胞術確定血液中循環供體鼠脾細胞隨時間變化的數量。

方法

從雌性C57BL/6J(CD45.1)供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且將其與通過陰性免疫磁性分離耗盡了其B細胞的脾細胞組合,從而產生更代表人PBMC的脾細胞組合物(即,精制脾細胞)。然后將精制鼠脾細胞SQZ負載有20μM E7 SLP(GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR(SEQ ID NO:25)),之后在37℃下與CpG 1826(1μM,在R10中)一起孵育4小時,并且將負載的精制鼠脾細胞經眼眶后注射至雌性CD45.2B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ受體小鼠(5-7只小鼠/組)中,且在施用后兩周的過程中,在以下時間點從受體小鼠收集血液(100uL):施用后30分鐘、第1天、第3天、第7天和第15天。通過流式細胞術評估循環精制鼠脾細胞隨時間變化的數量。

結果

如圖25中所示,在過繼轉移后,在免疫后兩周的過程中,M-SQZ-脾-HPV和未經處理的精制鼠脾細胞在宿主血液中表現出相似的持久性(展示來自4個獨立實驗的累積數據)。通過單因素ANOVA和Tukey事后檢驗,在任何時間點兩組之間均無統計學差異。這些研究證明,M-SQZ-脾-HPV的循環動力學與未經處理的精制鼠脾細胞在統計學上沒有差異。

實施例26

該研究的目的是對與對照細胞相比,在用M-SQZ-脾-HPV免疫后12天TC-1腫瘤的腫瘤微環境中的E7特異性CD8+ T細胞進行定量,并且在腫瘤生長模型中將E7特異性CD8+ T細胞與腫瘤清除率相關聯。

方法

在第0天,在雌性C57BL/6J小鼠(7只/組)的右后側腹中皮下注射TC-1細胞(50k/小鼠,在100μL PBS中)。在第16天,從雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且將其與通過陰性免疫磁性分離耗盡了其B細胞的脾細胞組合,從而產生更代表人PBMC的脾細胞組合物(即,精制脾細胞)。將精制鼠脾細胞SQZ負載有20μM E7 SLP(GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR(SEQ ID NO:25)),在37℃下與CpG 1826(1μM,在R10中)一起孵育4小時,并且將負載的精制鼠脾細胞經眼眶后注射至荷瘤小鼠中。在第28天(免疫后12天),切除腫瘤并且從其產生單細胞懸浮液。通過流式細胞術評估單細胞懸浮液中的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)。

結果

如圖26A中所見,在免疫后12天(即腫瘤植入后第28天),與對照小鼠(未治療)相比,用M-SQZ-脾-HPV免疫的小鼠具有腫瘤中CD8+ T細胞的百分比的44.7倍增加。在M-SQZ-脾-HPV治療的動物中,這些CD8+ T細胞中的大多數對E7抗原具有特異性,如通過四聚體染色所確定(CD8α+群體的87.2±6.0%)(圖26B)。還對腫瘤中對E-7四聚體染色呈陽性的細胞百分比進行定量(圖26C)。這證明,與未治療組相比,在免疫后12天,用M-SQZ-脾-HPV免疫顯著增加了腫瘤微環境中E7特異性CD8+ T細胞的存在(增加765倍)。如圖26D和圖26E中所示,當歸一化為腫瘤質量時,也觀察到E7特異性CD8+ T細胞的這種增加。這些數據證明,在TC-1小鼠腫瘤模型中,用M-SQZ-脾-HPV免疫導致浸潤腫瘤的E7特異性CD8+ T細胞的顯著增加。E7特異性CD8+ T細胞的增加(圖26A-圖26E)加上腫瘤體積的減少(圖26F)支持M-SQZ-脾-HPV通過擴增E7特異性效應CD8+ T細胞來減少腫瘤負荷。

實施例27

為了證明用模型抗原(Ova)進行處理的鼠脾細胞是否通過直接呈遞SIINFEKL(SEQ ID NO:54)(卵清蛋白的CD8限制性表位)來刺激OT-I CD8+ T細胞體內增殖,將MHC-I-/-小鼠用作受體以將抗原移交(hand-off)與受體小鼠中的專用APC解耦,從而允許檢查用OVA進行SQZ處理的鼠脾細胞的直接呈遞。

方法

在第0天,通過免疫磁性分離從雌性OT-I小鼠的脾細胞中分離出OT-I T細胞。在經眼眶后注射至雌性受體小鼠(WT或MHC-I-/-)(2.5*106個細胞/小鼠)中之前將分離的OT-I T細胞用CFSE染色。接下來,從雌性CD45.1C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且將其與通過陰性免疫磁性分離耗盡了其B細胞的脾細胞組合,從而產生更代表人PBMC的脾細胞組合物(即,精制脾細胞)。將精制鼠脾細胞SQZ負載有Ova(400μg/mL),在37℃下與CpG 1826(1μM,在R10中)一起孵育4小時,并且將負載的精制鼠脾細胞經眼眶后注射至受體小鼠中(5*106個細胞/小鼠)。在第3天,從受體小鼠中切除淋巴結和脾臟,并且使用流式細胞術和CFSE染色評估增殖。

結果

如圖27A-圖27D中所示,接受了SQZ負載有卵清蛋白的精制鼠脾細胞SQZ的C57BL/6J(WT)和MHC-I-/-小鼠兩者均表現出穩健的OT-I CD8+ T細胞增殖,其中在脾臟和淋巴結二者中增殖指數范圍為4-6。接受了與卵清蛋白一起孵育的精制鼠脾細胞(孵育對照,未進行SQZ處理)的WT和MHC-I-/-小鼠幾乎沒有OT-I CD8+ T細胞增殖,這證明需要SQZ處理將抗原引入精制鼠脾細胞中以供在體內直接呈遞至CD8+ T細胞。僅接受OT-I T細胞的小鼠(未刺激的過繼轉移的OT-I CD8+ T細胞的對照)未誘導CD8+ T細胞的增殖。這些結果證明,MHC-I呈遞僅限于用卵清蛋白進行處理的轉移的精制鼠脾細胞,排除了將抗原移交至在隨后CD8+ T細胞應答中起作用的受體抗原呈遞細胞(APC)的可能性。MHC-I-/-受體中OT-I CD8+ T細胞的增殖證明,SQZ處理的精制鼠脾細胞直接呈遞抗原。

實施例28

該研究通過評估共培養后抗原特異性T細胞的激活,檢查了精制鼠脾細胞內四種細胞類型(B細胞、T細胞、NK細胞和單核細胞)的抗原呈遞能力。

方法

在第0天,從雌性CD45.1 C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且將其與通過陰性免疫磁性分離耗盡了其B細胞的脾細胞組合,從而產生更代表人PBMC的脾細胞組合物(即,精制脾細胞)。然后將精制鼠脾細胞用或未用Ova(400μg/mL)進行SQZ處理,并且在37℃下與CpG 1826(1μM,在R10中)一起孵育4小時。4小時后,對SQZ負載的精制鼠脾細胞的等分試樣(5*106個細胞/小鼠)進行各種免疫磁分離,以獲得純化的單核細胞、B細胞、T細胞和NK細胞亞組。接下來,通過免疫磁性分離從雌性OT-I小鼠的脾細胞中分離出OT-I T細胞。將OT-I(1*105個細胞/孔)與精制鼠脾細胞或相應的單獨細胞亞組(用或未用OVA進行SQZ處理)共培養,并且在37℃下孵育24h。對于陽性對照(肽刺突),將SIINFEKL(SEQ ID NO:54)肽(OVA257-264-1μg/mL)添加至具有OT-I和未經處理的精制鼠脾細胞的懸浮液中,并且保持共培養的整個持續時間。然后通過流式細胞術評估T細胞激活標記物CD69。

結果

將細胞表面CD69表達用作OT-I CD8+ T細胞激活的讀出,因為在T細胞受體與在MHC-I背景下呈遞的肽抗原接合后,該標記物的表面表達增加。如圖28A至圖28E中所示,精制鼠脾細胞內的所有四種主要細胞類型(B細胞、T細胞、NK細胞和單核細胞)都能夠將抗原直接呈遞至OT-I CD8+T細胞。這些數據表明,這些細胞類型中的每一種都可以充當抗原呈遞細胞。用Ova進行SQZ處理并且用CpG 1826成熟化的所有細胞類型均向OT-I CD8+T細胞呈遞抗原,并且以與陽性對照(肽刺突)相當的水平誘導OT-I T細胞的激活。

實施例29

這項研究確定了熒光標記的HPV E6或E7 SLP或其組合是否可以通過SQZ處理在細胞內遞送,以及任何遞送的SLP是否定位于人PBMC的胞質溶膠中。

方法

將來自3個不同HLA-A*02+供體的人PBMC在冰上SQZ負載有50μM FAM標記的E6、E7或E6+E7組合,并且用AF647綴合的抗CD45抗體(質膜標記物)染色和Hoechst 33342染色(核染色)對細胞進行共染色。將僅用RPMI進行SQZ處理的人PBMC充當陰性對照。通過共焦成像確定肽的定位。具體地,在掃描盤式共焦顯微鏡上可視化任何FAM-E6和/或FAM-E7 SLP的定位。對細胞進行Z堆疊分析以確定FAM-E6和/或FAM-E7 SLP的精確定位。對于每個樣品,在來自Z堆疊中部的共焦切片上進行線掃描軌跡(即,這種切片的圖像繪示了細胞的中部),并且分析這些切片以確認SQZ處理后SLP的任何細胞內遞送。對于線掃描軌跡,選擇具有清晰FAM信號的細胞進行分析,其中沿著熒光圖像上顯示的白線穿過細胞中心(白色圓圈)跟蹤線掃描(圖29A至圖29F,頂部圖)。

結果

在SQZ處理后,觀察到在所檢查的光學切片內,FAM熒光信號被質膜包圍(圖29B、圖29D、圖29F,頂部三個圖),而在陰性對照中沒有檢測到FAM信號(圖29A、圖29C、圖29E,頂部三個圖)。大多數SQZ負載的細胞在寬場圖像中顯示出不同強度的可見細胞內SLP;然而,由于顯微鏡的動態范圍,較暗的信號可能難以可視化。線掃描軌跡顯示,當與僅顯示出質膜信號的陰性對照的軌跡(圖29A、圖29C、圖29E,底部圖)相比時,大多數FAM熒光信號在質膜信號的界限內檢測到(圖29B、圖29D、圖29F,底部圖),這表明在SQZ處理后,FAM-E6和FAM-E7 SLP位于細胞內。這表明SQZ處理將相應的SLP負載至胞質溶膠中,但檢測到一些信號與細胞核共定位(未示出)。值得注意的是,通常在蛋白酶體加工SLP以在MHC-I上呈遞的過程中從免疫原性表位裂解FAM分子。因此,在活體系統中,來自FAM標記的SLP的FAM信號將在SLP被加工并在MHC-I上呈遞時與SLP解離。然而,在這些實驗中,在SQZ處理后立即將人PBMC固定然后染色,以最大程度地減少FAM標記的SLP的這種加工。該共焦成像研究確認了通過SQZ處理將熒光標記的E6和E7 SLP(FAM-E6和FAM-E7)細胞內遞送至人PBMC中。

實施例30

為了確定負載至鼠B細胞中的疾病相關抗原是否能夠導致抗原特異性T細胞的增殖,通過SQZ處理將gp100負載至B細胞中,并且通過流式細胞術分析gp100特異性T細胞(pmel CD8+ T細胞)的增殖。

方法

將鼠B細胞保持未經處理(NC)、在室溫下與gp100合成長肽(SLP)一起孵育(孵育對照)、在gp100SLP的存在下進行SQZ處理(擠壓)或用短肽在37℃下脈沖處理1h(PP)。將B細胞(5x106個細胞/小鼠)與3μg LPS共同注射以免疫也已經接受2.5x106個CFSE標記的pmel CD8+ T細胞的小鼠。為了測量增殖,在免疫后3天評估pmel CD8+ T細胞中的CFSE稀釋度(每組n=5只小鼠)。

結果

通過SQZ處理負載有gp100的鼠B細胞導致gp100特異性T細胞增殖的顯著增加,如通過增加的CFSE稀釋度(圖30左圖)和隨后的增殖指數定量(圖30右圖)所示的。相對于未經處理的對照、肽脈沖對照或內吞作用對照,SQZ負載的B細胞的增殖具有將近5倍的增加(圖30右圖)。這些數據顯示,與將B細胞與SLP或最小表位一起孵育相比,將抗原SQZ負載至B細胞中導致對抗原特異性T細胞增殖顯著更高效的刺激。

實施例31

為了確定SQZ負載有合成長肽(SLP)的脾細胞是否可以引發保護性免疫應答,將精制脾細胞在E7合成長肽(E7 SLP)的存在下進行SQZ處理,并且隨后在植入HPV16 E6/E7表達腫瘤細胞系TC-1之前14天和7天將其施用至小鼠。

方法

從雌性CD45.1 C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且將其與通過陰性免疫磁性分離耗盡了其B細胞的脾細胞組合,從而產生更代表人PBMC的脾細胞組合物(即,精制脾細胞)。然后將精制脾細胞在含有HPV16 E7的CD8表位的SLP的存在下進行SQZ處理。用SQZ負載有E7 SLP的精制脾細胞在第-14天對小鼠進行初免,并且在第-7天進行加強。在第0天,向小鼠的右側腹上皮下植入HPV16 E6/E7陽性TC-1腫瘤細胞系。在來自未經治療組(群組I和群組II)的小鼠與用負載HPV E7的精制脾細胞治療的組的小鼠之間比較如通過公式((長度x寬度2)/2)測量的腫瘤生長。所有免疫的小鼠保持無腫瘤60天,并且隨后用皮下植入左側腹的TC-1腫瘤細胞進行再激發,并與在左側腹植入腫瘤細胞的未經治療動物的不同群組進行比較。

結果

如圖31中所示,所有用負載SQZ的精制脾細胞治療的小鼠(15/15)都受到保護而免于原發性腫瘤激發,而未經治療的動物一定患上腫瘤。再激發后,11/15只用SQZ負載的精制脾細胞治療的小鼠受到完全保護而免于腫瘤生長,這與保護性免疫記憶的形成一致。

實施例32

為了檢查使用不同劑量的E7 SLP負載的精制脾細胞(用E7合成長肽擠壓)進行加強的效應。向小鼠施用所指示劑量的SQZ負載有E7 SLP的擠壓脾細胞,所述擠壓脾細胞作為僅初免免疫在植入后第10天施用,或者作為初免/加強/加強方案在第10天、第17天和第24天施用。

方法

在第0天,向C57BL/6J雌性小鼠的右后側腹注射TC1腫瘤細胞(50k個細胞/小鼠)。在第10天(初免),從雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且將其與通過陰性免疫磁性分離耗盡了其B細胞的脾細胞組合以更好模擬人PBMC,從而產生更代表人PBMC的脾細胞組合物(即,精制脾細胞)。將精制脾細胞經由SQZ(60psi;4μm縮窄部,室溫)負載有預復合的20μM E7 SLP(GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR(SEQ ID NO:25))+20μM小鼠血清白蛋白(MSA),并且與CpG 1826(1μM,在R10中)一起孵育4小時。在第10天,經眼眶后向雌性C57BL/6J受體小鼠(10只/組)注射100μL的媒介物(PBS)、脾細胞(1M細胞/小鼠)或脾細胞(1M細胞/小鼠)+CpG(1μg/小鼠)。

為了檢查加強免疫的效應,使治療免疫小鼠的群組在第17天和第24天接受額外劑量的SQZ負載的脾細胞(初免/加強/加強)。在未經治療的小鼠與所指示治療組之間比較了如通過公式((長度x寬度2)/2)測量的腫瘤生長,直到第50天。

結果

如圖32中所示,在第10天施用的單劑量的0.1x106個SQZ負載的脾細胞在引發免疫應答方面功效不大;然而,用額外劑量的0.1x106個細胞進行加強顯著增強治療功效。另一方面,當作為單一引發劑量初免或根據初免和加強方案施用時,1.0x106個細胞的一個或多個劑量延遲腫瘤生長。

實施例33

為了確定佐劑的成熟化+/-共同注射對負載抗原的脾細胞在治療環境中導致腫瘤生長抑制的能力的影響,將脾細胞用佐劑成熟化、與佐劑共同注射或者用佐劑成熟化并與佐劑共同注射并在HPV E7表達TC1腫瘤模型中進行測試,并且將腫瘤面積和存活率相對于時間作圖。

方法

在第0天,向C57BL/6J雌性小鼠的右后側腹注射TC1腫瘤細胞(50k個細胞/小鼠)。在第10天(初免),從雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且將其與通過陰性免疫磁性分離耗盡了其B細胞的脾細胞組合以更好模擬人PBMC,從而產生更代表人PBMC的脾細胞組合物(即,精制脾細胞)。將精制脾細胞經由SQZ(60psi;4μm縮窄部,室溫)負載有預復合的20μM E7 SLP(GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR(SEQ ID NO:25))+20μM小鼠血清白蛋白(MSA),并且與CpG 1826(1μM,在R10中)一起孵育4小時。在第10天,經眼眶后向雌性C57BL/6J受體小鼠(10只/組)注射100μL的媒介物(PBS)、脾細胞(1M細胞/小鼠)或脾細胞+CpG(1μg/小鼠)。在腫瘤植入后1周開始,每周兩次測量TC-1腫瘤的生長,并且與未經治療小鼠的腫瘤生長進行比較,持續60天。

結果

在來自未經治療組(無脾細胞)的小鼠與用單獨佐劑(CpG)、脾細胞或脾細胞+共同注射的佐劑治療的組的小鼠之間比較如通過公式((長度x寬度2)/2)測量的腫瘤生長。如圖33A和圖33B中所示,雖然未經治療的動物與用單獨CpG治療的動物的腫瘤生長之間沒有可觀察到的差異(中位存活期分別為28天和32天),但負載有E7的未成熟化的脾細胞對腫瘤生長速率有輕微抑制(中位存活期為35天)。然而,在伴有或不伴有CpG的共同注射下接受成熟化、負載的脾細胞的組導致腫瘤消退,在研究過程中腫瘤未達到其初始最大值(中位存活期分別為53天和56天)。這些數據顯示,在HPV相關癌癥的治療模型中,通過SQZ進行負載并用佐劑成熟化(在伴有或不伴有佐劑共同注射下)的脾細胞可以誘導腫瘤消退。

實施例34

為了評估小鼠脾細胞內包含的主要細胞亞組對SQZ遞送抗原的MHC-I呈遞,將精制鼠脾細胞SQZ負載有OVA,并且隨后使用25-D1.16抗體經由流式細胞術分析亞組中的呈遞。25-D1.16抗體僅當小鼠細胞表面上的H-2Kb(MHC-I)呈遞來自卵清蛋白的免疫顯性CD8+ T細胞表位(SIINFEKL(SEQ ID NO:54))時與所述H-2Kb(MHC-I)特異性結合。

方法

從雌性CD45.1 C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且將其與通過陰性免疫磁性分離耗盡了其B細胞的脾細胞組合,從而產生更代表人PBMC的脾細胞組合物(即,精制脾細胞)。然后將精制脾細胞在沒有負荷的情況下進行SQZ處理(僅SQZ)或在卵清蛋白的存在下進行SQZ處理(SQZ+OVA)。在所指示時間點,用包括25-D1.16抗體的抗體組對細胞進行染色以評估每種所指示細胞類型的H-2Kb上的SIINFEKL(SEQ ID NO:54)呈遞,并且通過流式細胞術進行分析(T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞)。

結果

如圖34中所示,對于在OVA的存在下進行SQZ處理的細胞,在2小時和4小時的時間點可檢測到單核細胞、T細胞、B細胞和NK細胞的抗原呈遞。這從相對于未用OVA進行SQZ處理的細胞(僅SQZ)增加的來自25-D1.16抗體染色的信號顯而易見。在SQZ處理后2和4小時,可檢測到T細胞、B細胞和NK細胞的≥40%的熒光強度增加。對于單核細胞,在SQZ處理后2和4小時,熒光強度的增加≥10%。

實施例35

為了證明用腫瘤抗原(HPV16 E7)處理的鼠脾細胞是否刺激E7特異性T細胞增殖,用SQZ負載有E7 SLP的精制鼠脾細胞免疫小鼠,并且通過細胞內細胞因子染色測量抗原再刺激時的內源性T細胞應答。

方法

從雌性CD45.1 C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且將其與通過陰性免疫磁性分離耗盡了其B細胞的脾細胞組合,從而產生更代表人PBMC的脾細胞組合物(即,精制脾細胞)。將精制鼠脾細胞SQZ負載有E7 SLP(20μM),在37℃下與CpG 1826(1μM,在R10中)一起孵育4小時,并且將負載的精制鼠脾細胞以100萬、25萬或10萬個細胞/小鼠經眼眶后注射至C57BL/6J受體小鼠中。對照小鼠保持未經治療。免疫后7天,從受體小鼠中收獲脾臟,并且用E7最小表位離體再刺激。進行細胞內細胞因子染色以確定響應于E7識別產生干擾素-γ的內源性CD8T細胞的百分比。

結果

如圖35中所示,接受100萬個SQZ負載有E7 SLP的精制鼠脾細胞的小鼠在脾臟中表現出穩健的E7特異性CD8+ T細胞增殖,如當用E7最小表位離體刺激受體小鼠脾臟時IFN-γ分泌的顯著誘導所說明的。接受25萬個SQZ負載有E7 SLP的精制鼠脾細胞的小鼠也在脾臟中表現出穩健的E7特異性CD8+ T細胞增殖,如當用E7最小表位離體刺激受體小鼠脾臟時可觀察到的IFN-γ誘導所說明的。相比之下,未經治療的動物沒有表現出任何可觀察到的E7特異性CD8+ T細胞增殖,如通過當用E7最小表位離體刺激脾臟時IFN-γ分泌的缺乏所說明的。

實施例36

該研究的目的是與對照細胞相比,在用M-SQZ-脾-HPV或用肽疫苗(E7 SLP+CpG)免疫后12天,對TC-1腫瘤的腫瘤微環境中的E7特異性CD8+ T細胞進行定量,并且將E7特異性CD8+ T細胞與腫瘤生長模型中的腫瘤清除率相關聯。

方法

在第0天,在雌性C57BL/6J小鼠(7只/組)的右后側腹中皮下注射TC-1細胞(50k/小鼠,在100μL PBS中)。在第16天,從雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且將其與通過陰性免疫磁性分離耗盡了其B細胞的脾細胞組合,從而產生更代表人PBMC的脾細胞組合物(即,精制脾細胞)。將精制鼠脾細胞SQZ負載有20μM E7 SLP(GQAEPDRAHYNI VTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR(SEQ ID NO:25)),在37℃下與CpG 1826(1μM,在R10中)一起孵育4小時,并且將負載的精制鼠脾細胞IV(經眼眶后)注射至荷瘤小鼠中。對于接受肽疫苗的小鼠,在第16天向受體小鼠皮下(每只小鼠)注射150μg E7 SLP和50μg CpG。對照小鼠保持未經治療。

在第28天(免疫后12天),切除腫瘤并且從其產生單細胞懸浮液。通過流式細胞術評估單細胞懸浮液中的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)。

結果

如圖36A中所見,在免疫后12天(即腫瘤植入后第28天),與接受肽疫苗的小鼠或對照小鼠相比,用M-SQZ-脾-HPV免疫的小鼠在腫瘤微環境內的活細胞中具有顯著增加的CD45+白細胞。在腫瘤中的這些白細胞中,與對照小鼠(<5%)和接受肽疫苗的小鼠(<20%)相比,用M-SQZ-脾-HPV免疫的小鼠具有顯著更高的CD8+ T細胞百分比(>30%)(圖36B)。此外,與對照小鼠(<5%)和接受肽疫苗的小鼠(<40%)相比,在M-SQZ-脾-HPV治療的動物中,這些CD8+ T細胞中的大多數(>80%)對E7抗原具有特異性,如通過四聚體染色確定的(圖36C)。如圖36D中所見,與未經治療的小鼠或用肽疫苗治療的小鼠(其中腫瘤生長未受抑制)相比,M-SQZ-脾-HPV的施用在免疫后4天開始導致腫瘤體積的消退。一并考慮,這些數據證明,在TC-1小鼠腫瘤模型中,用M-SQZ-脾-HPV免疫導致浸潤腫瘤的E7特異性CD8+ T細胞的顯著增加。E7特異性CD8+ T細胞的增加(圖36A-圖36C)加上腫瘤體積的減少(圖36D)支持M-SQZ-脾-HPV通過擴增E7特異性效應CD8+ T細胞來減少腫瘤負荷。

實施例37

該研究的目的是證明人PBMC的SQZ負載的可擴展性。在制造規模上在右旋糖酐的存在下對人PBMC進行SQZ處理,并且評估有效負載遞送和PBMC活力。

方法

獲得含有健康HLA-A2+供體的外周血的Leukopak(HEMACA),并且經由淘析分離PBMC。將所得PBMC重懸于120mL RPMI中以獲得濃度為7.20x107個細胞/mL的PBMC懸浮液。然后將RBC懸浮液(i)孵育,或(ii)在熒光右旋糖酐(3kDa右旋糖酐AF680)的存在下進行SQZ處理(50psi,4μm直徑縮窄部,2℃-8℃)。隨后,通過將SQZ處理的細胞放入1000mL的RPMI中,將SQZ處理淬滅。在孵育或SQZ處理后2小時,經由流式細胞術測量PBMC以及以下細胞類型內的每種細胞類型的活力以及熒光右旋糖酐遞送:B細胞(CD20+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)和單核細胞(CD14+)。

結果

圖37A顯示,在該實施例中描述的在制造環境中SQZ處理的細胞數量比在實驗環境中SQZ處理的細胞數量高超過3個數量級。如圖37B中所示,孵育對照與SQZ處理的PBMC之間的活力沒有顯著差異,兩者均記錄了高于80%的活力。如圖37C中所示,經由SQZ處理將3kDa右旋糖酐遞送至所有PBMC的約80%中,并且至少遞送至每種細胞類型的60%中。在SQZ處理后,使超過90%的CD14+單核細胞負載有右旋糖酐。相比之下,與右旋糖酐一起孵育的PBMC中少于10%顯示出任何遞送。一并考慮,結果顯示,SQZ介導的遞送可以用于在制造規模下高效地將有效負載遞送至PBMC中的所有組成細胞類型中,而沒有活力的任何顯著喪失。

實施例38

為了確定通過SQZ遞送引入的mRNA是否可以在PBMC亞組中翻譯和表達,在編碼CD86或IFNα2的mRNA的存在下對人PBMC進行SQZ處理,并且通過流式細胞術或細胞內染色評估CD86或IFNα2的蛋白質表達。

方法

將人PBMC保持未經處理(NC),或者在編碼CD86或IFNα2的mRNA(SQZ)或空有效負載(空SQZ)的存在下進行SQZ處理。在SQZ負載之后,通過流式細胞術在B細胞(CD19+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)和單核細胞(CD14+)的組成細胞類型中分析負載有CD86編碼mRNA的PBMC的CD86表面表達。對于用IFNα2編碼mRNA進行SQZ處理的PBMC,將負載的PBMC與GOLGIPLUG/GOLGISTOP一起孵育4小時以停止分泌,并且隨后在B細胞(CD19+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)和單核細胞(CD14+)的組成細胞類型中通過細胞內染色分析IFNα2表達。

結果

如圖38A和圖38B中所示,與未經處理的PBMC或用空有效負載進行SQZ處理的對照PBMC相比,在遞送對應編碼mRNA后,所有PBMC亞組群體在至少約40%的對應細胞中展示出CD86或IFNα2的表達。CD14+單核細胞固有地表達CD86。結果表明,可以通過SQZ遞送將mRNA引入PBMC中以高效表達編碼的蛋白質。

實施例39

為了確定通過SQZ遞送引入的候選mRNA表達的程度和持續時間的變化,將人PBMC SQZ負載有編碼CD86或4-1BBL的mRNA,并且通過流式細胞術評估CD86或4-1BBL的對應蛋白質表達。

方法

在編碼CD86或IFNα2的mRNA(SQZ)或空有效負載(空SQZ)的存在下對人PBMC進行SQZ處理。在SQZ負載之后,將負載有相應mRNA的PBMC在37℃下孵育4小時,并且在B細胞(CD19+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)和單核細胞(CD14+)的組成細胞類型中每24小時通過流式細胞術測量相應編碼蛋白的表達。

結果

圖39A和圖39B示出了SQZ負載有相應mRNA的PBMC內T細胞亞組群體中CD86和4-1BBL的表達。如圖39A中所示,在SQZ處理后4小時至48小時,與對照相比,負載有CD86編碼mRNA的PBMC內的T細胞亞組顯示出CD86+細胞百分比的顯著增加,并且CD86+細胞的百分比僅在SQZ處理后72小時輕微降低。如圖39B中所示,在SQZ處理后4小時,負載有4-1BBL編碼mRNA的PBMC內的T細胞亞組顯示出4-1BBL+細胞百分比的中度增加,并且4-1BBL+陽性細胞的百分比在僅孵育24小時后顯著降低。結果表明,不同候選mRNA的SQZ遞送可以導致編碼蛋白表達的程度和持續時間不同。

實施例40

為了確定mRNA的翻譯增強修飾是否會影響通過SQZ遞送引入的候選mRNA的表達,將人PBMC SQZ負載有未經修飾的eGFP編碼mRNA或帶有5-甲氧基尿苷骨架(5moU)的GFP編碼mRNA,并且通過流式細胞術評估對應的eGFP表達。

方法

在0至200μg/mL的未經修飾的eGFP編碼mRNA或帶有5moU骨架的GFP編碼mRNA的存在下,對人PBMC進行SQZ處理。在SQZ負載之后,將負載有相應mRNA的PBMC在37℃下孵育4小時,并且經由流式細胞術通過平均熒光強度(MFI)在B細胞(CD19+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)和單核細胞(CD14+)的組成細胞類型中測量eGFP表達。

結果

圖40示出了在SQZ負載有未經修飾的eGFP mRNA或5moU修飾的eGFP mRNA的PBMC內的T細胞亞組群體中eGFP的表達。如圖40中所示,與負載有5moU修飾的eGFP mRNA的PBMC相比,負載有未經修飾的eGFP mRNA的PBMC內的T細胞亞組顯示出更高的MFI。結果表明,5moU RNA修飾未導致通過SQZ處理遞送的mRNA的翻譯增強。

實施例41

為了確定通過SQZ遞送引入的mRNA編碼的細胞因子是否可以在PBMC亞組中翻譯、表達和分泌,將人PBMC分別SQZ負載有編碼IL-12、IFNα或IL-2的mRNA,并且通過ELISA評估IL-12、IFNα或IL-2的對應分泌。

方法

將人PBMC保持未經處理(NC),或者在編碼IL-12的mRNA(50μg/mL IL-12a和50μg/mL IL-12b mRNA)、編碼IFNα的mRNA(100μg/mL)或編碼IL-2的mRNA(SQZ)(100μg/mL)或空有效負載(空SQZ)的存在下進行SQZ處理。在SQZ負載后,然后將負載有細胞因子編碼mRNA的相應PBMC在37℃下孵育4小時,并且隨后通過ELISA測定上清液以確定相應細胞因子的表達和分泌。

結果

如圖41中所示,SQZ負載有細胞因子編碼mRNA的PBMC分別表現出IL-12、IFNα或IL-2的顯著表達和分泌。結果表明,可以通過SQZ遞送將mRNA引入PBMC中以高效表達和分泌編碼細胞因子。

實施例42

如圖42A中所說明,除了抗原呈遞細胞的T細胞受體接合(信號1)之外,免疫應答的激活還通過另外的信號(諸如共刺激受體激活(信號2)和細胞因子受體結合(信號3))而增強。為了確定通過SQZ遞送引入的mRNA是否可以翻譯并表達為這些增強信號的蛋白質效應子,將人PBMC分別SQZ負載有編碼CD70或4-1BBL的mRNA(對于信號2)和/或編碼IFNα2或IL-2的mRNA(信號3)。通過流式細胞術測量CD70或4-1BBL的對應表達,同時通過ELISA從培養上清液中測量IFNα2或IL-2的對應分泌。

方法

將人PBMC保持未經處理(NC),或者在編碼CD70、4-1BBL、IFNα2或IL-2的相應mRNA的存在下進行SQZ處理。在用編碼CD70或4-1BBL的mRNA進行SQZ處理之后,將負載有相應mRNA的PBMC在37℃下孵育4小時,并且在B細胞(CD19+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)和單核細胞(CD14+)的組成細胞類型中每24小時通過流式細胞術測量相應編碼蛋白CD70或4-1BBL的表達。在用編碼IFNα2或IL-2的mRNA進行SQZ負載后,然后將負載有相應mRNA的PBMC在37℃下孵育4小時,并且隨后在長達24小時的時間點收集上清液,并且通過ELISA測定以確定相應細胞因子IFNα2或IL-2的表達和分泌。

結果

如圖42B中所示,在遞送相應的編碼mRNA后,所有負載的PBMC亞組群體分別表現出CD70或4-1BBL的表達,如通過流式細胞術測定的平均熒光強度的增加所示出的。CD70或4-1BBL的相應表達維持至少48小時。在PBMC亞組中,單核細胞表現出SQZ遞送的編碼CD70或4-1BBL的mRNA的較高表達。如圖42C中所示,SQZ負載有細胞因子編碼mRNA的PBMC分別表現出IFNα2或IL-2的顯著表達和分泌,并且所述表達和分泌在SQZ處理后維持至少24小時。結果表明,可以通過SQZ遞送將mRNA引入PBMC中以高效表達和分泌在免疫激活方面提供增強信號的分子。

實施例43

如圖42A中所說明,除了抗原呈遞細胞的T細胞受體接合(信號1)之外,免疫應答的激活還通過另外的信號(諸如共刺激受體激活(信號2)和細胞因子受體結合(信號3))而增強。為了確定信號1激活是否會影響通過SQZ遞送引入的mRNA的翻譯和表達,在伴有或不伴有伴刀豆球蛋白A(ConA)(一種誘導信號1的非抗原依賴性絲裂原)的刺激下將精制小鼠脾細胞SQZ負載有候選mRNA(eGFP或CD86)。然后通過流式細胞術測量對應的eGFP和CD86表達。

方法

從雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且將其與通過陰性免疫磁性分離耗盡了其B細胞的脾細胞組合,從而產生更代表人PBMC的脾細胞組合物(即,精制脾細胞)。將精制鼠脾細胞保持未刺激(無ConA)或者在SQZ處理之前或之后用ConA刺激(SQZ前刺激或SQZ后刺激)。對于SQZ介導的遞送,在編碼eGFP或CD86的相應mRNA(100μg/mL)或空有效載荷(空SQZ)的存在下,對精制鼠脾細胞進行SQZ處理。在用編碼eGFP或CD86的mRNA進行SQZ處理之后,將負載有相應mRNA的精制鼠脾細胞在37℃下孵育4小時,并且在B細胞(CD19+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)和單核細胞(CD14+)的組成細胞類型中通過流式細胞術測量相應編碼蛋白eGFP或CD86的表達。

結果

如圖43A中所示,不進行ConA刺激或在SQZ負載之后通過ConA刺激的精制鼠脾細胞顯示出中度eGFP翻譯和表達,其中在流動分析中15.3%至17.0%的T細胞亞組呈GFP+。在SQZ負載之前用ConA刺激精制鼠脾細胞顯著增加eGFP翻譯和表達,其中在流動分析中91.1%的T細胞亞組呈GFP+。類似地,如圖43B中所示,不進行ConA刺激的精制鼠脾細胞顯示出中度CD86翻譯和表達,如通過與對照相比T細胞亞組群體中CD86MFI的少量增加證明的,而在SQZ負載之前用ConA刺激精制鼠脾細胞顯著增加CD86的翻譯和表達,如通過與對照相比T細胞亞組群體中CD86MFI的顯著增加證明的。這些結果表明,ConA刺激增強了通過SQZ處理遞送的候選mRNA的翻譯。

實施例44

如圖42A中所說明,除了抗原呈遞細胞的T細胞受體接合(信號1)之外,免疫應答的激活還通過另外的信號(諸如共刺激受體激活(信號2)和細胞因子受體結合(信號3))而增強。為了確定編碼信號2和信號3效應子的mRNA在鼠細胞中的表達功效和動力學,將精制鼠脾細胞SQZ負載有候選mRNA(針對信號2的CD70、CD80、CD86和OX40L;針對信號3的IL-12、IL-2和IFNα2)。通過流式細胞術測量CD70、CD80、CD86或OX40L的對應表達,同時通過ELISA從培養上清液中測量IL-12、IL-2和IFNα2的對應分泌。

方法

從雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且將其與通過陰性免疫磁性分離耗盡了其B細胞的脾細胞組合,從而產生更代表人PBMC的脾細胞組合物(即,精制脾細胞)。對于SQZ介導的遞送,在編碼CD70、CD80、CD86或OX40L的相應mRNA,或編碼IL-12、IL-2和IFNα2的mRNA(全部為100μg/mL);或空有效載荷(空SQZ)的存在下,對精制鼠脾細胞進行SQZ處理。在用編碼信號2效應子的mRNA進行SQZ處理之后,將負載有相應mRNA的精制鼠脾細胞在37℃下孵育4小時,并且通過流式細胞術在B細胞(CD19+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)和單核細胞(CD14+)的組成細胞類型中測量相應編碼蛋白CD70、CD80、CD86或OX40L的表達,持續48小時。在用編碼信號2效應子的mRNA進行SQZ處理之后,將負載有相應mRNA的精制鼠脾細胞在37℃下孵育4小時,并且通過流式細胞術在B細胞(CD19+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)和單核細胞(CD14+)的組成細胞類型中測量相應編碼蛋白CD70、CD80、CD86或OX40L的表達,持續48小時。在用編碼信號3效應子(細胞因子)的mRNA進行SQZ處理后,然后將負載有相應mRNA的精制鼠脾細胞在37℃下孵育4小時,并且隨后在長達48小時的時間點收集上清液,并且進行測定以確定相應細胞因子IL-12、IL-2和IFNα2的表達和分泌(圖44A)。

結果

如圖44B中所示,SQZ負載有信號2效應子(CD70、CD80、CD86或OX40L)的精制小鼠脾細胞顯示出相應蛋白質的顯著翻譯和表達,如分別通過MFI的明顯增加所說明的。觀察到CD86表達在SQZ后持續至少48小時,CD70表達在SQZ后48小時消失,而CD80和OX40K在SQZ后24小時消失。如圖44C中所示,SQZ負載有信號3效應子(IL-12、IL-2或IFNα2)的精制鼠脾細胞顯示出相應細胞因子的顯著表達和分泌,如通過在ELISA測定中檢測到的信號的明顯增加所說明的。IL-12和IL-2分泌在SQZ后4小時顯著誘導,在SQZ后24小時輕微增加并且在48小時輕微地逐漸減少。相比之下,IFNα2分泌從SQZ后4小時至SQZ后24小時顯著增加,并且在SQZ后48小時進一步增加。這些結果表明,編碼信號2和信號3效應子的mRNA在SQZ介導的細胞內遞送后被有效翻譯和表達。然而,這些效應子的表達的持續時間和強度度因效應分子而異。

實施例45

為了確定在鼠細胞中編碼信號2和信號3效應子的mRNA是否可以在體外增強抗原特異性免疫應答,將ConA激活的小鼠脾細胞SQZ負載有OVA抗原以及候選mRNA(針對信號2的CD70、CD80、CD86;針對信號3的IL-2)。隨后將SQZ負載的精制脾細胞與OVA特異性OT-I CD8+ T細胞共培養,并且經由IFN-γ分泌的ELISA來測量OT-I T細胞的激活。

方法

從雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且將其與通過陰性免疫磁性分離耗盡了其B細胞的脾細胞組合,從而產生更代表人PBMC的脾細胞組合物(即,精制脾細胞),并且隨后用ConA激活。對于SQZ介導的遞送,在(i)OVA(5μg/mL)以及(ii)編碼CD70、CD80或CD86的相應mRNA或編碼IL-12的mRNA(全部為100μg/mL)的存在下;或者在沒有mRNA的情況下,對精制鼠脾細胞進行SQZ處理。在用編碼信號2或信號3效應子的mRNA進行SQZ處理之后,將負載有相應mRNA的精制鼠脾細胞在37℃下孵育4小時,并且與OT-I CD8+ T細胞以1:2或1:4比率共培養24小時。為了測定T細胞激活,從共培養收集上清液并且對其進行IFN-γELISA測定(圖45A)。

結果

如圖45B和圖45C中所示,SQZ負載有與信號2效應子(CD70、CD80或CD86)或信號3效應子(IL-12)組合的OVA的ConA激活的精制小鼠脾細胞顯示出OVA特異性OT-I CD8+ T細胞激活的顯著增加。當將CD86mRNA或IL-12 mRNA與OVA共同遞送至精制鼠脾細胞中時,OVA特異性T細胞應答的增加特別顯著。這些結果表明,除了能夠被翻譯和表達之外,編碼信號2和信號3效應子的mRNA還可以增強鼠脾細胞在激活抗原特異性T細胞應答中用作抗原呈遞細胞的能力。

實施例46

為了確定人PBMC中編碼抗原的mRNA是否可以在體外增強抗原特異性免疫應答,將人PBMC SQZ負載有多種可用抗原,并且隨后與相應的抗原特異性ASTARTE應答T細胞共培養,其中經由IFN-γ分泌的ELISA測量應答T細胞的激活。

方法

將人PBMC(i)保持未經處理(NC),(ii)用1μg/mL的相應肽抗原脈沖處理(PP,陽性對照)或者(iii)在100μg/mL的編碼相應抗原(E7、HSV GF1、MART-1、pp65或流感M1)的mRNA的存在下進行SQZ處理,或者(iv)用空有效負載進行SQZ處理(空SQZ)。在SQZ處理后4小時和24小時,使用蛋白質印跡分析負載的mRNA的翻譯。為了測定免疫激活,在SQZ負載后,將負載有相應抗原編碼mRNA的PBMC在37℃下孵育4小時,并且與相應抗原特異性ASTARTE應答T細胞共培養24小時。為了測量T細胞激活,從共培養物中收集上清液并且對其進行IFN-γELISA。

結果

如圖46B和圖46C中所示,在SQZ介導遞送編碼HPV16-E7和流感M1的mRNA之后,相應抗原被翻譯和表達,如通過蛋白質印跡上的清晰條帶所指示的。對于T細胞激活測定(圖46A),與經受肽脈沖(PP)的PBMC相比,SQZ負載有編碼E7、HSV GD1、MART-1或pp65抗原的mRNA的PBMC未誘導可觀察到的應答T細胞激活,如通過共培養后IFN-γ分泌的缺乏所證明的;但是SQZ負載有編碼流感M1的mRNA的PBMC強烈誘導M1特異性T細胞激活,如通過共培養后IFN-γ分泌相比于經受肽脈沖(PP)的PBMC的顯著誘導所觀察到的。這些結果表明,對于一些但并非所有抗原,使用當前方案,可以將抗原編碼mRNA用于SQZ介導的遞送,以促進抗原呈遞并刺激抗原特異性T細胞應答。

實施例47

為了比較SQZ遞送的抗原編碼mRNA和肽抗原在促進鼠免疫細胞在體外激活抗原特異性應答方面的功效,將整個鼠脾細胞SQZ負載有OVA蛋白或OVA編碼mRNA,并且隨后與OVA特異性OT-I CD8+ T細胞共培養,其中經由CD69表達測量OT-I T細胞的激活。

方法

從雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且在(i)編碼OVA的mRNA(0至250nM),或OVA蛋白(0至1250nM)的存在下,在室溫下在60psi下使用3.5μm寬度、30μm高度縮窄部進行SQZ處理。在SQZ處理后4小時和24小時,使用蛋白質印跡分析負載的mRNA的翻譯。為了測定免疫激活,在SQZ負載后,將負載有相應OVA編碼mRNA或OVA蛋白的脾細胞在37℃下孵育4小時,并且與OT-I CD8+ T細胞共培養24小時。為了測量T細胞激活,經由流式細胞術測量OT-I CD8+ T細胞上的CD69表達(圖47A)。

結果

如圖47B中所示,當在鼠脾細胞中以相同的對應摩爾濃度進行SQZ負載時,OVA編碼mRNA在促進OT-I CD8+ T細胞的激活方面比OVA蛋白顯著更有效(效力高約20倍)。在<50nM OVA mRNA的存在下進行SQZ處理的脾細胞在共培養時導致顯著百分比的表達CD69的OT-I CD8+ T細胞。相比之下,在至少1000nM OVA蛋白的存在下進行SQZ處理的脾細胞導致在共培養時實現相似百分比的CD69表達OT-I CD8+ T細胞。這些結果表明,至少對于OVA抗原,抗原編碼mRNA的脾細胞負載在促進體外激活抗原特異性T細胞應答方面比蛋白質更有效。

實施例48

為了確定在治療環境中與免疫檢查點抑制劑的組合對負載抗原的脾細胞在腫瘤生長抑制方面的能力的影響,向植入HPV E7表達TC1腫瘤模型的小鼠施用抗CTLA4注射、SQZ負載有E7 SLP的精制鼠脾細胞(M-SQZ-脾-HPV)或者施用兩者的組合,并且將腫瘤體積和存活率相對于時間作圖。

方法

在第0天,向C57BL/6J雌性小鼠的右后側腹注射TC1腫瘤細胞(50k個細胞/小鼠)。在第10天(初免),從雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟中獲得脾細胞,并且將其與通過陰性免疫磁性分離耗盡了其B細胞的脾細胞組合以更好模擬人PBMC,從而產生更代表人PBMC的脾細胞組合物(即,精制脾細胞)。將精制脾細胞SQZ負載有20μM E7 SLP(GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR(SEQ ID NO:25)),在37℃下與CpG 1826(1μM,在R10中)一起孵育4小時,并且將負載的精制鼠脾細胞IV(經眼眶后)注射至荷瘤小鼠中(M-SQZ-PBMC-HPV)(1x106個細胞/小鼠)。然后按所指示的方案向已接受過負載的脾細胞的小鼠和沒有負載的脾細胞的小鼠的群組施用抗CTLA4注射(方案1:TC-1植入后第11天、第14天、第17天;方案2:TC-1植入后第17天、第20天、第24天;方案3:TC-1植入后第24天、第28天、第31天)。對照小鼠保持未經治療。(每組10只小鼠)(圖48A、圖48B)。在腫瘤植入后1周開始,每周兩次測量TC-1腫瘤的生長,并且與未經治療小鼠的腫瘤生長進行比較,持續60天。

結果

在對照小鼠(未經治療的)與用精制的負載E7的脾臟治療的組(M-SQZ-PBMC-HPV)、用抗CTLA4(α-CTLA4)治療的組和用兩者的組合治療的組(M-SQZ-PBMC-HPV+α-CTLA4)之間比較如通過公式((長度x寬度2)/2)測量的腫瘤生長。如圖48C中所示,雖然在對照小鼠中與用單獨抗CTLA4(方案1α-CTLA4;方案2α-CTLA4;方案3α-CTLA4)治療的小鼠中的腫瘤生長之間沒有可觀察到的差異,但是用負載E7的脾細胞(M-SQZ-PBMC-HPV)初免的小鼠的腫瘤生長速率有明顯抑制。值得注意的是,負載E7的脾細胞和抗CTLA4施用的組合(M-SQZ-PBMC-HPV+α-CTLA4)在抑制TC-1腫瘤生長方面顯示出顯著的累加效應(圖48C)。

未經治療的小鼠、用單獨抗CTLA4(方案1α-CTLA4;方案2α-CTLA4;方案3α-CTLA4)治療的小鼠或用負載E7的脾細胞(M-SQZ-PBMC-HPV)初免的小鼠都在第40天或更早時患上腫瘤(圖48D)。相比之下,接受負載E7的脾細胞和抗CTLA4施用的組合(M-SQZ-PBMC-HPV+α-CTLA4)的小鼠顯示出抑制或延遲的腫瘤發展,其中對于M-SQZ-PBMC-HPV+方案1α-CTLA4、M-SQZ-PBMC-HPV+方案2α-CTLA4和M-SQZ-PBMC-HPV+方案3α-CTLA4分別有2、1和3只小鼠在第60天時是無腫瘤的(圖48E)。

與腫瘤生長抑制的結果一致,負載E7的脾細胞和抗CTLA4施用的組合在改善TC-1攜帶小鼠的存活期方面也顯示出累加效應。未經治療的小鼠顯示出中位存活期為38天,而用單獨抗CTLA4(方案1α-CTLA4;方案2α-CTLA4;方案3α-CTLA4)治療的小鼠分別顯示出中位存活期為32、33和35.5天。用負載E7的脾細胞(M-SQZ-PBMC-HPV)初免的小鼠顯示50天的輕微改善的中位存活期。值得注意的是,對于接受負載E7的脾細胞和抗CTLA4施用的組合(M-SQZ-PBMC-HPV+α-CTLA4)的小鼠,在TC-1植入之后的第60天尚未達到中位存活期(圖48F)。

這些結果表明,負載抗原的脾細胞和免疫檢查點抑制劑的治療組合在抑制腫瘤生長和改善存活期方面提供了累加益處。

序列表

序列表

<110> SQZ生物技術公司

<120> 向PBMC遞送生物分子以改變免疫應答

<130> 75032-20022.41

<140> Not Yet Assigned

<141> Concurrently Herewith

<150> US 62/948,732

<151> 2019-12-16

<150> US 62/933,304

<151> 2019-11-08

<150> US 62/886,799

<151> 2019-08-14

<150> US 62/841,089

<151> 2019-04-30

<150> EP 19161964.2

<151> 2019-03-11

<150> US 62/812,225

<151> 2019-02-28

<160> 55

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 1

Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val

1 5 10

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 2

Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu

1 5 10

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 3

Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr

1 5 10

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 4

Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe

1 5

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Leu Pro Gln Leu Ser Thr Glu Leu Gln Thr

1 5 10

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr

1 5

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213>小鼠

<400> 7

Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg

1 5

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213>小鼠

<400> 8

Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg

1 5 10

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 9

Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu

1 5 10

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213>小鼠

<400> 10

Gly Gln Ala Glu Pro Asp

1 5

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人

<400> 11

Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe

1 5 10 15

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 12

Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu

1 5

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213>小鼠

<400> 13

Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn

1 5

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213>小鼠

<400> 14

Ser Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Ser Asp Lys

1 5 10 15

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人

<400> 15

Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu

1 5 10 15

<210> 16

<211> 20

<212> PRT

<213>小鼠

<400> 16

Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His

1 5 10 15

Val Asp Ile Arg

20

<210> 17

<211> 20

<212> PRT

<213>小鼠

<400> 17

Ser Ser Lys Ser Asp Ser Thr Leu Arg Leu Ser Val Gln Ser Thr His

1 5 10 15

Val Asp Ile Arg

20

<210> 18

<211> 36

<212> PRT

<213> 智人

<400> 18

Leu Pro Gln Leu Ser Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile

1 5 10 15

Leu Glu Cys Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr

20 25 30

Asp Phe Ala Phe

35

<210> 19

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人

<400> 19

Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu

1 5 10 15

Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu

20 25

<210> 20

<211> 25

<212> PRT

<213>小鼠

<400> 20

Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp

1 5 10 15

Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn

20 25

<210> 21

<211> 35

<212> PRT

<213>小鼠

<400> 21

Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala

1 5 10 15

Phe Arg Asp Leu Ser Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val

20 25 30

Ser Asp Lys

35

<210> 22

<211> 35

<212> PRT

<213> 智人

<400> 22

Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln

1 5 10 15

Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser

20 25 30

Glu Glu Glu

35

<210> 23

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人

<400> 23

Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu

1 5 10 15

Thr Thr Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu

20 25

<210> 24

<211> 35

<212> PRT

<213>小鼠

<400> 24

Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys

1 5 10 15

Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val

20 25 30

Asp Ile Arg

35

<210> 25

<211> 35

<212> PRT

<213>小鼠

<400> 25

Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Ser

1 5 10 15

Ser Lys Ser Asp Ser Thr Leu Arg Leu Ser Val Gln Ser Thr His Val

20 25 30

Asp Ile Arg

35

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> 1, 2, (15)..(20)

<223>硫代磷酸酯堿

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(14)

<223> 磷酸二酯堿

<400> 26

ggggtcaacg ttgagggggg 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> 1, 2, (15)..(20)

<223>硫代磷酸酯堿

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(14)

<223> 磷酸二酯堿

<400> 27

gggggacgat cgtcgggggg 20

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(3), (15)..(20)

<223>硫代磷酸酯堿

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(14)

<223> 磷酸二酯堿

<400> 28

ggggacgacg tcgtgggggg g 21

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(20)

<223>硫代磷酸酯堿

<400> 29

tccatgacgt tcctgatgct 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(20)

<223>硫代磷酸酯堿

<400> 30

tccatgacgt tcctgacgtt 20

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(24)

<223>硫代磷酸酯堿

<400> 31

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 牛

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(22)

<223>硫代磷酸酯堿

<400> 32

tcgtcgttgt cgttttgtcg tt 22

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(23)

<223>硫代磷酸酯堿

<400> 33

tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc 23

<210> 34

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(26)

<223>硫代磷酸酯堿

<400> 34

tcgcgacgtt cgcccgacgt tcggta 26

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(22)

<223>硫代磷酸酯堿

<400> 35

tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(25)

<223>硫代磷酸酯堿

<400> 36

tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgat 25

<210> 37

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(29)

<223>硫代磷酸酯堿

<400> 37

tcgcgaacgt tcgccgcgtt cgaacgcgg 29

<210> 38

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 38

Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln

1 5 10 15

Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser

20 25 30

Glu Glu Glu

35

<210> 39

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 39

Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu

1 5 10 15

Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn

20 25 30

Ile Val Thr

35

<210> 40

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 40

Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys

1 5 10 15

Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val

20 25 30

Asp Ile Arg

35

<210> 41

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 41

Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu

1 5 10 15

Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser

20 25 30

Gln Lys Pro

35

<210> 42

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 42

Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro

1 5 10 15

Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp

20 25 30

<210> 43

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 43

Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile

1 5 10 15

Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr

20 25 30

<210> 44

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 44

Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp

1 5 10 15

Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn

20 25

<210> 45

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 45

Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys

1 5 10 15

Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile

20 25

<210> 46

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 46

Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr

1 5 10 15

Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu

20 25

<210> 47

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 47

His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn

1 5 10 15

Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg

20 25

<210> 48

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 48

Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu

1 5 10 15

Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys

20 25 30

<210> 49

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 49

Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg

1 5 10 15

His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr

20 25 30

<210> 50

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 50

Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg

1 5 10 15

Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu

20 25 30

<210> 51

<211> 35

<212> PRT

<213> 智人

<400> 51

Pro Pro Trp Gln Ala Gly Ile Leu Ala Arg Asn Leu Val Pro Met Val

1 5 10 15

Ala Thr Val Gln Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln Glu Phe Phe Trp Asp

20 25 30

Ala Asn Asp

35

<210> 52

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 52

Pro Pro Trp Gln Ala Gly Ile Leu Ala Arg

1 5 10

<210> 53

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人

<400> 53

Gln Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln Glu Phe Phe Trp Asp Ala Asn Asp

1 5 10 15

<210> 54

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 54

Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu

1 5

<210> 55

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 55

Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val

1 5

再多了解一些
當前第1頁1 2 
網友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1
亚洲AV无码一区二区三区人妖 ,丰满多毛的大隂户 ,粗大挺进朋友的未婚妻,欧美人与动牲交片免费
影音先锋女人av鲁色资源网 欧美成人经典三级在线观看 国产激情久久久久影院老熟女 亚洲日产无码中文字幕 国产jizzjizz麻豆全部免费 色先锋av影音先锋在线 中文字幕av无码不卡免费 亚洲精品 丰满多毛的大隂户 中文字幕av无码一区电影dvd 草莓视频在线 白丝极品老师娇喘呻吟视频 西西大胆国模人体艺 av无码久久久久不卡网站 手机看片久久国产永久免费 玩弄少妇高潮A片 国模大胆一区二区三区 黑人巨大精品欧美一区二区 精品国产第一国产综合精品 av无码久久久久不卡网站 久久免费看黄A级毛片 亚洲AV无码专区国产乱码不卡 色先锋AV影音先锋在线 jzzijzzij日本成熟少妇 亚洲日产无码中文字幕 玩弄少妇高潮A片 永久免费观看美女裸体的网站 女人与公拘交酡过程 老太婆毛多bbwbbwbbwbbw播放 特级大黄a片免费播放 中文字幕av无码不卡免费 免费看奶头视频的网站 zzijzzij亚洲日本少妇jizjiz 韩国精品无码一区二区三区 H肉动漫无码无修6080动漫网 强奷绝色年轻女教师 欧美FREESEX黑人又粗又大 国模国产精品嫩模大尺度视频 公车好紧好爽再搔一点浪一点 舌头伸进我下面很爽的动态图 各种姿势玩小处雏女视频 女邻居的大乳中文字幕 人人添人人澡人人澡人人人人 大又大粗又爽又黄少妇毛片 手机在线看永久av片免费 h肉动漫无码无修6080动漫网 手伸进内衣使劲揉搓奶头漫画 舌头伸进我下面很爽的动态图 人妻少妇伦在线无码 juliaann女医生在办公室 国产精品第一页 哒哒哒免费视频观看在线www 男人j进女人p免费视频 毛茸茸性xxxx毛茸茸毛茸茸 国产午夜福利在线观看红一片 国产在线精品一区二区三区不卡 性激烈的欧美三级视频 欧美XXXXZOZO另类特级 公车好紧好爽再搔一点浪一点 特级大黄a片免费播放 艳妇乳肉豪妇荡乳后续潘金莲 天天干天天日 国产三级精品三级男人的天堂 国产精品va在线观看无码电影 欧美人与动xxxxz0oz 孕妇奶水仑乱A级毛片免费看 日本被黑人强伦姧人妻完整版 无码永久免费AV网站不卡 丰满多毛的大隂户 欧美性白人极品1819hd 夜夜未满十八勿进的爽爽影院 男女无遮挡羞羞视频免费网站 国产粉嫩高中生第一次不戴套 精品一久久香蕉国产线看观看 亚洲日韩在线中文字幕综合 久久精品中文字幕一区 国产男女猛烈无遮挡免费视频 强奷漂亮脱肉丝袜无码视频 杨贵妃4级纵欲丰满裸体毛片 精品久久久久久中文字幕无码 欧美性白人极品1819hd 老妇肥熟凸凹丰满刺激 女邻居夹得好紧太爽了A片 H肉动漫无码无修6080动漫网 亚洲日产无码中文字幕 精品久久久久久中文字幕无码 亚洲日韩在线中文字幕综合 久久亚洲天天做日日做 男人边吃奶边添下面好爽视频 爽看1069gey男男视频 亚洲熟妇少妇任你躁在线观看 18禁黄无遮挡免费网站动漫 免费网站看v片在线18禁无码 捆绑白丝jk震动捧娇喘 jzzijzzij日本成熟少妇 中文字幕亚洲欧美在线不卡 精品国产第一国产综合精品 国产a∨国片精品青草社区 国产无遮挡裸体免费视频 久久久亚洲欧洲日产国码AⅤ 免费网站看v片在线18禁无码 国产精品视频yjizz jzzijzzij日本成熟少妇 孕妇奶水仑乱A级毛片免费看 性激烈的欧美三级视频 强奷绝色年轻女教师 juliaann女医生在办公室 丰满少妇人妻HD高清大乳在线 亚洲av无码一区二区乱子伦 久久99精品久久久久久清纯 捆绑白丝jk震动捧娇喘 亚洲日韩在线中文字幕综合 成在线人av免费无码高潮喷水 大又大粗又爽又黄少妇毛片 H肉动漫无码无修6080动漫网 韩国三级伦在线观看久 国产精品va在线观看无码电影 最刺激的交换夫妇中文字幕 俄罗斯少妇性XXXX 欧美 大陆 偷拍 精品 娇妻被生人粗大猛烈进出高潮 厕所偷窥撒尿wcpeeingtube 厕所偷窥撒尿wcpeeingtube 公车好紧好爽再搔一点浪一点 哒哒哒免费视频观看在线www 久久亚洲欧美国产精品 女人与公拘交酡过程 最刺激的交换夫妇中文字幕 亚洲人成绝费网站色www吃脚 国产又色又爽又黄刺激的视频 在厨房乱子伦在线观看 捆绑白丝jk震动捧娇喘 国产三级精品三级男人的天堂 国产又色又爽又黄刺激的视频 久久精品国产亚洲AV麻豆 JAPANESE成熟丰满熟妇 厕所偷窥撒尿wcpeeingtube 永久免费观看美女裸体的网站 韩国三级伦在线观看久 久久人人做人人妻人人玩精品 变态sm天堂无码专区 丰满少妇人妻HD高清大乳在线 亚洲国产精品无码久久一线夕 国精品午夜福利视频不卡麻豆 黑人巨大精品欧美一区二区 亚洲va中文字幕无码久久一区 18禁超污无遮挡无码免费网站 18禁无翼乌口工全彩大全 人与动人物XXXX毛片 孕妇奶水仑乱A级毛片免费看 欧美日韩一区二区综合 白丝极品老师娇喘呻吟视频 日本被黑人强伦姧人妻完整版 精品一久久香蕉国产线看观看 特级大黄a片免费播放 男同桌把我腿打开摸到高潮 H动漫无遮挡成本人H视频 永久免费观看美女裸体的网站 久久国产乱子伦精品免费女 毛茸茸性xxxx毛茸茸毛茸茸 久久精品中文字幕一区 男同桌把我腿打开摸到高潮 哒哒哒免费视频观看在线www 久久人人做人人妻人人玩精品 阳茎伸入女人的阳道免费视频 两个人日本免费完整版高清 人禽杂交18禁网站免费 老少交玩tube少老配 性欧美丰满熟妇XXXX性 免费无码不卡视频在线观看 阳茎伸入女人的阳道免费视频 国产a∨国片精品青草社区 女闺蜜把我下面摸到高潮喷水 国产成人剧情AV麻豆映画 中文字幕av无码不卡免费 美女扒开阳道口图片 国产精品久久久久精品三级 免费无码不卡视频在线观看 国产三级在线观看播放 被老头玩弄邻居人妻中文字幕 无码av免费一区二区三区 变态sm天堂无码专区 欧美人体XXXX在线观看 特级大黄a片免费播放 中文字幕av无码一区电影dvd 婷婷色婷婷开心五月四房播播 免费国产A国产片高清网站 国产真实夫妇交换视频 久久精品国产亚洲AV麻豆 顶级丰满少妇a级毛片 亚洲国产初高中生女av 精品欧美高清vivoesosex 欧美大胆A级视频 杨贵妃4级纵欲丰满裸体毛片 亚洲制服丝袜av一区二区三区 精品国产第一国产综合精品 欧美日韩一区二区综合 欧美成人经典三级在线观看 国产精品永久免费 国产激情久久久久影院老熟女 亚洲欧洲自拍拍偷午夜色无码 国产男女猛烈无遮挡免费视频 久久精品无码专区免费东京热 超碰国产人人做人人爽久 一女多男同时进6根同时进行 公车好紧好爽再搔一点浪一点 老太婆性杂交欧美肥老太 丰满少妇人妻HD高清大乳在线 人妻少妇伦在线无码 国产精品一区二区在线观看 亚洲欧洲自拍拍偷午夜色无码 国产综合色产在线视频欧美 天天夜碰日日摸日日澡 美国毛片 veronica吸茎女王avluv 印度性BBBBBXXXXX 成在线人av免费无码高潮喷水 JAPANESE成熟丰满熟妇 女人与公拘交酡过程 国精品午夜福利视频不卡麻豆 免费无码不卡视频在线观看 chinese熟妇与小伙子mature 丰满少妇人妻HD高清大乳在线 欧美xxxxzozo另类特级 婷婷色婷婷开心五月四房播播 白丝极品老师娇喘呻吟视频 免费无码不卡视频在线观看 韩国三级伦在线观看久 国产精品久久久久精品三级 JAPANESE成熟丰满熟妇 久久精品国产亚洲av麻豆 国产综合色产在线视频欧美 Chinese男高中生白袜Gay自慰 各种姿势玩小处雏女视频 两个男人添我下面试看十分钟 永久免费观看美女裸体的网站 女人与公拘交酡过程 亚洲色播爱爱爱爱爱爱爱 欧美XXXX做受欧美 丰满少妇被猛烈进入高清播放 老湿机69福利区无码 欧美gay无套粗大激情 性俄罗斯少妇交xx00 最刺激的交换夫妇中文字幕 欧美gay无套粗大激情 久久亚洲天天做日日做 中文字幕一区二区人妻 公车好紧好爽再搔一点浪一点 久久精品国产亚洲av高清! 哒哒哒免费视频观看在线www 欧美XXXX做受欧美 男女肉粗暴进来120秒动态图 爽看1069gey男男视频 出差我被公高潮a片 在线播放国产一区二区三区 亚洲AV无码专区国产乱码不卡 国产精品合集久久久久 精品久久久久香蕉网 男女肉粗暴进来120秒动态图 久久人人做人人妻人人玩精品 18禁无翼乌口工全彩大全 男人边吃奶边添下面好爽视频 厕所偷窥撒尿wcpeeingtube JAPANESE成熟丰满熟妇 农村极度乱人伦的小说1一3续 毛茸茸性xxxx毛茸茸毛茸茸 美女极品粉嫩美鮑20p图 人人添人人澡人人澡人人人人 国产综合色产在线视频欧美 特级大黄a片免费播放 少妇人妻在线无码天堂视频网 精品欧美高清vivoesosex 欧美 大陆 偷拍 精品 秋霞电影院午夜无码免费视频 玩弄少妇高潮A片 大又大粗又爽又黄少妇毛片 欧美大胆A级视频 中文字幕亚洲欧美在线不卡 女人与公拘交的A片视频网站 国产精品第一页 国产亚洲欧美日韩俺去了 日本肉体XXXX裸体137大胆 哒哒哒免费视频观看在线www 国产在线精品一区二区三区不卡 国产精品原创巨作av无遮挡 137裸交肉体摄影无需要下载 少妇爽滑多水高潮 各种姿势玩小处雏女视频 久久99九九精品久久久久齐齐 国产精品大屁股白浆一区二区 老少交玩tube少老配 被十几个男人扒开腿猛戳 精品国产第一国产综合精品 久久精品99久久香蕉国产 男女无遮挡羞羞视频免费网站 末发育娇小性色xxxxx 国产精品边做奶水狂喷无码 中国农村真实BBWBBWBBW 末发育娇小性色xxxxx 毛茸茸性xxxx毛茸茸毛茸茸 一本大道久久A久久综合 同性男男黄G片免费网站 秋霞电影院午夜无码免费视频 久久精品中文字幕一区 大又大粗又爽又黄少妇毛片 无码av免费一区二区三区 中文字幕av无码不卡免费 真实国产乱子伦清晰对白视频 韩国三级伦在线观看久 在线播放国产一区二区三区 欧美XXXXZOZO另类特级 野花高清在线观看视频www 免费国产黄网站在线观看视频 丰满少妇被猛烈进入高清播放 免费看国产成年无码av 国产成人剧情AV麻豆映画 美国毛片 最刺激的交换夫妇中文字幕 老太婆毛多bbwbbwbbwbbw播放 大又大粗又爽又黄少妇毛片 婷婷色婷婷开心五月四房播播 久久亚洲欧美国产精品 性xxxxfreexxxxx欧美牲交 18禁超污无遮挡无码免费网站 国产精品边做奶水狂喷无码 av永久天堂一区二区三区 一本大道久久A久久综合 亚洲欧洲自拍拍偷午夜色无码 久久99九九精品久久久久齐齐 孕妇奶水仑乱A级毛片免费看 亚洲丁香五月激情综合 欧美极品少妇做受 公车好紧好爽再搔一点浪一点 久久人人做人人妻人人玩精品 综合图区亚洲欧美另类图片 国产三级精品三级在线专区1 久久久久无码精品国产 久久精品国产亚洲av高清! 农村极度乱人伦的小说1一3续 人与动人物XXXX毛片 舌头伸进我下面很爽的动态图 欧美性受xxxx黑人xyx性爽 久久精品中文字幕一区 久久人人做人人妻人人玩精品 玩弄少妇高潮A片 国产真实夫妇交换视频 亚洲AV男人电影天堂热APP 国产帅男男GAY网站视频 偷窥厕所AAAAAA片 大胆欧美熟妇xxmature 国产无遮挡裸体免费视频 veronica吸茎女王avluv 国产av无码专区亚洲av麻豆 中文字幕被公侵犯的漂亮人妻 欧美 大陆 偷拍 精品 少妇乱子伦精品无码专区 国产精品永久免费 白丝极品老师娇喘呻吟视频 国精品午夜福利视频不卡麻豆 中文字幕av无码不卡免费 婷婷色婷婷开心五月四房播播 在厨房乱子伦在线观看 亚洲欧洲自拍拍偷午夜色无码 久久精品无码专区免费东京热 真实国产乱子伦清晰对白视频 久久人人做人人妻人人玩精品 女人与公拘交酡过程 大又大粗又爽又黄少妇毛片 女人与公拘交的A片视频网站 中国农村真实BBWBBWBBW 国精品午夜福利视频不卡麻豆 chinese 性 熟女bbw 亚洲国产综合无码一区二区三区 欧美人体XXXX在线观看 看全色黄大色大片免费久久 狠狠狠的在啪线香蕉亚洲应用 性偷窥tube凸凹视频 中文字幕av无码一区电影dvd zzijzzij亚洲日本少妇jizjiz 欧美人与动牲交片免费 天天夜碰日日摸日日澡 免费国产A国产片高清网站 色先锋av影音先锋在线 女邻居夹得好紧太爽了A片 无码永久免费AV网站不卡 久久精品99久久香蕉国产 国产精品久久久久精品三级 男女肉粗暴进来120秒动态图 精品一久久香蕉国产线看观看 chinese 性 熟女bbw 大又大粗又爽又黄少妇毛片 欧美极品少妇做受 亚洲国产成人精品无码区 印度性BBBBBXXXXX 中国老妇BBB视频老少配 男女无遮挡羞羞视频免费网站 美女扒开阳道口图片 娇妻互换享受高潮 久久精品中文字幕一区 强奷漂亮脱肉丝袜无码视频 亂倫近親相姦中文字幕 国产三级在线观看播放 在线播放免费人成毛片乱码 人人人澡人人人妻人人人少妇 国产三级在线观看播放 人妻夜夜爽天天爽欧美色院 公车好紧好爽再搔一点浪一点 国产a∨国片精品青草社区 日本黄色视频 免费无码不卡视频在线观看 婷婷色婷婷开心五月四房播播 av无码久久久久不卡网站 人人人澡人人人妻人人人少妇 精品BBwBBwBBwBBw 爽看1069gey男男视频 国产精品大屁股白浆一区二区 国产精品第一页 婷婷亚洲综合五月天小说 娇妻被生人粗大猛烈进出高潮 女人与公拘交酡过程 又大又粗欧美黑人a片 日本黄色视频 亂倫近親相姦中文字幕 中文字幕av无码不卡免费 久久久亚洲欧洲日产国码AⅤ 女人扒开屁股让男人桶30分钟 国产a∨国片精品青草社区 男女肉粗暴进来120秒动态图 强奷漂亮脱肉丝袜无码视频 美女扒开阳道口图片 137裸交肉体摄影无需要下载 舌头伸进我下面很爽的动态图 最刺激的交换夫妇中文字幕 免费国产A国产片高清网站 少妇人妻在线无码天堂视频网 中文字幕av无码不卡免费 久久久久无码精品国产 国模国产精品嫩模大尺度视频 看全色黄大色大片免费久久 大又大粗又爽又黄少妇毛片 手伸进内衣使劲揉搓奶头漫画 国产又色又爽又黄刺激的视频 国产精品永久免费 少妇爽滑多水高潮 办公室娇喘的短裙老师在线 小说 亚洲 无码 秋霞电影院午夜无码免费视频 中文字幕韩国三级理论 久久人人做人人妻人人玩精品 欧美成人免费观看在线看 老太婆性杂交欧美肥老太 爽看1069gey男男视频 顶级丰满少妇a级毛片 亚洲日韩在线中文字幕综合 人与动人物XXXX毛片 天天操天天干 办公室娇喘的短裙老师在线 日本黄色视频 老妇肥熟凸凹丰满刺激 人妻夜夜爽天天爽欧美色院 成在线人av免费无码高潮喷水 337p日本欧洲亚洲大胆色噜噜 黑人巨大精品欧美一区二区 久久人妻无码中文字幕 av无码久久久久不卡网站 杨贵妃4级纵欲丰满裸体毛片 免费看奶头视频的网站 人妻中文字系列无码专区 久久人妻无码中文字幕 欧美人与动xxxxz0oz 亚洲熟妇少妇任你躁在线观看 婷婷色婷婷开心五月四房播播 欧美成人经典三级在线观看 手伸进内衣使劲揉搓奶头漫画 男同桌把我腿打开摸到高潮 精品BBwBBwBBwBBw 东北女人毛多水多牲交视频 老太婆性杂交欧美肥老太 永久免费观看美女裸体的网站 野花高清在线观看视频www 女人与公拘交酡过程 欧美XXXX做受欧美 九色综合狠狠综合久久 久久99九九精品久久久久齐齐 美女极品粉嫩美鮑20p图 最刺激的交换夫妇中文字幕 久久精品中文字幕一区 久久国产乱子伦精品免费女 色欲人妻综合网 亚洲va中文字幕无码久久一区 国产精品第一页 大又大粗又爽又黄少妇毛片 无码av免费一区二区三区 草莓视频在线 人禽杂交18禁网站免费 性xxxxfreexxxxx欧美牲交 欧美另类69xxxxx 黑人巨大精品欧美一区二区 欧美XXXX做受欧美 嫖农村40的妇女舒服正在播放 国产三级精品三级在专区 女人与公拘交酡过程 男人j进女人p免费视频 在线 亚洲 国产 老太婆性杂交欧美肥老太 嫖农村40的妇女舒服正在播放 婷婷亚洲综合五月天小说 亚洲av无码一区二区乱子伦 男人j进女人p免费视频 国产AV自拍 欧美性受xxxx黑人xyx性爽 各种姿势玩小处雏女视频 丰满少妇被猛烈进入高清播放 女人扒开屁股让男人桶30分钟 性激烈的欧美三级视频 偷窥厕所AAAAAA片 天天操天天干 毛茸茸性xxxx毛茸茸毛茸茸 中文字幕亚洲欧美在线不卡 女人扒开屁股让男人桶30分钟 秋霞电影院午夜无码免费视频 国内揄拍国内精品少妇 毛茸茸性xxxx毛茸茸毛茸茸 人人人澡人人人妻人人人少妇 东北女人毛多水多牲交视频 亚洲国产综合无码一区二区三区 久久免费看黄A级毛片 久久亚洲欧美国产精品 国产精品永久免费 国产真实夫妇交换视频 欧美日韩国产免费一区二区三区 偷窥厕所AAAAAA片 国产三级精品三级在专区 真实国产乱子伦清晰对白视频 手机看片久久国产永久免费 免费无码不卡视频在线观看 中文字幕av无码一区电影dvd 女邻居夹得好紧太爽了A片 两个人日本免费完整版高清 被男狂揉吃奶胸60分钟视频 草莓视频在线 阳茎伸入女人的阳道免费视频 两个人日本免费完整版高清 免费看国产成年无码av 黑人巨大精品欧美一区二区 看全色黄大色大片免费久久 被男狂揉吃奶胸60分钟视频 精品国产第一国产综合精品 亂倫近親相姦中文字幕 在线播放国产一区二区三区 毛茸茸性xxxx毛茸茸毛茸茸 伊伊人成亚洲综合人网香 国产a∨国片精品青草社区 亚洲AV男人电影天堂热APP 国产亚洲欧美日韩俺去了 中国老妇BBB视频老少配 韩国日本三级在线观看 亚洲色无码专区一区 久久人人做人人妻人人玩精品 同性男男黄G片免费网站 国产三级在线观看播放 H纯肉无遮掩3D动漫在线观看 女子自慰喷潮A片免费观看 国模国产精品嫩模大尺度视频 少妇爽滑多水高潮 西西大胆国模人体艺 丰满人妻被公侵犯日本电影 137裸交肉体摄影无需要下载 一女多男同时进6根同时进行 东北女人毛多水多牲交视频 特级大黄a片免费播放 av鲁丝一区鲁丝二区鲁丝三区 国模国产精品嫩模大尺度视频 一本大道久久A久久综合 出差我被公高潮a片 999ZYZ玖玖资源站永久 精品一久久香蕉国产线看观看 各种姿势玩小处雏女视频 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 被十几个男人扒开腿猛戳 日本被黑人强伦姧人妻完整版 女人与公拘交酡过程 男人狂躁进女人下面视频 色先锋av影音先锋在线 欧美精品亚洲精品日韩久久 永久免费观看美女裸体的网站 国产午夜福利在线观看红一片 国产亚洲欧美日韩俺去了 性欧美丰满熟妇XXXX性 一本大道久久A久久综合 国产三级精品三级在线专区1 狠狠狠的在啪线香蕉亚洲应用 久久国产乱子伦精品免费女 影音先锋女人av鲁色资源网 日韩无码电影 久久国产乱子伦精品免费女 粗大挺进朋友的未婚妻 veronica吸茎女王avluv 欧美大胆A级视频 h肉动漫无码无修6080动漫网 juliaann女医生在办公室 国模大胆一区二区三区 亚洲成a∨人片在线观看无码 丰满多毛的大隂户 伊伊人成亚洲综合人网香 欧美 大陆 偷拍 精品 亚洲欧洲自拍拍偷午夜色无码 国产草莓视频无码a在线观看 大尺度无遮挡激烈床震网站 欧美xxxx极品丰满 人人添人人澡人人澡人人人人 无码av免费一区二区三区 大又大粗又爽又黄少妇毛片 强奷漂亮脱肉丝袜无码视频 女邻居夹得好紧太爽了A片 大又大粗又爽又黄少妇毛片 少妇乱子伦精品无码专区 免费无码不卡视频在线观看 欧美人体XXXX在线观看 亚洲色播爱爱爱爱爱爱爱 手机在线看永久av片免费 国产AV自拍 精品国产第一国产综合精品 夜夜未满十八勿进的爽爽影院 av鲁丝一区鲁丝二区鲁丝三区 国内揄拍国内精品少妇 人禽杂交18禁网站免费 juliaann女医生在办公室 欧美成人经典三级在线观看 久久人人做人人妻人人玩精品 国产成人免费无庶挡视频 久久亚洲欧美国产精品 H动漫无遮挡成本人H视频 各种姿势玩小处雏女视频 亚洲国产成人精品无码区 国产精品视频yjizz 久久精品国产亚洲AV麻豆 国产无遮挡裸体免费视频 婷婷亚洲综合五月天小说 看全色黄大色大片免费久久 国产三级在线观看播放 国产午夜福利在线观看红一片 久久精品中文字幕一区 3344成年在线视频免费播放 h肉动漫无码无修6080动漫网 久久精品国产亚洲AV麻豆 女邻居的大乳中文字幕 九色综合狠狠综合久久 男人边吃奶边添下面好爽视频 色欲人妻综合网 娇妻互换享受高潮 舌头伸进我下面很爽的动态图 亚洲AV综合色区无码一区爱AV 韩国日本三级在线观看 性俄罗斯少妇交xx00 男人J桶进女人P无遮挡 日韩无码电影 免费国产A国产片高清网站 老湿机69福利区无码 国产精品va在线观看无码电影 H动漫无遮挡成本人H视频 娇妻互换享受高潮 综合久久给合久久狠狠狠97色 亚洲AV无码一区二区三区人妖 性xxxxfreexxxxx欧美牲交 末发育娇小性色xxxxx 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 人禽杂交18禁网站免费 久久人人做人人妻人人玩精品 豪妇荡乳1一5潘金莲 黑人巨大精品欧美一区二区 手机看片久久国产永久免费 欧美极品少妇做受 精品久久久久久中文字幕无码 国产99视频精品免视看7 美团外卖猛男gayb0y1069 影音先锋女人av鲁色资源网 国产激情久久久久影院老熟女 白丝极品老师娇喘呻吟视频 欧美成人经典三级在线观看 zzijzzij亚洲日本少妇jizjiz 久久精品国产亚洲AV麻豆 亚洲国产成人精品无码区 亚洲色大成网站WWW永久男同 一本大道久久A久久综合 亚洲人成绝费网站色www吃脚 中文字幕被公侵犯的漂亮人妻 chinese猛男自慰gv白袜喷浆 欧美gay无套粗大激情 久久人人做人人妻人人玩精品 欧洲肉欲k8播放毛片 国产精品原创巨作av无遮挡 娇妻被生人粗大猛烈进出高潮 免费看奶头视频的网站 在线亚洲高清揄拍自拍一品区 看全色黄大色大片免费久久 被老头玩弄邻居人妻中文字幕 人禽杂交18禁网站免费 国产99视频精品免视看7 野花高清在线观看视频www 亚洲熟妇少妇任你躁在线观看 久久亚洲欧美国产精品 杨贵妃4级纵欲丰满裸体毛片 欧美gay无套粗大激情 久久99九九精品久久久久齐齐 美女扒开阳道口图片 久久精品国产亚洲AV麻豆 久久精品99久久香蕉国产 中国老妇BBB视频老少配 女子自慰喷潮A片免费观看 18禁无翼乌口工全彩大全 性偷窥tube凸凹视频 亚洲av无码一区二区乱子伦 被男狂揉吃奶胸60分钟视频 国内真实愉拍系列在线视频 亚洲国产精品无码久久一线夕 juliaann女医生在办公室 美女极品粉嫩美鮑20p图 亚洲日韩在线中文字幕综合 厕所偷窥撒尿wcpeeingtube 亚洲av无码一区二区乱子伦 色欲人妻综合网 男吃奶玩乳尖高潮60分钟视频 厨房掀起裙子从后面进去视频 强奷绝色年轻女教师 欧美老少配孩交 亚洲制服丝袜av一区二区三区 在线播放免费人成毛片乱码 日韩无码电影 手机看片久久国产永久免费 国产精品大屁股白浆一区二区 欧美gay无套粗大激情 中文字幕被公侵犯的漂亮人妻 男人边吃奶边添下面好爽视频 国产又色又爽又黄刺激的视频 两个奶头被吃高潮视频 国内揄拍国内精品少妇 精品无码中出一区二区 丰满少妇人妻HD高清大乳在线 中文字幕av无码一区电影dvd 欧美XXXX做受欧美 国模国产精品嫩模大尺度视频 国模国产精品嫩模大尺度视频 国产精品va在线观看无码电影 国产精品一区二区在线观看 国产精品合集久久久久 国产三级精品三级男人的天堂 欧美大胆a级视频 强奷漂亮脱肉丝袜无码视频 国产精品视频yjizz 中文字幕av无码不卡免费 在线 亚洲 国产 国产在线精品一区二区三区不卡 3344成年在线视频免费播放 在线播放免费人成毛片乱码 男女肉粗暴进来120秒动态图 小说 亚洲 无码 亚洲日韩在线中文字幕综合 婷婷色婷婷开心五月四房播播 免费A片在线观看 国产精品原创巨作av无遮挡 美女极品粉嫩美鮑20p图 印度性BBBBBXXXXX 性欧美丰满熟妇XXXX性 看全色黄大色大片免费久久 最刺激的交换夫妇中文字幕 狠狠狠的在啪线香蕉亚洲应用 国产香蕉尹人在线视频你懂的 秋霞电影院午夜无码免费视频 亚洲AV无码一区二区三区人妖 久久精品中文字幕一区 人妻少妇伦在线无码 少妇乱子伦精品无码专区 色先锋av影音先锋在线 欧美XXXX做受欧美 国产精品永久免费 在线亚洲高清揄拍自拍一品区 久久久久无码精品国产 3344成年在线视频免费播放 久久精品99久久香蕉国产 欧美大胆a级视频 伊伊人成亚洲综合人网香 真实国产乱子伦清晰对白视频 少妇乱子伦精品无码专区 娇妻互换享受高潮 国产又色又爽又黄刺激的视频 欧美人与动牲交片免费 国产精品va在线观看无码电影 男人j进女人p免费视频 丰满人妻被公侵犯日本电影 免费国产黄网站在线观看视频 神马影院我不卡 老妇肥熟凸凹丰满刺激 国产三级精品三级男人的天堂 久久精品99久久香蕉国产 国产精品边做奶水狂喷无码 欧美另类69xxxxx 国产三级精品三级在线专区1 久久99精品久久久久久清纯 欧美老少配孩交 亚洲欧洲自拍拍偷午夜色无码 亚洲日产无码中文字幕 久久精品无码专区免费东京热 337p日本欧洲亚洲大胆色噜噜 人人人澡人人人妻人人人少妇 国产AV自拍 美女扒开阳道口图片 阳茎伸入女人的阳道免费视频 中文字幕一区二区人妻 欧美大胆A级视频 国产又色又爽又黄刺激的视频 久久精品国产亚洲av高清! 国内揄拍国内精品少妇 国产jizzjizz麻豆全部免费 男女肉粗暴进来120秒动态图 久久久久无码精品国产 真实国产乱子伦清晰对白视频 手机在线看永久av片免费 丰满多毛的大隂户 丰满少妇被猛烈进入高清播放 粗大挺进朋友的未婚妻 老少交玩tube少老配 夜夜未满十八勿进的爽爽影院 手机看片久久国产永久免费 国精品午夜福利视频不卡麻豆 国产无遮挡裸体免费视频 性xxxxfreexxxxx欧美牲交 337p人体粉嫩胞高清大图 久久精品国产亚洲AV麻豆 亚洲日韩在线中文字幕综合 中国老妇BBB视频老少配 天天操天天干 亚洲va中文字幕无码久久一区 亚洲AV无码一区二区三区人妖 欧美性白人极品1819hd 女邻居夹得好紧太爽了A片 137裸交肉体摄影无需要下载 末发育娇小性色xxxxx 欧美性受xxxx黑人xyx性爽 137裸交肉体摄影无需要下载 两个人日本免费完整版高清 chinese猛男自慰gv白袜喷浆 哒哒哒免费视频观看在线www 最刺激的交换夫妇中文字幕 出差我被公高潮a片 欧美性受xxxx黑人xyx性爽 亚洲日韩在线中文字幕综合 久久久亚洲欧洲日产国码AⅤ 国模国产精品嫩模大尺度视频 丰满多毛的大隂户 日韩精品无码视频免费专区 女邻居夹得好紧太爽了A片 免费看av在线网站网址 人妻中文字系列无码专区 国产草莓视频无码a在线观看 欧美XXXX做受欧美 欧美老少配孩交 两个男人添我下面试看十分钟 中文字幕韩国三级理论 精品久久久久香蕉网 中文字幕av无码一区电影dvd 东北女人毛多水多牲交视频 女子自慰喷潮A片免费观看 国产三级精品三级男人的天堂 男女无遮挡羞羞视频免费网站 国内揄拍国内精品少妇 曰韩亚洲AV人人夜夜澡人人爽 两个男人添我下面试看十分钟 av无码久久久久不卡网站 日本肉体XXXX裸体137大胆 久久免费看黄A级毛片 欧美人体XXXX在线观看 久久亚洲欧美国产精品 国产成人免费无庶挡视频 中国农村真实BBWBBWBBW 哒哒哒免费视频观看在线www 中国农村真实BBWBBWBBW 国产成人剧情AV麻豆映画 18禁黄无遮挡免费网站动漫 老妇肥熟凸凹丰满刺激 中文字幕av无码一区电影dvd chinese熟妇与小伙子mature Chinese男高中生白袜Gay自慰 亚洲人成绝费网站色www吃脚 18禁超污无遮挡无码免费网站 av无码久久久久不卡网站 毛茸茸性xxxx毛茸茸毛茸茸 H动漫无遮挡成本人H视频 亚洲成a∨人片在线观看无码 看全色黄大色大片免费久久 少妇乱子伦精品无码专区 狠狠狠的在啪线香蕉亚洲应用 亚洲日产无码中文字幕 国产精品边做奶水狂喷无码 娇妻被生人粗大猛烈进出高潮 两个男人添我下面试看十分钟 欧美人与动xxxxz0oz 欧美 大陆 偷拍 精品 亚洲日产无码中文字幕 国产精品大屁股白浆一区二区 久久精品国产亚洲AV麻豆 少妇人妻在线无码天堂视频网 欧美大胆A级视频 chinese熟妇与小伙子mature 久久人人做人人妻人人玩精品 同性男男黄G片免费网站 中文字幕一区二区人妻 舌头伸进我下面很爽的动态图 公车好紧好爽再搔一点浪一点 亚洲熟妇少妇任你躁在线观看 国产亚洲欧美日韩俺去了 成在线人av免费无码高潮喷水 av永久天堂一区二区三区 国产精品久久久久久搜索 两个人日本免费完整版高清 亚洲AV无码专区国产乱码不卡 国产男女猛烈无遮挡免费视频 人妻夜夜爽天天爽欧美色院 一本大道久久A久久综合 亚洲成a∨人片在线观看无码 欧美人体XXXX在线观看 欧美人与动xxxxz0oz 女人与公拘交酡过程 久久99九九精品久久久久齐齐 juliaann女医生在办公室 H肉动漫无码无修6080动漫网 免费A片在线观看 精品BBwBBwBBwBBw 国产av无码专区亚洲av麻豆 999ZYZ玖玖资源站永久 强奷绝色年轻女教师 秋霞电影院午夜无码免费视频 chinese 性 熟女bbw 精品欧美高清vivoesosex 男人边吃奶边添下面好爽视频 婷婷色婷婷开心五月四房播播 亚洲色偷拍区另类无码专区 韩国精品无码一区二区三区 av永久天堂一区二区三区 国产精品国产三级国产普通话 久久久久无码精品国产 亚洲AV综合色区无码一区爱AV xxxnxxx18小鲜肉gay Chinese男高中生白袜Gay自慰 亚洲av无码一区二区乱子伦 男人J桶进女人P无遮挡 国产午夜福利在线观看红一片 哒哒哒免费视频观看在线www 男同桌把我腿打开摸到高潮 精品久久久久久中文字幕无码 丰满人妻被公侵犯日本电影 亚洲av无码一区二区乱子伦 男人狂躁进女人下面视频 野花高清在线观看视频www 欧美另类69xxxxx 老妇肥熟凸凹丰满刺激 各种姿势玩小处雏女视频 大又大粗又爽又黄少妇毛片 久久精品国产亚洲av麻豆 国产三级精品三级在线专区1 精品一久久香蕉国产线看观看 国产帅男男GAY网站视频 性激烈的欧美三级视频 韩国精品无码一区二区三区 人人添人人澡人人澡人人人人 亚洲国产初高中生女av 人人添人人澡人人澡人人人人 男人J桶进女人P无遮挡 中文字幕av无码一区电影dvd 国产av无码亚洲avh 精品久久久久香蕉网 免费A片在线观看 337p人体粉嫩胞高清大图 av永久天堂一区二区三区 亲嘴扒胸摸屁股激烈网站 公车好紧好爽再搔一点浪一点 亚洲日韩在线中文字幕综合 色欲日日拍夜夜嗷嗷叫 亚洲色播爱爱爱爱爱爱爱 大尺度无遮挡激烈床震网站 末发育娇小性色xxxxx 久久精品无码专区免费东京热 农村极度乱人伦的小说1一3续 国模国产精品嫩模大尺度视频 女人zozozo禽交高潮喷水 欧美XXXX做受欧美 一本大道久久A久久综合 人人添人人澡人人澡人人人人 末发育娇小性色xxxxx 看全色黄大色大片免费久久 粗大挺进朋友的未婚妻 亚洲日韩在线中文字幕综合 全黄性性激高免费视频 韩国精品无码一区二区三区 中文字幕无码A片久久东京热喷水 丰满人妻被公侵犯日本电影 精品久久久久久中文字幕无码 免费a级作爱片免费观看美国 丰满少妇人妻HD高清大乳在线 亚洲AV综合色区无码一区爱AV 欧美xxxx极品丰满 孕妇奶水仑乱A级毛片免费看 国产a∨国片精品青草社区 国产亚洲欧美日韩俺去了 丰满多毛的大隂户 欧美成人免费观看在线看 精品BBwBBwBBwBBw 厕所偷窥撒尿wcpeeingtube 国产草莓视频无码a在线观看 18禁黄无遮挡免费网站动漫 国产精品va在线观看无码电影 全黄性性激高免费视频 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 国产jizzjizz麻豆全部免费 国产精品一区二区在线观看 日韩精品无码视频免费专区 国产草莓视频无码a在线观看 18禁黄无遮挡免费网站动漫 人与动人物XXXX毛片 国产色爱av资源综合区 精品BBwBBwBBwBBw 国产色爱av资源综合区 欧洲肉欲k8播放毛片 黑人巨大精品欧美一区二区 哒哒哒免费视频观看在线www 免费看美女被靠到爽的视频 免费看国产成年无码av 无码av免费一区二区三区 中文字幕精品无码亚洲字幕成a人 H动漫无遮挡成本人H视频 国产精品久久久久精品三级 亚洲国产成人精品无码区 国产无遮挡裸体免费视频 免费A片在线观看 欧美另类69xxxxx 国产成人免费无庶挡视频 亚洲色偷拍区另类无码专区 人妻中文字系列无码专区 veronica吸茎女王avluv 国产成人剧情AV麻豆映画 人妻少妇伦在线无码 看全色黄大色大片免费久久 国产草莓视频无码a在线观看 亚洲精品 哒哒哒免费视频观看在线www 国产99视频精品免视看7 chinese熟女熟妇1乱老女人 久久精品中文字幕一区 野花高清在线观看视频www 亚洲国产综合无码一区二区三区 变态sm天堂无码专区 欧洲肉欲k8播放毛片 免费无码不卡视频在线观看 juliaann女医生在办公室 真实国产乱子伦清晰对白视频 天天干天天日 性xxxxfreexxxxx欧美牲交 女子自慰喷潮A片免费观看 18禁黄无遮挡免费网站动漫 国产三级精品三级在专区 国产av无码专区亚洲av麻豆 久久精品国产亚洲AV麻豆 变态sm天堂无码专区 人禽杂交18禁网站免费 国产99视频精品免视看7 女闺蜜把我下面摸到高潮喷水 国产精品大屁股白浆一区二区 手机在线看永久av片免费 老湿机69福利区无码 欧美极品少妇做受 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 亚洲制服丝袜av一区二区三区 在线播放免费人成毛片乱码 欧美大胆A级视频 看全色黄大色大片免费久久 欧美XXXX做受欧美 影音先锋女人av鲁色资源网 137裸交肉体摄影无需要下载 亚洲成a∨人片在线观看无码 亚洲国产精品无码久久一线夕 337p日本欧洲亚洲大胆色噜噜 西西大胆国模人体艺 强奷绝色年轻女教师 日本肉体XXXX裸体137大胆 男女肉粗暴进来120秒动态图 男人J桶进女人P无遮挡 久久亚洲欧美国产精品 欧美人与动xxxxz0oz 久久精品国产亚洲AV麻豆 3344成年在线视频免费播放 亚洲国产精品无码久久一线夕 欧美人与动牲交片免费 男人边吃奶边添下面好爽视频 韩国三级伦在线观看久 久久国产乱子伦精品免费女 小说 亚洲 无码 无码av免费一区二区三区 欧美大胆A级视频 在线亚洲高清揄拍自拍一品区 国产精品va在线观看无码电影 GOGO西西人体大尺寸大胆高清 日韩精品无码视频免费专区 亚洲日韩在线中文字幕综合 夜夜未满十八勿进的爽爽影院 亲嘴扒胸摸屁股激烈网站 一本大道久久A久久综合 真实国产乱子伦清晰对白视频 亚洲日韩在线中文字幕综合 看全色黄大色大片免费久久 无码av免费一区二区三区 阳茎伸入女人的阳道免费视频 欧美 大陆 偷拍 精品 国产亚洲欧美日韩俺去了 zzijzzij亚洲日本少妇jizjiz 两个人日本免费完整版高清 欧美人与动牲交片免费 欧美大胆a级视频 永久免费观看美女裸体的网站 中国老妇BBB视频老少配 韩国三级伦在线观看久 GOGO西西人体大尺寸大胆高清 顶级丰满少妇a级毛片 久久亚洲欧美国产精品 137裸交肉体摄影无需要下载 毛茸茸性xxxx毛茸茸毛茸茸 天天操天天干 日本XXXX色视频在线观看免费 亚洲日韩在线中文字幕综合 中文字幕精品无码亚洲字幕 3344成年在线视频免费播放 chinese猛男自慰gv白袜喷浆 末发育娇小性色xxxxx 欧美XXXX做受欧美 jzzijzzij日本成熟少妇 阳茎伸入女人的阳道免费视频 国产精品边做奶水狂喷无码 国产粉嫩高中生第一次不戴套 厕所偷窥撒尿wcpeeingtube 18禁黄无遮挡免费网站动漫 国产AV自拍 白丝极品老师娇喘呻吟视频 哒哒哒免费视频观看在线www 中文字幕亚洲欧美在线不卡 久久人人做人人妻人人玩精品 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 天天天欲色欲色www免费 国产三级精品三级在线专区1 老少交玩tube少老配 无码永久免费AV网站不卡 亚洲AV综合色区无码一区爱AV 伊伊人成亚洲综合人网香 永久免费观看美女裸体的网站 欧美老少配孩交 亚洲va中文字幕无码久久一区 久久人人做人人妻人人玩精品 少妇爽滑多水高潮 性欧美丰满熟妇XXXX性 被老头玩弄邻居人妻中文字幕 欧美XXXX做受欧美 亂倫近親相姦中文字幕 免费看av在线网站网址 性偷窥tube凸凹视频 久久人妻无码中文字幕 免费看国产成年无码av chinese猛男自慰gv白袜喷浆 免费看奶头视频的网站 性国产videosgratis极品 老少交玩tube少老配 久久精品无码专区免费东京热 强奷绝色年轻女教师 偷窥厕所AAAAAA片 男同桌把我腿打开摸到高潮 日本黄色视频 娇妻互换享受高潮 免费网站看v片在线18禁无码 强奷绝色年轻女教师 老妇肥熟凸凹丰满刺激 丰满熟妇乱又伦 婷婷亚洲综合五月天小说 GOGO西西人体大尺寸大胆高清 女邻居的大乳中文字幕 国产av无码专区亚洲av麻豆 手机看片久久国产永久免费 国产精品无码2021在线观看 国产精品原创巨作av无遮挡 色先锋AV影音先锋在线 久久精品中文字幕一区 男同桌把我腿打开摸到高潮 欧美人与动xxxxz0oz 超碰国产人人做人人爽久 精品BBwBBwBBwBBw 欧美FREESEX黑人又粗又大 欧美人与动牲交片免费 一女多男同时进6根同时进行 同性男男黄G片免费网站 老太婆性杂交欧美肥老太 被老头玩弄邻居人妻中文字幕 日本被黑人强伦姧人妻完整版 国产激情久久久久影院老熟女 亚洲AV无码专区国产乱码不卡 亚洲日韩在线中文字幕综合 国产三级在线观看播放 黑人巨大精品欧美一区二区 久久亚洲欧美国产精品 中文字幕亚洲欧美在线不卡 亚洲欧洲自拍拍偷午夜色无码 女闺蜜把我下面摸到高潮喷水 丰满少妇被猛烈进入高清播放 各种姿势玩小处雏女视频 厨房掀起裙子从后面进去视频 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 夜夜未满十八勿进的爽爽影院 亚洲国产综合无码一区二区三区 欧美精品亚洲精品日韩久久 无码永久免费AV网站不卡 18禁无翼乌口工全彩大全 欧美XXXX做受欧美 欧美日韩一区二区综合 中国老妇BBB视频老少配 国产激情久久久久影院老熟女 欧美日韩国产免费一区二区三区 国模国产精品嫩模大尺度视频 免费看奶头视频的网站 jzzijzzij日本成熟少妇 偷窥厕所AAAAAA片 最刺激的交换夫妇中文字幕 国模国产精品嫩模大尺度视频 999ZYZ玖玖资源站永久 色欲日日拍夜夜嗷嗷叫 综合图区亚洲欧美另类图片 国模国产精品嫩模大尺度视频 性激烈的欧美三级视频 野花高清在线观看视频www 久久人妻无码中文字幕 老少交玩tube少老配 久久久久无码精品国产 av无码久久久久不卡网站 中文字幕av无码不卡免费 137裸交肉体摄影无需要下载 欧美另类69xxxxx 欧美日韩国产免费一区二区三区 亚洲丁香五月激情综合 欧美 大陆 偷拍 精品 女人扒开屁股让男人桶30分钟 艳妇乳肉豪妇荡乳后续潘金莲 女子自慰喷潮A片免费观看 H动漫无遮挡成本人H视频 女闺蜜把我下面摸到高潮喷水 久久99九九精品久久久久齐齐 厕所偷窥撒尿wcpeeingtube 女子自慰喷潮A片免费观看 顶级丰满少妇a级毛片 丰满人妻被公侵犯日本电影 国产精品第一页 被男狂揉吃奶胸60分钟视频 欧美成人免费观看在线看 精品欧美高清vivoesosex 少妇爽滑多水高潮 国产精品大屁股白浆一区二区 性偷窥tube凸凹视频 亂倫近親相姦中文字幕 两个奶头被吃高潮视频 亚洲日韩在线中文字幕综合 夜夜未满十八勿进的爽爽影院 亚洲日韩在线中文字幕综合 亚洲AV无码一区二区三区人妖 精品久久久久香蕉网 亚洲熟妇无码一区二区三区 在厨房乱子伦在线观看 久久久久无码精品国产 最刺激的交换夫妇中文字幕 国产三级精品三级在专区 美国毛片 久久人人做人人妻人人玩精品 在线 亚洲 国产 强奷漂亮脱肉丝袜无码视频 欧美人与动xxxxz0oz 大尺度无遮挡激烈床震网站 一女多男同时进6根同时进行 免费无码不卡视频在线观看 综合图区亚洲欧美另类图片 国产精品va在线观看无码电影 137裸交肉体摄影无需要下载 欧美成人经典三级在线观看 久久精品国产亚洲AV麻豆 被十几个男人扒开腿猛戳 孕妇奶水仑乱A级毛片免费看 中文字幕一区二区人妻 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 小说 亚洲 无码 国产精品无码2021在线观看 老妇肥熟凸凹丰满刺激 久久人人做人人妻人人玩精品 欧美大胆a级视频 久久人人做人人妻人人玩精品 欧美人体XXXX在线观看 亚洲色播爱爱爱爱爱爱爱 亚洲国产成人精品无码区 少妇爽滑多水高潮 亚洲日产无码中文字幕 亚洲日韩在线中文字幕综合 丰满多毛的大隂户 中文字幕一区二区人妻 国产三级精品三级在专区 舌头伸进我下面很爽的动态图 少妇乱子伦精品无码专区 女邻居夹得好紧太爽了A片 久久久亚洲欧洲日产国码AⅤ 黑人巨大精品欧美一区二区 亚洲va中文字幕无码久久一区 chinese 性 熟女bbw 办公室娇喘的短裙老师在线 男人j进女人p免费视频 精品一久久香蕉国产线看观看 Chinese男高中生白袜Gay自慰 亚洲日韩在线中文字幕综合 欧美xxxx极品丰满 日韩精品无码视频免费专区 丰满人妻被公侵犯日本电影 国产精品无码2021在线观看 xxxnxxx18小鲜肉gay 国产三级精品三级在专区 中文字幕av无码一区电影dvd 中文字幕精品无码亚洲字幕成a人 丰满少妇人妻HD高清大乳在线 看全色黄大色大片免费久久 男人J桶进女人P无遮挡 国产精品大屁股白浆一区二区 成在线人av免费无码高潮喷水 免费无码不卡视频在线观看 真实国产乱子伦清晰对白视频 欧美老少配孩交 久久人人做人人妻人人玩精品 性俄罗斯少妇交xx00 大又大粗又爽又黄少妇毛片 国产色爱av资源综合区 大又大粗又爽又黄少妇毛片 中文字幕亚洲欧美在线不卡 中国农村真实BBWBBWBBW 日韩无码电影 草莓视频在线 久久人人做人人妻人人玩精品 在线 亚洲 国产 曰韩亚洲AV人人夜夜澡人人爽 强奷绝色年轻女教师 国产a∨国片精品青草社区 免费看国产成年无码av 亚洲丁香五月激情综合 亚洲日产无码中文字幕 又黄又爽的成人免费视频 亚洲成a∨人片在线观看无码 久久精品无码专区免费东京热 办公室娇喘的短裙老师在线 欧美成人免费观看在线看 国产精品无码2021在线观看 中国老妇BBB视频老少配 亚洲va中文字幕无码久久一区 国产在线精品一区二区三区不卡 亚洲丁香五月激情综合 变态sm天堂无码专区 日本黄色视频 老湿机69福利区无码 在线亚洲高清揄拍自拍一品区 野花高清在线观看视频www 天天夜碰日日摸日日澡 国产粉嫩高中生第一次不戴套 看全色黄大色大片免费久久 国产精品va在线观看无码电影 美国毛片 国产香蕉尹人在线视频你懂的 人与动人物XXXX毛片 日本黄色视频 夜夜未满十八勿进的爽爽影院 国产草莓视频无码a在线观看 黑人巨大精品欧美一区二区 中文字幕无码A片久久东京热喷水 两个男人添我下面试看十分钟 女子自慰喷潮A片免费观看 影音先锋女人av鲁色资源网 女人与公拘交酡过程 国产AV自拍 天天天欲色欲色www免费 女子自慰喷潮A片免费观看 精品久久久久香蕉网 国模大胆一区二区三区 手机看片久久国产永久免费 中文字幕被公侵犯的漂亮人妻 秋霞电影院午夜无码免费视频 亚洲精品 又大又粗欧美黑人a片 免费网站看v片在线18禁无码 久久精品无码专区免费东京热 欧美大胆A级视频 性俄罗斯少妇交xx00 免费看国产成年无码av 性俄罗斯少妇交xx00 中文字幕韩国三级理论 特级大黄a片免费播放 亂倫近親相姦中文字幕 国产精品久久久久精品三级 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 天天天欲色欲色www免费 国产三级在线观看播放 国模大胆一区二区三区 免费看国产成年无码av 999ZYZ玖玖资源站永久 日本肉体XXXX裸体137大胆 婷婷色婷婷开心五月四房播播 丰满少妇人妻HD高清大乳在线 丰满熟妇乱又伦 公车好紧好爽再搔一点浪一点 中文字幕av无码不卡免费 久久久久无码精品国产 亚洲国产综合无码一区二区三区 哒哒哒免费视频观看在线www 老太婆毛多bbwbbwbbwbbw播放 综合久久给合久久狠狠狠97色 日韩无码电影 性激烈的欧美三级视频 H纯肉无遮掩3D动漫在线观看 色先锋av影音先锋在线 少妇乱子伦精品无码专区 综合图区亚洲欧美另类图片 137裸交肉体摄影无需要下载 韩国日本三级在线观看 熟妇高潮喷沈阳45熟妇高潮喷 久久精品国产亚洲av麻豆 艳妇乳肉豪妇荡乳后续潘金莲 人禽杂交18禁网站免费 亚洲AV综合色区无码一区爱AV 成在线人av免费无码高潮喷水 特级大黄a片免费播放 被十几个男人扒开腿猛戳 国产精品永久免费 日本黄色视频 3344成年在线视频免费播放 中文字幕精品无码亚洲字幕成a人 国产精品合集久久久久 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 日本黄色视频 欧美XXXX做受欧美 亚洲va中文字幕无码久久一区 国产精品一区二区在线观看 女邻居夹得好紧太爽了A片 欧美日韩国产免费一区二区三区 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 精品久久久久久中文字幕无码 国产精品边做奶水狂喷无码 免费看奶头视频的网站 国产精品视频yjizz 九色综合狠狠综合久久 国产亚洲欧美日韩俺去了 韩国三级伦在线观看久 H肉动漫无码无修6080动漫网 国产a∨国片精品青草社区 两个人日本免费完整版高清 国产激情久久久久影院老熟女 欧美性受xxxx黑人xyx性爽 婷婷色婷婷开心五月四房播播 精品久久久久久中文字幕无码 真实国产乱子伦清晰对白视频 国产jizzjizz麻豆全部免费 人与动人物XXXX毛片 神马影院我不卡 手伸进内衣使劲揉搓奶头漫画 大又大粗又爽又黄少妇毛片 厕所偷窥撒尿wcpeeingtube 强奷绝色年轻女教师 偷窥厕所AAAAAA片 免费a级作爱片免费观看美国 久久精品中文字幕一区 欧美人体XXXX在线观看 最刺激的交换夫妇中文字幕 综合久久给合久久狠狠狠97色 欧美另类69xxxxx 人妻少妇伦在线无码 又大又粗欧美黑人a片 欧美人与动牲交片免费 国产精品va在线观看无码电影 秋霞电影院午夜无码免费视频 两个人日本免费完整版高清 看全色黄大色大片免费久久 性激烈的欧美三级视频 色欲日日拍夜夜嗷嗷叫 欧美XXXX做受欧美 国产草莓视频无码a在线观看 国产jizzjizz麻豆全部免费 国产精品原创巨作av无遮挡 女闺蜜把我下面摸到高潮喷水 少妇人妻在线无码天堂视频网 国产三级精品三级男人的天堂 欧美XXXX做受欧美 国产激情久久久久影院老熟女 丰满少妇人妻HD高清大乳在线 大又大粗又爽又黄少妇毛片 欧美xxxxzozo另类特级 欧美xxxxzozo另类特级 中文字幕av无码不卡免费 色先锋av影音先锋在线 天天夜碰日日摸日日澡 哒哒哒免费视频观看在线www 免费国产黄网站在线观看视频 美女极品粉嫩美鮑20p图 欧美XXXXZOZO另类特级 永久免费观看美女裸体的网站 亚洲国产初高中生女av 3344成年在线视频免费播放 337p人体粉嫩胞高清大图 av永久天堂一区二区三区 影音先锋女人av鲁色资源网 免费国产黄网站在线观看视频 亚洲精品 H肉动漫无码无修6080动漫网 亚洲人成绝费网站色www吃脚 嫖农村40的妇女舒服正在播放 久久精品国产亚洲av麻豆 久久精品国产亚洲AV麻豆 欧美人与动牲交片免费 亚洲色大成网站WWW永久男同 韩国日本三级在线观看 手伸进内衣使劲揉搓奶头漫画 欧美大胆A级视频 国产精品边做奶水狂喷无码 久久国产乱子伦精品免费女 公车好紧好爽再搔一点浪一点 国产在线精品一区二区三区不卡 男人J桶进女人P无遮挡 亚洲色偷拍区另类无码专区 欧美gay无套粗大激情 少妇爽滑多水高潮 欧美成人经典三级在线观看 亚洲国产综合无码一区二区三区 18禁黄无遮挡免费网站动漫 h肉动漫无码无修6080动漫网 永久免费观看美女裸体的网站 中文字幕av无码不卡免费 成在线人av免费无码高潮喷水 伊伊人成亚洲综合人网香 野花高清在线观看视频www 娇妻被生人粗大猛烈进出高潮 亚洲丁香五月激情综合 捆绑白丝jk震动捧娇喘 永久免费观看美女裸体的网站 欧美精品亚洲精品日韩久久 中文字幕av无码一区电影dvd 18禁黄无遮挡免费网站动漫 孕妇奶水仑乱A级毛片免费看 国产三级精品三级在专区 西西大胆国模人体艺 两个人日本免费完整版高清 亚洲国产成人精品无码区 永久免费观看美女裸体的网站 欧美xxxxzozo另类特级 人妻中文字系列无码专区 农村极度乱人伦的小说1一3续 国模大胆一区二区三区 中文字幕无码A片久久东京热喷水 久久精品国产亚洲AV麻豆 强奷绝色年轻女教师 欧洲肉欲k8播放毛片 欧美日韩一区二区综合 精品久久久久香蕉网 免费无码不卡视频在线观看 亚洲AV无码一区二区三区人妖 H动漫无遮挡成本人H视频 欧美精品亚洲精品日韩久久 av永久天堂一区二区三区 精品BBwBBwBBwBBw chinese 性 熟女bbw 国产又色又爽又黄刺激的视频 性俄罗斯少妇交xx00 成在线人av免费无码高潮喷水 人禽杂交18禁网站免费 亲嘴扒胸摸屁股激烈网站 毛茸茸性xxxx毛茸茸毛茸茸 一女多男同时进6根同时进行 亚洲av无码一区二区乱子伦 精品国产第一国产综合精品 久久精品中文字幕一区 性俄罗斯少妇交xx00 韩国三级伦在线观看久 欧美性白人极品1819hd 免费看奶头视频的网站 夜夜未满十八勿进的爽爽影院 中文字幕av无码一区电影dvd 同性男男黄G片免费网站 女人扒开屁股让男人桶30分钟 中文字幕无码A片久久东京热喷水 哒哒哒免费视频观看在线www 国产av无码专区亚洲av麻豆 国产AV自拍 国产精品视频yjizz 色欲人妻综合网 国产av无码专区亚洲av麻豆 h肉动漫无码无修6080动漫网 美女扒开阳道口图片 中文字幕精品无码亚洲字幕成a人 国产亚洲欧美日韩俺去了 两个奶头被吃高潮视频 人人添人人澡人人澡人人人人 人禽杂交18禁网站免费 久久精品99久久香蕉国产 国产精品原创巨作av无遮挡 手机看片久久国产永久免费 综合久久给合久久狠狠狠97色 亲嘴扒胸摸屁股激烈网站 亚洲制服丝袜av一区二区三区 中国农村真实BBWBBWBBW 久久精品无码专区免费东京热 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 狠狠狠的在啪线香蕉亚洲应用 特级大黄a片免费播放 老妇肥熟凸凹丰满刺激 精品BBwBBwBBwBBw 欧美FREESEX黑人又粗又大 同性男男黄G片免费网站 999ZYZ玖玖资源站永久 av无码久久久久不卡网站 顶级丰满少妇a级毛片 18禁超污无遮挡无码免费网站 精品欧美高清vivoesosex 久久精品无码专区免费东京热 免费国产黄网站在线观看视频 chinese熟妇与小伙子mature 性偷窥tube凸凹视频 久久精品无码专区免费东京热 免费国产A国产片高清网站 无码永久免费AV网站不卡 亚洲熟妇少妇任你躁在线观看 3344成年在线视频免费播放 亚洲精品 欧美大胆a级视频 国产香蕉尹人在线视频你懂的 欧美大胆A级视频 女邻居夹得好紧太爽了A片 变态sm天堂无码专区 夜夜未满十八勿进的爽爽影院 国产精品视频yjizz 国产精品一区二区在线观看 在线亚洲高清揄拍自拍一品区 亚洲av无码一区二区乱子伦 国产精品永久免费 小说 亚洲 无码 夜夜未满十八勿进的爽爽影院 性国产videosgratis极品 欧美xxxxzozo另类特级 欧美XXXXZOZO另类特级 GOGO西西人体大尺寸大胆高清 国产粉嫩高中生第一次不戴套 国产精品边做奶水狂喷无码 人与动人物XXXX毛片 亚洲va中文字幕无码久久一区 强奷绝色年轻女教师 国产精品va在线观看无码电影 女闺蜜把我下面摸到高潮喷水 两个男人添我下面试看十分钟 强奷绝色年轻女教师 性欧美丰满熟妇XXXX性 大胆欧美熟妇xxmature 国产a∨国片精品青草社区 女人与公拘交的A片视频网站 丰满多毛的大隂户 欧美成人经典三级在线观看 zzijzzij亚洲日本少妇jizjiz 中文字幕被公侵犯的漂亮人妻 国精品午夜福利视频不卡麻豆 av无码久久久久不卡网站 av永久天堂一区二区三区 国产午夜福利在线观看红一片 顶级丰满少妇a级毛片 老妇肥熟凸凹丰满刺激 厨房掀起裙子从后面进去视频 两个男人添我下面试看十分钟 久久精品中文字幕一区 性俄罗斯少妇交xx00 国产又色又爽又黄刺激的视频 亚洲国产成人精品无码区 一本大道久久A久久综合 中文字幕av无码一区电影dvd 国产AV自拍 色先锋av影音先锋在线 欧美另类69xxxxx 国产AV自拍 性xxxxfreexxxxx欧美牲交 chinese 性 熟女bbw 亚洲国产成人精品无码区 亚洲精品 无码永久免费AV网站不卡 亚洲精品 老少交玩tube少老配 欧美老少配孩交 偷窥厕所AAAAAA片 亚洲日韩在线中文字幕综合 欧美日韩一区二区综合 久久人人做人人妻人人玩精品 久久久亚洲欧洲日产国码AⅤ 国产精品va在线观看无码电影 丰满少妇被猛烈进入高清播放 精品BBwBBwBBwBBw 国产草莓视频无码a在线观看 欧美另类69xxxxx 精品欧美高清vivoesosex 欧美人与动牲交片免费 欧美日韩一区二区综合 H纯肉无遮掩3D动漫在线观看 久久人人做人人妻人人玩精品 艳妇乳肉豪妇荡乳后续潘金莲 艳妇乳肉豪妇荡乳后续潘金莲 免费看奶头视频的网站 免费无码不卡视频在线观看 女人扒开屁股让男人桶30分钟 18禁无翼乌口工全彩大全 亚洲国产精品无码久久一线夕 chinese熟妇与小伙子mature 九色综合狠狠综合久久 亚洲日韩在线中文字幕综合 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 chinese熟妇与小伙子mature 欧美人体XXXX在线观看 18禁无翼乌口工全彩大全 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 女邻居的大乳中文字幕 性偷窥tube凸凹视频 大又大粗又爽又黄少妇毛片 舌头伸进我下面很爽的动态图 少妇人妻在线无码天堂视频网 3344成年在线视频免费播放 又大又粗欧美黑人a片 全黄性性激高免费视频 国产a∨国片精品青草社区 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 国产av无码专区亚洲av麻豆 同性男男黄G片免费网站 欧美XXXX做受欧美 精品久久久久久中文字幕无码 亚洲国产综合无码一区二区三区 国模大胆一区二区三区 色先锋av影音先锋在线 中国老妇BBB视频老少配 免费网站看v片在线18禁无码 国产精品大屁股白浆一区二区 亚洲欧洲自拍拍偷午夜色无码 欧美大胆A级视频 小说 亚洲 无码 久久精品无码专区免费东京热 免费看美女被靠到爽的视频 免费a级作爱片免费观看美国 伊伊人成亚洲综合人网香 黑人巨大精品欧美一区二区 免费国产黄网站在线观看视频 在线播放免费人成毛片乱码 女人zozozo禽交高潮喷水 欧美xxxx极品丰满 国产精品永久免费 国产三级精品三级在专区 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 在线亚洲高清揄拍自拍一品区 人妻中文字系列无码专区 男女肉粗暴进来120秒动态图 精品久久久久久中文字幕无码 人人人澡人人人妻人人人少妇 久久精品国产亚洲av麻豆 韩国精品无码一区二区三区 白丝极品老师娇喘呻吟视频 亚洲国产成人精品无码区 日本黄色视频 老妇肥熟凸凹丰满刺激 粗大挺进朋友的未婚妻 日本XXXX色视频在线观看免费 九色综合狠狠综合久久 欧美人与动牲交片免费 同性男男黄G片免费网站 h肉动漫无码无修6080动漫网 欧美xxxxzozo另类特级 韩国精品无码一区二区三区 人与动人物XXXX毛片 野花高清在线观看视频www 久久国产乱子伦精品免费女 国产精品原创巨作av无遮挡 强奷绝色年轻女教师 两个男人添我下面试看十分钟 同性男男黄G片免费网站 美女扒开阳道口图片 国模国产精品嫩模大尺度视频 韩国精品无码一区二区三区 日韩无码电影 国产精品视频yjizz 欧洲肉欲k8播放毛片 137裸交肉体摄影无需要下载 两个男人添我下面试看十分钟 人与动人物XXXX毛片 夜夜未满十八勿进的爽爽影院 av无码久久久久不卡网站 国产三级在线观看播放 国产激情久久久久影院老熟女 欧美另类69xxxxx 永久免费观看美女裸体的网站 丰满少妇被猛烈进入高清播放 亚洲AV综合色区无码一区爱AV 男人边吃奶边添下面好爽视频 综合图区亚洲欧美另类图片 又大又粗欧美黑人a片 免费无码不卡视频在线观看 国产精品久久久久精品三级 哒哒哒免费视频观看在线www 在线播放免费人成毛片乱码 美团外卖猛男gayb0y1069 国产三级精品三级男人的天堂 少妇乱子伦精品无码专区 性激烈的欧美三级视频 亂倫近親相姦中文字幕 久久国产乱子伦精品免费女 变态sm天堂无码专区 国产精品国产三级国产普通话 久久99九九精品久久久久齐齐 国产精品大屁股白浆一区二区 男女肉粗暴进来120秒动态图 欧美XXXXZOZO另类特级 国产成人免费无庶挡视频 女子自慰喷潮A片免费观看 天天夜碰日日摸日日澡 同性男男黄G片免费网站 性偷窥tube凸凹视频 变态sm天堂无码专区 精品欧美高清vivoesosex zzijzzij亚洲日本少妇jizjiz 中文字幕精品无码亚洲字幕 人妻夜夜爽天天爽欧美色院 综合图区亚洲欧美另类图片 女人与公拘交酡过程 少妇人妻在线无码天堂视频网 天天夜碰日日摸日日澡 厕所偷窥撒尿wcpeeingtube 18禁超污无遮挡无码免费网站 国产精品无码2021在线观看 人人添人人澡人人澡人人人人 中文字幕av无码不卡免费 大又大粗又爽又黄少妇毛片 亚洲国产综合无码一区二区三区 强奷绝色年轻女教师 又大又粗欧美黑人a片 亚洲人成绝费网站色www吃脚 久久亚洲天天做日日做 性xxxxfreexxxxx欧美牲交 zzijzzij亚洲日本少妇jizjiz 东北女人毛多水多牲交视频 综合图区亚洲欧美另类图片 丰满多毛的大隂户 在厨房乱子伦在线观看 精品BBwBBwBBwBBw 国产综合色产在线视频欧美 亚洲欧洲自拍拍偷午夜色无码 九色综合狠狠综合久久 chinese熟女熟妇1乱老女人 男人边吃奶边添下面好爽视频 亚洲日韩在线中文字幕综合 亚洲色播爱爱爱爱爱爱爱 欧美精品亚洲精品日韩久久 18禁无翼乌口工全彩大全 欧美 大陆 偷拍 精品 杨贵妃4级纵欲丰满裸体毛片 av无码久久久久不卡网站 人人添人人澡人人澡人人人人 国产粉嫩高中生第一次不戴套 亚洲色无码专区一区 性xxxxfreexxxxx欧美牲交 亚洲熟妇少妇任你躁在线观看 国产精品原创巨作av无遮挡 欧美另类69xxxxx 哒哒哒免费视频观看在线www Chinese男高中生白袜Gay自慰 国产精品va在线观看无码电影 亚洲色偷拍区另类无码专区 免费看av在线网站网址 人妻少妇伦在线无码 天天天欲色欲色www免费 欧美日韩一区二区综合 国产av无码专区亚洲av麻豆 chinese熟妇与小伙子mature 男人J桶进女人P无遮挡 中文字幕亚洲欧美在线不卡 农村极度乱人伦的小说1一3续 juliaann女医生在办公室 中文字幕亚洲欧美在线不卡 国产无遮挡裸体免费视频 中文字幕精品无码亚洲字幕成a人 亚洲人成绝费网站色www吃脚 男女肉粗暴进来120秒动态图 杨贵妃4级纵欲丰满裸体毛片 免费看av在线网站网址 男人J桶进女人P无遮挡 久久99九九精品久久久久齐齐 在线播放国产一区二区三区 变态sm天堂无码专区 18禁黄无遮挡免费网站动漫 中文字幕av无码不卡免费 被男狂揉吃奶胸60分钟视频 欧美成人免费观看在线看 免费看奶头视频的网站 女人扒开屁股让男人桶30分钟 被男狂揉吃奶胸60分钟视频 137裸交肉体摄影无需要下载 欧美人与动牲交片免费 欧美老少配孩交 精品一久久香蕉国产线看观看 精品一久久香蕉国产线看观看 黑人巨大精品欧美一区二区 亚洲日产无码中文字幕 大又大粗又爽又黄少妇毛片 玩弄少妇高潮A片 H纯肉无遮掩3D动漫在线观看 国产精品va在线观看无码电影 天天夜碰日日摸日日澡 h肉动漫无码无修6080动漫网 永久免费观看美女裸体的网站 强奷漂亮脱肉丝袜无码视频 男同桌把我腿打开摸到高潮 chinese熟女熟妇1乱老女人 欧美FREESEX黑人又粗又大 国产激情久久久久影院老熟女 欧美人体XXXX在线观看 337p人体粉嫩胞高清大图 国产精品国产三级国产普通话 欧洲肉欲k8播放毛片 国产精品久久久久久搜索 国产在线精品一区二区三区不卡 亚洲AV综合色区无码一区爱AV 人人人澡人人人妻人人人少妇 综合久久给合久久狠狠狠97色 影音先锋女人av鲁色资源网 各种姿势玩小处雏女视频 国产三级在线观看播放 韩国精品无码一区二区三区 国产av无码专区亚洲av麻豆 久久精品国产亚洲av麻豆 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 伊伊人成亚洲综合人网香 欧美另类69xxxxx Chinese男高中生白袜Gay自慰 欧美日韩一区二区综合 国产精品原创巨作av无遮挡 av无码久久久久不卡网站 亚洲va中文字幕无码久久一区 男女无遮挡羞羞视频免费网站 18禁超污无遮挡无码免费网站 女人zozozo禽交高潮喷水 同性男男黄G片免费网站 美女扒开阳道口图片 亚洲熟妇无码一区二区三区 永久免费观看美女裸体的网站 juliaann女医生在办公室 亚洲AV无码一区二区三区人妖 人禽杂交18禁网站免费 欧美XXXX做受欧美 永久免费观看美女裸体的网站 中文字幕av无码一区电影dvd 国产粉嫩高中生第一次不戴套 大又大粗又爽又黄少妇毛片 娇妻互换享受高潮 18禁无翼乌口工全彩大全 精品久久久久久中文字幕无码 国产精品va在线观看无码电影 欧美大胆A级视频 GOGO西西人体大尺寸大胆高清 精品欧美高清vivoesosex 久久亚洲天天做日日做 天天夜碰日日摸日日澡 一本大道久久A久久综合 国产精品国产三级国产普通话 久久国产乱子伦精品免费女 天天天欲色欲色www免费 欧美性受XXXX黑人XYX性爽 嫖农村40的妇女舒服正在播放 少妇爽滑多水高潮 男吃奶玩乳尖高潮60分钟视频 久久精品中文字幕一区 男同桌把我腿打开摸到高潮 国产成人免费无庶挡视频 偷窥厕所AAAAAA片 av鲁丝一区鲁丝二区鲁丝三区 大尺度无遮挡激烈床震网站 人妻少妇伦在线无码 无码永久免费AV网站不卡 国产成人免费无庶挡视频 性俄罗斯少妇交xx00 艳妇乳肉豪妇荡乳后续潘金莲 chinese 性 熟女bbw 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 厕所偷窥撒尿wcpeeingtube 亚洲AV男人电影天堂热APP xxxnxxx18小鲜肉gay 亚洲va中文字幕无码久久一区 丰满少妇被猛烈进入高清播放 厕所偷窥撒尿wcpeeingtube 337p日本欧洲亚洲大胆色噜噜 137裸交肉体摄影无需要下载 舌头伸进我下面很爽的动态图 久久人人做人人妻人人玩精品 国产成人免费无庶挡视频 亚洲AV综合色区无码一区爱AV 国产三级精品三级男人的天堂 国产三级在线观看播放 xxxnxxx18小鲜肉gay Chinese男高中生白袜Gay自慰 137裸交肉体摄影无需要下载 美女扒开阳道口图片 久久精品无码专区免费东京热 天天干天天日 国产精品无码2021在线观看 国产av无码专区亚洲av麻豆 两个人日本免费完整版高清 免费a级作爱片免费观看美国 女邻居夹得好紧太爽了A片 丰满熟妇乱又伦 久久久亚洲欧洲日产国码AⅤ 久久99精品久久久久久清纯 艳妇乳肉豪妇荡乳后续潘金莲 神马影院我不卡 欧美人与动xxxxz0oz 国产av无码亚洲avh 舌头伸进我下面很爽的动态图 西西大胆国模人体艺 舌头伸进我下面很爽的动态图 国产三级精品三级男人的天堂 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 欧美性白人极品1819hd 美女扒开阳道口图片 久久人人做人人妻人人玩精品 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 人人人澡人人人妻人人人少妇 免费看美女被靠到爽的视频 大又大粗又爽又黄少妇毛片 国产无遮挡裸体免费视频 黑人巨大精品欧美一区二区 人与动人物XXXX毛片 GOGO西西人体大尺寸大胆高清 男人边吃奶边添下面好爽视频 欧美老少配孩交 丰满少妇人妻HD高清大乳在线 亚洲AV男人电影天堂热APP 亚洲成a∨人片在线观看无码 同性男男黄G片免费网站 少妇乱子伦精品无码专区 舌头伸进我下面很爽的动态图 女人扒开屁股让男人桶30分钟 中文字幕一区二区人妻 在线亚洲高清揄拍自拍一品区 久久99九九精品久久久久齐齐 免费A片在线观看 哒哒哒免费视频观看在线www 亚洲熟妇无码一区二区三区 久久99精品久久久久久清纯 欧洲肉欲k8播放毛片 zzijzzij亚洲日本少妇jizjiz 中文字幕亚洲欧美在线不卡 舌头伸进我下面很爽的动态图 欧美日韩一区二区综合 国产三级在线观看播放 最刺激的交换夫妇中文字幕 最刺激的交换夫妇中文字幕 毛茸茸性xxxx毛茸茸毛茸茸 黑人巨大精品欧美一区二区 精品久久久久久中文字幕无码 欧美日韩国产免费一区二区三区 国产三级精品三级在线专区1 日韩无码电影 真实国产乱子伦清晰对白视频 久久99精品久久久久久清纯 老少交玩tube少老配 女人与公拘交酡过程 精品BBwBBwBBwBBw 丰满少妇被猛烈进入高清播放 爽看1069gey男男视频 看全色黄大色大片免费久久 综合久久给合久久狠狠狠97色 国产成人剧情AV麻豆映画 精品欧美高清vivoesosex 久久精品国产亚洲AV麻豆 国产精品va在线观看无码电影 亚洲欧洲自拍拍偷午夜色无码 欧美另类69xxxxx 欧美gay无套粗大激情 哒哒哒免费视频观看在线www 欧美人与动牲交片免费 亚洲熟妇少妇任你躁在线观看 精品久久久久久中文字幕无码 国产精品va在线观看无码电影 18禁黄无遮挡免费网站动漫 免费无码不卡视频在线观看 国产又色又爽又黄刺激的视频 国产精品视频yjizz 综合久久给合久久狠狠狠97色 日韩精品无码视频免费专区 又大又粗欧美黑人a片 国产草莓视频无码a在线观看 亚洲熟妇无码一区二区三区 免费国产黄网站在线观看视频 精品无码中出一区二区 一本大道久久A久久综合 韩国精品无码一区二区三区 最刺激的交换夫妇中文字幕 男人边吃奶边添下面好爽视频 厨房掀起裙子从后面进去视频 女人与公拘交酡过程 免费看国产成年无码av 在线播放免费人成毛片乱码 大又大粗又爽又黄少妇毛片 娇妻互换享受高潮 久久人妻无码中文字幕 欧美大胆A级视频 办公室娇喘的短裙老师在线 中文字幕亚洲欧美在线不卡 国产三级精品三级男人的天堂 H动漫无遮挡成本人H视频 爽看1069gey男男视频 JAPANESE成熟丰满熟妇 国产三级精品三级在线专区1 嫖农村40的妇女舒服正在播放 国产三级精品三级男人的天堂 婷婷色婷婷开心五月四房播播 中国农村真实BBWBBWBBW 免费国产A国产片高清网站 性偷窥tube凸凹视频 亚洲制服丝袜av一区二区三区 看全色黄大色大片免费久久 亚洲丁香五月激情综合 亚洲熟妇无码一区二区三区 欧美成人免费观看在线看 国产精品国产三级国产普通话 人禽杂交18禁网站免费 国产三级精品三级在线专区1 末发育娇小性色xxxxx 久久99精品久久久久久清纯 久久精品国产亚洲av麻豆 亚洲国产综合无码一区二区三区 男人j进女人p免费视频 国产激情久久久久影院老熟女 秋霞电影院午夜无码免费视频 欧美gay无套粗大激情 chinese 性 熟女bbw 欧美大胆A级视频 av鲁丝一区鲁丝二区鲁丝三区 娇妻被生人粗大猛烈进出高潮 哒哒哒免费视频观看在线www 欧美精品亚洲精品日韩久久 亚洲欧洲自拍拍偷午夜色无码 999ZYZ玖玖资源站永久 h肉动漫无码无修6080动漫网 国产成人免费无庶挡视频 日韩无码电影 H纯肉无遮掩3D动漫在线观看 出差我被公高潮a片 两个人日本免费完整版高清 国内真实愉拍系列在线视频 亚洲AV无码一区二区三区人妖 美女扒开阳道口图片 女邻居夹得好紧太爽了A片 女人与公拘交的A片视频网站 玩弄少妇高潮A片 欧美xxxx极品丰满 国产香蕉尹人在线视频你懂的 欧美性白人极品1819hd 久久久久无码精品国产 黑人巨大精品欧美一区二区 免费无码不卡视频在线观看 亚洲色偷拍区另类无码专区 国产av无码专区亚洲av麻豆 日本被黑人强伦姧人妻完整版 国产亚洲欧美日韩俺去了 国产草莓视频无码a在线观看 国产三级精品三级在专区 手机看片久久国产永久免费 欧美FREESEX黑人又粗又大 草莓视频在线 国产精品原创巨作av无遮挡 舌头伸进我下面很爽的动态图 男人狂躁进女人下面视频 男人j进女人p免费视频 日本被黑人强伦姧人妻完整版 欧美xxxxzozo另类特级 大尺度无遮挡激烈床震网站 印度性BBBBBXXXXX 免费A片在线观看 18禁超污无遮挡无码免费网站 少妇人妻在线无码天堂视频网 欧美成人经典三级在线观看 丰满少妇人妻HD高清大乳在线 JAPANESE成熟丰满熟妇 国产激情久久久久影院老熟女 国产真实夫妇交换视频 国产帅男男GAY网站视频 免费无码不卡视频在线观看 国产AV自拍 爽看1069gey男男视频 农村极度乱人伦的小说1一3续 秋霞电影院午夜无码免费视频 亚洲色偷拍区另类无码专区 丰满少妇被猛烈进入高清播放 久久久亚洲欧洲日产国码AⅤ 欧美另类69xxxxx 丰满多毛的大隂户 18禁黄无遮挡免费网站动漫 丰满少妇被猛烈进入高清播放 免费A片在线观看 中文字幕亚洲欧美在线不卡 久久人人做人人妻人人玩精品 久久精品国产亚洲AV麻豆 男同桌把我腿打开摸到高潮 国产无遮挡裸体免费视频 国精品午夜福利视频不卡麻豆 两个人日本免费完整版高清 女人与公拘交酡过程 亚洲AV无码一区二区三区人妖 国产三级精品三级男人的天堂 中国农村真实BBWBBWBBW 国产色爱av资源综合区 办公室娇喘的短裙老师在线 国产精品合集久久久久 丰满少妇人妻HD高清大乳在线 亂倫近親相姦中文字幕 变态sm天堂无码专区 中文字幕亚洲欧美在线不卡 中文字幕无码A片久久东京热喷水 丰满人妻被公侵犯日本电影 免费看奶头视频的网站 在厨房乱子伦在线观看 国产香蕉尹人在线视频你懂的 两个男人添我下面试看十分钟 h肉动漫无码无修6080动漫网 国产精品大屁股白浆一区二区 秋霞电影院午夜无码免费视频 亚洲av无码一区二区乱子伦 av永久天堂一区二区三区 厕所偷窥撒尿wcpeeingtube 3344成年在线视频免费播放 丰满少妇人妻HD高清大乳在线 毛茸茸性xxxx毛茸茸毛茸茸 影音先锋女人av鲁色资源网 人人添人人澡人人澡人人人人 俄罗斯少妇性XXXX 公车好紧好爽再搔一点浪一点 欧洲肉欲k8播放毛片 国产jizzjizz麻豆全部免费 亚洲色播爱爱爱爱爱爱爱 av鲁丝一区鲁丝二区鲁丝三区 人人添人人澡人人澡人人人人 国精品午夜福利视频不卡麻豆 久久精品中文字幕一区 国产精品久久久久精品三级 大胆欧美熟妇xxmature 国产精品久久久久久搜索 大又大粗又爽又黄少妇毛片 大尺度无遮挡激烈床震网站 国内真实愉拍系列在线视频 孕妇奶水仑乱A级毛片免费看 久久精品国产亚洲AV麻豆 农村极度乱人伦的小说1一3续 亚洲欧洲自拍拍偷午夜色无码 精品一久久香蕉国产线看观看 真实国产乱子伦清晰对白视频 女子自慰喷潮A片免费观看 两个男人添我下面试看十分钟 国产香蕉尹人在线视频你懂的 大尺度无遮挡激烈床震网站 久久国产乱子伦精品免费女 久久精品无码专区免费东京热 国产精品永久免费 国产精品原创巨作av无遮挡 精品欧美高清vivoesosex h肉动漫无码无修6080动漫网 亚洲国产初高中生女av 国模国产精品嫩模大尺度视频 国模大胆一区二区三区 国产精品va在线观看无码电影 欧美成人免费观看在线看 被男狂揉吃奶胸60分钟视频 大又大粗又爽又黄少妇毛片 zzijzzij亚洲日本少妇jizjiz 被男狂揉吃奶胸60分钟视频 印度性BBBBBXXXXX 欧美FREESEX黑人又粗又大 亚洲色偷拍区另类无码专区 免费国产A国产片高清网站 性偷窥tube凸凹视频 少妇爽滑多水高潮 欧美性受XXXX黑人XYX性爽 特级大黄a片免费播放 国模国产精品嫩模大尺度视频 xxxnxxx18小鲜肉gay jzzijzzij日本成熟少妇 老妇肥熟凸凹丰满刺激 手机在线看永久av片免费 亚洲色无码专区一区 顶级丰满少妇a级毛片 国产帅男男GAY网站视频 欧美性受XXXX黑人XYX性爽 厨房掀起裙子从后面进去视频 阳茎伸入女人的阳道免费视频 999ZYZ玖玖资源站永久 亚洲丁香五月激情综合 亚洲熟妇少妇任你躁在线观看 各种姿势玩小处雏女视频 厨房掀起裙子从后面进去视频 男女肉粗暴进来120秒动态图 久久精品无码专区免费东京热 公车好紧好爽再搔一点浪一点 女子自慰喷潮A片免费观看 国产三级精品三级在专区 veronica吸茎女王avluv 两个奶头被吃高潮视频 大胆欧美熟妇xxmature 丰满少妇被猛烈进入高清播放 欧美xxxx极品丰满 少妇乱子伦精品无码专区 久久99九九精品久久久久齐齐 野花高清在线观看视频www 国产激情久久久久影院老熟女 男人狂躁进女人下面视频 欧美大胆A级视频 欧美另类69xxxxx 手伸进内衣使劲揉搓奶头漫画 永久免费观看美女裸体的网站 国产精品边做奶水狂喷无码 欧美老少配孩交 3344成年在线视频免费播放 欧美日韩一区二区综合 亚洲人成绝费网站色www吃脚 欧美性白人极品1819hd 中文字幕韩国三级理论 国产精品国产三级国产普通话 东北女人毛多水多牲交视频 久久精品国产亚洲AV麻豆 性俄罗斯少妇交xx00 国产精品无码2021在线观看 强奷绝色年轻女教师 丰满多毛的大隂户 神马影院我不卡 免费看av在线网站网址 137裸交肉体摄影无需要下载 亚洲精品 末发育娇小性色xxxxx 夜夜未满十八勿进的爽爽影院 亚洲色播爱爱爱爱爱爱爱 又大又粗欧美黑人a片 看全色黄大色大片免费久久 国产真实夫妇交换视频 免费看国产成年无码av 狠狠狠的在啪线香蕉亚洲应用 亚洲日产无码中文字幕 性欧美丰满熟妇XXXX性 美女极品粉嫩美鮑20p图 婷婷色婷婷开心五月四房播播 jzzijzzij日本成熟少妇 欧美FREESEX黑人又粗又大 Chinese男高中生白袜Gay自慰 亚洲国产成人精品无码区 女人与公拘交酡过程 中文字幕av无码不卡免费 男女肉粗暴进来120秒动态图 美女极品粉嫩美鮑20p图 老太婆毛多bbwbbwbbwbbw播放 色欲日日拍夜夜嗷嗷叫 男女无遮挡羞羞视频免费网站 久久人人做人人妻人人玩精品 国产精品边做奶水狂喷无码 国产三级精品三级在线专区1 精品无码中出一区二区 丰满少妇人妻HD高清大乳在线 久久人妻无码中文字幕 中国老妇BBB视频老少配 亚洲国产成人精品无码区 在线 亚洲 国产 人禽杂交18禁网站免费 被十几个男人扒开腿猛戳 少妇爽滑多水高潮 国产成人免费无庶挡视频 性xxxxfreexxxxx欧美牲交 337p人体粉嫩胞高清大图 人妻夜夜爽天天爽欧美色院 看全色黄大色大片免费久久 H肉动漫无码无修6080动漫网 人人人澡人人人妻人人人少妇 全黄性性激高免费视频 国产av无码专区亚洲av麻豆 欧美性白人极品1819hd 亚洲丁香五月激情综合 女闺蜜把我下面摸到高潮喷水 末发育娇小性色xxxxx 韩国三级伦在线观看久 国产三级在线观看播放 男女肉粗暴进来120秒动态图 大又大粗又爽又黄少妇毛片 国产三级在线观看播放 久久精品无码专区免费东京热 手机看片久久国产永久免费 亚洲欧洲自拍拍偷午夜色无码 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 大又大粗又爽又黄少妇毛片 人人人澡人人人妻人人人少妇 两个人日本免费完整版高清 女子自慰喷潮A片免费观看 久久人人做人人妻人人玩精品 男同桌把我腿打开摸到高潮 丰满熟妇乱又伦 欧美人与动牲交片免费 性偷窥tube凸凹视频 免费国产A国产片高清网站 chinese猛男自慰gv白袜喷浆 亚洲色无码专区一区 老湿机69福利区无码 一女多男同时进6根同时进行 免费A片在线观看 免费国产A国产片高清网站 哒哒哒免费视频观看在线www 性欧美丰满熟妇XXXX性 在线播放免费人成毛片乱码 又黄又爽的成人免费视频 国精品午夜福利视频不卡麻豆 女邻居夹得好紧太爽了A片 3344成年在线视频免费播放 18禁黄无遮挡免费网站动漫 厨房掀起裙子从后面进去视频 中文字幕无码A片久久东京热喷水 免费A片在线观看 3344成年在线视频免费播放 亚洲国产成人精品无码区 无码av免费一区二区三区 手伸进内衣使劲揉搓奶头漫画 女人与公拘交酡过程 手机在线看永久av片免费 久久人人做人人妻人人玩精品 丰满少妇人妻HD高清大乳在线 真实国产乱子伦清晰对白视频 看全色黄大色大片免费久久 zzijzzij亚洲日本少妇jizjiz 欧美XXXX做受欧美 国产三级精品三级男人的天堂 久久精品国产亚洲av高清! 免费看美女被靠到爽的视频 veronica吸茎女王avluv 丰满少妇人妻HD高清大乳在线 亚洲欧洲自拍拍偷午夜色无码 JAPANESE成熟丰满熟妇 中文字幕av无码不卡免费 久久亚洲天天做日日做 性xxxxfreexxxxx欧美牲交 JAPANESE成熟丰满熟妇 亚洲AV无码专区国产乱码不卡 美女扒开阳道口图片 亂倫近親相姦中文字幕 免费看美女被靠到爽的视频 无码av免费一区二区三区 无码av免费一区二区三区 同性男男黄G片免费网站 欧美人与动牲交片免费 18禁黄无遮挡免费网站动漫 老太婆性杂交欧美肥老太 久久99九九精品久久久久齐齐 亚洲日产无码中文字幕 欧美 大陆 偷拍 精品 国产午夜福利在线观看红一片 秋霞电影院午夜无码免费视频 男女肉粗暴进来120秒动态图 欧美XXXXZOZO另类特级 亚洲国产成人精品无码区 免费无码不卡视频在线观看 厕所偷窥撒尿wcpeeingtube 两个奶头被吃高潮视频 天天天欲色欲色www免费 国模国产精品嫩模大尺度视频 孕妇奶水仑乱A级毛片免费看 粗大挺进朋友的未婚妻 日韩精品无码视频免费专区 两个人日本免费完整版高清 强奷漂亮脱肉丝袜无码视频 强奷绝色年轻女教师 久久久亚洲欧洲日产国码AⅤ 丰满熟妇乱又伦 137裸交肉体摄影无需要下载 中文字幕韩国三级理论 GOGO西西人体大尺寸大胆高清 中文字幕一区二区人妻 H纯肉无遮掩3D动漫在线观看 3344成年在线视频免费播放 国产av无码专区亚洲av麻豆 国产午夜福利在线观看红一片 欧美另类69xxxxx 久久久亚洲欧洲日产国码AⅤ H肉动漫无码无修6080动漫网 久久精品99久久香蕉国产 秋霞电影院午夜无码免费视频 女闺蜜把我下面摸到高潮喷水 欧美成人经典三级在线观看 国产精品视频yjizz 丰满少妇被猛烈进入高清播放 亂倫近親相姦中文字幕 成在线人av免费无码高潮喷水 中国老妇BBB视频老少配 精品BBwBBwBBwBBw 欧美成人经典三级在线观看 东北女人毛多水多牲交视频 国产三级精品三级男人的天堂 阳茎伸入女人的阳道免费视频 人人添人人澡人人澡人人人人 无码av免费一区二区三区 美女极品粉嫩美鮑20p图 国产精品大屁股白浆一区二区 在线播放国产一区二区三区 GOGO西西人体大尺寸大胆高清 国产激情久久久久影院老熟女 免费A片在线观看 欧美大胆A级视频 国产精品永久免费 手机看片久久国产永久免费 在线播放免费人成毛片乱码 强奷绝色年轻女教师 粗大挺进朋友的未婚妻 手机在线看永久av片免费 欧美人体XXXX在线观看 中文字幕av无码不卡免费 在厨房乱子伦在线观看 国产三级在线观看播放 同性男男黄G片免费网站 最刺激的交换夫妇中文字幕 男女肉粗暴进来120秒动态图 国精品午夜福利视频不卡麻豆 国产粉嫩高中生第一次不戴套 手伸进内衣使劲揉搓奶头漫画 久久久久无码精品国产 国产a∨国片精品青草社区 veronica吸茎女王avluv 中文字幕av无码一区电影dvd 偷窥厕所AAAAAA片 手机在线看永久av片免费 久久人人做人人妻人人玩精品 久久人人做人人妻人人玩精品 神马影院我不卡 女人与公拘交的A片视频网站 亚洲AV综合色区无码一区爱AV 国产粉嫩高中生第一次不戴套 久久精品无码专区免费东京热 欧美日韩一区二区综合 999ZYZ玖玖资源站永久 国产香蕉尹人在线视频你懂的 看全色黄大色大片免费久久 捆绑白丝jk震动捧娇喘 日韩精品无码视频免费专区 亚洲日韩在线中文字幕综合 亚洲AV无码专区国产乱码不卡 xxxnxxx18小鲜肉gay 女人与公拘交酡过程 野花高清在线观看视频www 亚洲欧洲自拍拍偷午夜色无码 国产精品边做奶水狂喷无码 被男狂揉吃奶胸60分钟视频 日韩无码电影 欧美FREESEX黑人又粗又大 国产精品久久久久久搜索 亚洲国产初高中生女av 欧美精品亚洲精品日韩久久 欧洲肉欲k8播放毛片 亚洲欧洲自拍拍偷午夜色无码 两个男人添我下面试看十分钟 男人J桶进女人P无遮挡 出差我被公高潮a片 办公室娇喘的短裙老师在线 久久亚洲欧美国产精品 欧美成人免费观看在线看 精品久久久久久中文字幕无码 两个男人添我下面试看十分钟 亚洲日产无码中文字幕 大尺度无遮挡激烈床震网站 欧美XXXX做受欧美 18禁无翼乌口工全彩大全 色欲人妻综合网 偷窥厕所AAAAAA片 人妻中文字系列无码专区 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 H纯肉无遮掩3D动漫在线观看 女子自慰喷潮A片免费观看 久久精品中文字幕一区 老太婆毛多bbwbbwbbwbbw播放 神马影院我不卡 精品久久久久久中文字幕无码 欧美成人经典三级在线观看 精品欧美高清vivoesosex 出差我被公高潮a片 孕妇奶水仑乱A级毛片免费看 厨房掀起裙子从后面进去视频 chinese猛男自慰gv白袜喷浆 欧美XXXXZOZO另类特级 女邻居的大乳中文字幕 精品无码中出一区二区 久久99精品久久久久久清纯 公车好紧好爽再搔一点浪一点 女人与公拘交酡过程 杨贵妃4级纵欲丰满裸体毛片 337p日本欧洲亚洲大胆色噜噜 欧美成人免费观看在线看 久久精品国产亚洲av高清! 中文字幕av无码不卡免费 欧美大胆A级视频 影音先锋女人av鲁色资源网 性欧美丰满熟妇XXXX性 男女肉粗暴进来120秒动态图 杨贵妃4级纵欲丰满裸体毛片 在线播放免费人成毛片乱码 久久精品国产亚洲av麻豆 久久国产乱子伦精品免费女 国产男女猛烈无遮挡免费视频 久久精品国产亚洲av麻豆 厕所偷窥撒尿wcpeeingtube 夜夜未满十八勿进的爽爽影院 jzzijzzij日本成熟少妇 久久人人做人人妻人人玩精品 国产精品永久免费 juliaann女医生在办公室 亚洲成a∨人片在线观看无码 人与动人物XXXX毛片 艳妇乳肉豪妇荡乳后续潘金莲 艳妇乳肉豪妇荡乳后续潘金莲 chinese熟妇与小伙子mature 3344成年在线视频免费播放 被男狂揉吃奶胸60分钟视频 顶级丰满少妇a级毛片 欧美性受XXXX黑人XYX性爽 办公室娇喘的短裙老师在线 亚洲日产无码中文字幕 大又大粗又爽又黄少妇毛片 老太婆性杂交欧美肥老太 韩国日本三级在线观看 美团外卖猛男gayb0y1069 久久99精品久久久久久清纯 又黄又爽的成人免费视频 jzzijzzij日本成熟少妇 久久精品国产亚洲AV麻豆 18禁超污无遮挡无码免费网站 末发育娇小性色xxxxx 久久久亚洲欧洲日产国码AⅤ 孕妇奶水仑乱A级毛片免费看 又黄又爽的成人免费视频 婷婷色婷婷开心五月四房播播 天天干天天日 免费看国产成年无码av 中国老妇BBB视频老少配 黑人巨大精品欧美一区二区 人妻中文字系列无码专区 国模大胆一区二区三区 丰满少妇人妻HD高清大乳在线 婷婷色婷婷开心五月四房播播 中文字幕av无码不卡免费 欧美xxxxzozo另类特级 各种姿势玩小处雏女视频 欧美FREESEX黑人又粗又大 性欧美丰满熟妇XXXX性 综合久久给合久久狠狠狠97色 色先锋AV影音先锋在线 亚洲AV综合色区无码一区爱AV 中文字幕av无码不卡免费 欧洲肉欲k8播放毛片 国产精品一区二区在线观看 欧美极品少妇做受 在线亚洲高清揄拍自拍一品区 两个男人添我下面试看十分钟 孕妇奶水仑乱A级毛片免费看 东北女人毛多水多牲交视频 亚洲国产初高中生女av 国产av无码专区亚洲av麻豆 日韩无码电影 性激烈的欧美三级视频 欧美XXXXZOZO另类特级 国产亚洲欧美日韩俺去了 亚洲国产成人精品无码区 国产精品无码2021在线观看 久久亚洲欧美国产精品 大胆欧美熟妇xxmature 免费无码不卡视频在线观看 137裸交肉体摄影无需要下载 白丝极品老师娇喘呻吟视频 久久国产乱子伦精品免费女 韩国三级伦在线观看久 少妇爽滑多水高潮 毛茸茸性xxxx毛茸茸毛茸茸 中文字幕亚洲欧美在线不卡 永久免费观看美女裸体的网站 3344成年在线视频免费播放 欧美XXXX做受欧美 末发育娇小性色xxxxx 成在线人av免费无码高潮喷水 国产精品永久免费 欧美另类69xxxxx 大又大粗又爽又黄少妇毛片 亚洲人成绝费网站色www吃脚 亂倫近親相姦中文字幕 女人与公拘交酡过程 中文字幕亚洲欧美在线不卡 欧美xxxxzozo另类特级 国内揄拍国内精品少妇 JAPANESE成熟丰满熟妇 久久亚洲欧美国产精品 亚洲人成绝费网站色www吃脚 久久人妻无码中文字幕 亚洲欧洲自拍拍偷午夜色无码 欧美另类69xxxxx 国产午夜福利在线观看红一片 综合图区亚洲欧美另类图片 久久精品99久久香蕉国产 3344成年在线视频免费播放 捆绑白丝jk震动捧娇喘 伊伊人成亚洲综合人网香 男人J桶进女人P无遮挡 杨贵妃4级纵欲丰满裸体毛片 男人狂躁进女人下面视频 亚洲va中文字幕无码久久一区 人与动人物XXXX毛片 欧美XXXXZOZO另类特级 中文字幕精品无码亚洲字幕 国产精品久久久久精品三级 国产av无码专区亚洲av麻豆 在线 亚洲 国产 亚洲AV男人电影天堂热APP 性xxxxfreexxxxx欧美牲交 chinese猛男自慰gv白袜喷浆 娇妻互换享受高潮 337p人体粉嫩胞高清大图 juliaann女医生在办公室 豪妇荡乳1一5潘金莲 女子自慰喷潮A片免费观看 久久久亚洲欧洲日产国码AⅤ 国产三级在线观看播放 国产AV自拍 3344成年在线视频免费播放 国产亚洲欧美日韩俺去了 18禁无翼乌口工全彩大全 免费网站看v片在线18禁无码 久久精品中文字幕一区 Chinese男高中生白袜Gay自慰 性俄罗斯少妇交xx00 永久免费观看美女裸体的网站 婷婷亚洲综合五月天小说 欧美人体XXXX在线观看 欧美人体XXXX在线观看 久久免费看黄A级毛片 同性男男黄G片免费网站 国产粉嫩高中生第一次不戴套 免费A片在线观看 久久人人做人人妻人人玩精品 亚洲日韩在线中文字幕综合 国产三级在线观看播放 免费看美女被靠到爽的视频 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 超碰国产人人做人人爽久 亚洲制服丝袜av一区二区三区 在线播放免费人成毛片乱码 欧美性白人极品1819hd 久久精品无码专区免费东京热 久久亚洲欧美国产精品 亚洲欧洲自拍拍偷午夜色无码 精品国产第一国产综合精品 337p日本欧洲亚洲大胆色噜噜 国产三级在线观看播放 大又大粗又爽又黄少妇毛片 娇妻被生人粗大猛烈进出高潮 免费看美女被靠到爽的视频 久久精品99久久香蕉国产 毛茸茸性xxxx毛茸茸毛茸茸 强奷绝色年轻女教师 小说 亚洲 无码 舌头伸进我下面很爽的动态图 杨贵妃4级纵欲丰满裸体毛片 末发育娇小性色xxxxx 少妇爽滑多水高潮 免费国产A国产片高清网站 中文字幕被公侵犯的漂亮人妻 亂倫近親相姦中文字幕 中文字幕亚洲欧美在线不卡 亚洲欧洲自拍拍偷午夜色无码 同性男男黄G片免费网站 少妇乱子伦精品无码专区 xxxnxxx18小鲜肉gay 亚洲精品 精品欧美高清vivoesosex 九色综合狠狠综合久久 欧美XXXX做受欧美 女子自慰喷潮A片免费观看 精品无码中出一区二区 免费无码不卡视频在线观看 欧美xxxxzozo另类特级 chinese 性 熟女bbw 曰韩亚洲AV人人夜夜澡人人爽 真实国产乱子伦清晰对白视频 中文字幕韩国三级理论 久久精品中文字幕一区 av鲁丝一区鲁丝二区鲁丝三区 亂倫近親相姦中文字幕 欧美性受XXXX黑人XYX性爽 国产精品va在线观看无码电影 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 亲嘴扒胸摸屁股激烈网站 超碰国产人人做人人爽久 国产精品原创巨作av无遮挡 精品BBwBBwBBwBBw 欧美极品少妇做受 丰满少妇被猛烈进入高清播放 精品无码中出一区二区 被老头玩弄邻居人妻中文字幕 综合久久给合久久狠狠狠97色 国产综合色产在线视频欧美 久久国产乱子伦精品免费女 国产三级精品三级在专区 在线播放免费人成毛片乱码 色欲日日拍夜夜嗷嗷叫 秋霞电影院午夜无码免费视频 男人J桶进女人P无遮挡 精品一久久香蕉国产线看观看 丰满熟妇乱又伦 欧美FREESEX黑人又粗又大 H肉动漫无码无修6080动漫网 顶级丰满少妇a级毛片 国产99视频精品免视看7 天天操天天干 综合久久给合久久狠狠狠97色 毛茸茸性xxxx毛茸茸毛茸茸 色欲人妻综合网 国产AV自拍 久久久久无码精品国产 亚洲国产精品无码久久一线夕 被老头玩弄邻居人妻中文字幕 厨房掀起裙子从后面进去视频 女邻居夹得好紧太爽了A片 永久免费观看美女裸体的网站 少妇乱子伦精品无码专区 杨贵妃4级纵欲丰满裸体毛片 天天操天天干 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 免费网站看v片在线18禁无码 欧美极品少妇做受 国产男女猛烈无遮挡免费视频 av鲁丝一区鲁丝二区鲁丝三区 亚洲va中文字幕无码久久一区 玩弄少妇高潮A片 两个男人添我下面试看十分钟 日韩精品无码视频免费专区 亚洲制服丝袜av一区二区三区 日本肉体XXXX裸体137大胆 国产精品大屁股白浆一区二区 国产在线精品一区二区三区不卡 国产帅男男GAY网站视频 伊伊人成亚洲综合人网香 久久精品无码专区免费东京热 亚洲国产成人精品无码区 成在线人av免费无码高潮喷水 久久精品无码专区免费东京热 手伸进内衣使劲揉搓奶头漫画 国产成人剧情AV麻豆映画 国产99视频精品免视看7 国模国产精品嫩模大尺度视频 欧美性受XXXX黑人XYX性爽 国产AV自拍 国模国产精品嫩模大尺度视频 GOGO西西人体大尺寸大胆高清 人人人澡人人人妻人人人少妇 久久久久无码精品国产 亚洲AV无码一区二区三区人妖 舌头伸进我下面很爽的动态图 无码av免费一区二区三区 手伸进内衣使劲揉搓奶头漫画 H动漫无遮挡成本人H视频 免费A片在线观看 女子自慰喷潮A片免费观看 办公室娇喘的短裙老师在线 GOGO西西人体大尺寸大胆高清 手伸进内衣使劲揉搓奶头漫画 欧美 大陆 偷拍 精品 厨房掀起裙子从后面进去视频 两个男人添我下面试看十分钟 神马影院我不卡 少妇人妻在线无码天堂视频网 国产99视频精品免视看7 欧美极品少妇做受 国产99视频精品免视看7 H肉动漫无码无修6080动漫网 亚洲精品 在线亚洲高清揄拍自拍一品区 精品无码中出一区二区 国产午夜福利在线观看红一片 中文字幕av无码不卡免费 欧美xxxxzozo另类特级 看全色黄大色大片免费久久 厨房掀起裙子从后面进去视频 亚洲日韩在线中文字幕综合 精品BBwBBwBBwBBw 精品无码中出一区二区 精品国产第一国产综合精品 chinese猛男自慰gv白袜喷浆 亚洲日韩在线中文字幕综合 东北女人毛多水多牲交视频 国产精品永久免费 国产精品边做奶水狂喷无码 人妻夜夜爽天天爽欧美色院 chinese猛男自慰gv白袜喷浆 老少交玩tube少老配 女子自慰喷潮A片免费观看 人妻中文字系列无码专区 亚洲AV综合色区无码一区爱AV 精品无码中出一区二区 中文字幕av无码不卡免费 欧美XXXX做受欧美 免费国产黄网站在线观看视频 同性男男黄G片免费网站 国产三级在线观看播放 juliaann女医生在办公室 欧美老少配孩交 国产精品永久免费 女人与公拘交酡过程 欧美大胆A级视频 九色综合狠狠综合久久 特级大黄a片免费播放 国产成人剧情AV麻豆映画 男吃奶玩乳尖高潮60分钟视频 手机在线看永久av片免费 国产无遮挡裸体免费视频 少妇人妻在线无码天堂视频网 九色综合狠狠综合久久 国产又色又爽又黄刺激的视频 久久精品无码专区免费东京热 欧美xxxxzozo另类特级 草莓视频在线 国产粉嫩高中生第一次不戴套 JAPANESE成熟丰满熟妇 各种姿势玩小处雏女视频 亚洲AV综合色区无码一区爱AV 国产香蕉尹人在线视频你懂的 永久免费观看美女裸体的网站 欧美极品少妇做受 丰满少妇人妻HD高清大乳在线 欧美xxxx极品丰满 娇妻被生人粗大猛烈进出高潮 少妇爽滑多水高潮 欧美成人经典三级在线观看 欧美大胆A级视频 末发育娇小性色xxxxx 西西大胆国模人体艺 国产精品原创巨作av无遮挡 人人人澡人人人妻人人人少妇 国产精品永久免费 精品久久久久久中文字幕无码 男人J桶进女人P无遮挡 zzijzzij亚洲日本少妇jizjiz 阳茎伸入女人的阳道免费视频 久久精品国产亚洲AV麻豆 国产精品永久免费 粗大挺进朋友的未婚妻 国产精品大屁股白浆一区二区 人人人澡人人人妻人人人少妇 国产色爱av资源综合区 杨贵妃4级纵欲丰满裸体毛片 永久免费观看美女裸体的网站 娇妻互换享受高潮 九色综合狠狠综合久久 中文字幕av无码不卡免费 婷婷色婷婷开心五月四房播播 精品欧美高清vivoesosex 丰满人妻被公侵犯日本电影 久久99九九精品久久久久齐齐 欧美大胆A级视频 国产成人免费无庶挡视频 人人添人人澡人人澡人人人人 国产精品久久久久久搜索 在线播放国产一区二区三区 av永久天堂一区二区三区 日本肉体XXXX裸体137大胆 国产男女猛烈无遮挡免费视频 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 中文字幕被公侵犯的漂亮人妻 Chinese男高中生白袜Gay自慰 亚洲色大成网站WWW永久男同 西西大胆国模人体艺 男女肉粗暴进来120秒动态图 日本肉体XXXX裸体137大胆 俄罗斯少妇性XXXX 变态sm天堂无码专区 18禁超污无遮挡无码免费网站 强奷绝色年轻女教师 无码av免费一区二区三区 俄罗斯少妇性XXXX 欧美XXXX做受欧美 成在线人av免费无码高潮喷水 看全色黄大色大片免费久久 国产三级精品三级男人的天堂 偷窥厕所AAAAAA片 久久99精品久久久久久清纯 jzzijzzij日本成熟少妇 男同桌把我腿打开摸到高潮 国产在线精品一区二区三区不卡 男女肉粗暴进来120秒动态图 哒哒哒免费视频观看在线www 最刺激的交换夫妇中文字幕 国产精品视频yjizz 国产无遮挡裸体免费视频 国产精品va在线观看无码电影 日本XXXX色视频在线观看免费 久久99精品久久久久久清纯 久久人人做人人妻人人玩精品 免费看av在线网站网址 西西大胆国模人体艺 男人边吃奶边添下面好爽视频 被男狂揉吃奶胸60分钟视频 久久精品中文字幕一区 被十几个男人扒开腿猛戳 女人与公拘交酡过程 zzijzzij亚洲日本少妇jizjiz 中文字幕韩国三级理论 手机在线看永久av片免费 国产精品原创巨作av无遮挡 中文字幕精品无码亚洲字幕成a人 国产精品原创巨作av无遮挡 女人zozozo禽交高潮喷水 被男狂揉吃奶胸60分钟视频 杨贵妃4级纵欲丰满裸体毛片 国产又色又爽又黄刺激的视频 天天操天天干 久久国产乱子伦精品免费女 欧美人体XXXX在线观看 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 中文字幕精品无码亚洲字幕成a人 久久人人做人人妻人人玩精品 女闺蜜把我下面摸到高潮喷水 又黄又爽的成人免费视频 精品久久久久香蕉网 国产香蕉尹人在线视频你懂的 亚洲色大成网站WWW永久男同 最刺激的交换夫妇中文字幕 神马影院我不卡 中文字幕av无码一区电影dvd 人妻夜夜爽天天爽欧美色院 久久国产乱子伦精品免费女 h肉动漫无码无修6080动漫网 办公室娇喘的短裙老师在线 免费国产A国产片高清网站 豪妇荡乳1一5潘金莲 国产在线精品一区二区三区不卡 色先锋av影音先锋在线 最刺激的交换夫妇中文字幕 特级大黄a片免费播放 哒哒哒免费视频观看在线www 亂倫近親相姦中文字幕 神马影院我不卡 国产又色又爽又黄刺激的视频 欧美 大陆 偷拍 精品 办公室娇喘的短裙老师在线 一本大道久久A久久综合 18禁无翼乌口工全彩大全 性欧美丰满熟妇XXXX性 免费无码不卡视频在线观看 在线播放国产一区二区三区 黑人巨大精品欧美一区二区 哒哒哒免费视频观看在线www 哒哒哒免费视频观看在线www 久久99九九精品久久久久齐齐 顶级丰满少妇a级毛片 印度性BBBBBXXXXX 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 老妇肥熟凸凹丰满刺激 女人与公拘交的A片视频网站 性激烈的欧美三级视频 18禁无翼乌口工全彩大全 男同桌把我腿打开摸到高潮 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 中文字幕av无码不卡免费 国产精品视频yjizz 亚洲色大成网站WWW永久男同 h肉动漫无码无修6080动漫网 中文字幕av无码不卡免费 女人扒开屁股让男人桶30分钟 精品BBwBBwBBwBBw 天天干天天日 juliaann女医生在办公室 女闺蜜把我下面摸到高潮喷水 夜夜未满十八勿进的爽爽影院 看全色黄大色大片免费久久 欧美FREESEX黑人又粗又大 厨房掀起裙子从后面进去视频 公车好紧好爽再搔一点浪一点 艳妇乳肉豪妇荡乳后续潘金莲 人人添人人澡人人澡人人人人 孕妇奶水仑乱A级毛片免费看 久久久亚洲欧洲日产国码AⅤ 欧美成人免费观看在线看 久久国产乱子伦精品免费女 国产精品久久久久精品三级 国产真实夫妇交换视频 亚洲日产无码中文字幕 免费无码不卡视频在线观看 夜夜未满十八勿进的爽爽影院 厕所偷窥撒尿wcpeeingtube H动漫无遮挡成本人H视频 亚洲色播爱爱爱爱爱爱爱 免费国产A国产片高清网站 小说 亚洲 无码 男同桌把我腿打开摸到高潮 男人j进女人p免费视频 国产AV自拍 337p日本欧洲亚洲大胆色噜噜 chinese熟妇与小伙子mature 免费看国产成年无码av 两个人日本免费完整版高清 老少交玩tube少老配 3344成年在线视频免费播放 国产综合色产在线视频欧美 国产精品永久免费 老妇肥熟凸凹丰满刺激 日本黄色视频 国产粉嫩高中生第一次不戴套 野花高清在线观看视频www 在线 亚洲 国产 黑人巨大精品欧美一区二区 永久免费观看美女裸体的网站 男女肉粗暴进来120秒动态图 亚洲国产综合无码一区二区三区 国产精品无码2021在线观看 婷婷色婷婷开心五月四房播播 国产jizzjizz麻豆全部免费 舌头伸进我下面很爽的动态图 中文字幕韩国三级理论 欧美精品亚洲精品日韩久久 亚洲欧洲自拍拍偷午夜色无码 丰满人妻被公侵犯日本电影 人妻中文字系列无码专区 337p日本欧洲亚洲大胆色噜噜 女人扒开屁股让男人桶30分钟 亚洲熟妇少妇任你躁在线观看 国产精品一区二区在线观看 神马影院我不卡 亚洲va中文字幕无码久久一区 中文字幕韩国三级理论 性偷窥tube凸凹视频 久久精品无码专区免费东京热 h肉动漫无码无修6080动漫网 chinese 性 熟女bbw 欧美xxxx极品丰满 天天操天天干 国产激情久久久久影院老熟女 人妻少妇伦在线无码 男人狂躁进女人下面视频 人人添人人澡人人澡人人人人 末发育娇小性色xxxxx 欧美另类69xxxxx 两个奶头被吃高潮视频 亚洲国产初高中生女av 国产成人剧情AV麻豆映画 国产帅男男GAY网站视频 137裸交肉体摄影无需要下载 国产午夜福利在线观看红一片 人人人澡人人人妻人人人少妇 亚洲国产初高中生女av H动漫无遮挡成本人H视频 国产精品永久免费 欧美XXXX做受欧美 国产激情久久久久影院老熟女 久久人人做人人妻人人玩精品 东北女人毛多水多牲交视频 真实国产乱子伦清晰对白视频 欧美精品亚洲精品日韩久久 一女多男同时进6根同时进行 H肉动漫无码无修6080动漫网 亚洲色无码专区一区 人妻中文字系列无码专区 久久精品中文字幕一区 看全色黄大色大片免费久久 人禽杂交18禁网站免费 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 玩弄少妇高潮A片 人禽杂交18禁网站免费 欧美老少配孩交 捆绑白丝jk震动捧娇喘 精品BBwBBwBBwBBw 国产真实夫妇交换视频 久久国产乱子伦精品免费女 在线亚洲高清揄拍自拍一品区 国产成人剧情AV麻豆映画 野花高清在线观看视频www 两个男人添我下面试看十分钟 丰满人妻被公侵犯日本电影 丰满人妻被公侵犯日本电影 久久人人做人人妻人人玩精品 同性男男黄G片免费网站 国产精品大屁股白浆一区二区 色先锋av影音先锋在线 欧美日韩国产免费一区二区三区 韩国三级伦在线观看久 h肉动漫无码无修6080动漫网 免费国产A国产片高清网站 免费国产A国产片高清网站 一本大道久久A久久综合 手机看片久久国产永久免费 无码av免费一区二区三区 juliaann女医生在办公室 亚洲日韩在线中文字幕综合 欧美人体XXXX在线观看 老太婆毛多bbwbbwbbwbbw播放 国产又色又爽又黄刺激的视频 国产三级在线观看播放 人人添人人澡人人澡人人人人 免费a级作爱片免费观看美国 亂倫近親相姦中文字幕 中文字幕av无码不卡免费 久久精品中文字幕一区 欧美大胆a级视频 丰满多毛的大隂户 无码av免费一区二区三区 JAPANESE成熟丰满熟妇 亚洲国产精品无码久久一线夕 被老头玩弄邻居人妻中文字幕 特级大黄a片免费播放 veronica吸茎女王avluv 曰韩亚洲AV人人夜夜澡人人爽 夜夜未满十八勿进的爽爽影院 狠狠狠的在啪线香蕉亚洲应用 国产精品永久免费 九色综合狠狠综合久久 国产午夜福利在线观看红一片 女人zozozo禽交高潮喷水 在线 亚洲 国产 又大又粗欧美黑人a片 h肉动漫无码无修6080动漫网 厕所偷窥撒尿wcpeeingtube 久久国产乱子伦精品免费女 久久精品国产亚洲AV麻豆 国产色爱av资源综合区 欧美极品少妇做受 亲嘴扒胸摸屁股激烈网站 亚洲欧洲自拍拍偷午夜色无码 国产在线精品一区二区三区不卡 337p人体粉嫩胞高清大图 国产精品永久免费 欧洲肉欲k8播放毛片 男女无遮挡羞羞视频免费网站 性偷窥tube凸凹视频 中国农村真实BBWBBWBBW 娇妻互换享受高潮 厕所偷窥撒尿wcpeeingtube 久久免费看黄A级毛片 国模国产精品嫩模大尺度视频 手机在线看永久av片免费 国产精品一区二区在线观看 日本肉体XXXX裸体137大胆 国精品午夜福利视频不卡麻豆 欧美人与动xxxxz0oz 欧美性受XXXX黑人XYX性爽 大胆欧美熟妇xxmature 国产成人剧情AV麻豆映画 又黄又爽的成人免费视频 男同桌把我腿打开摸到高潮 国产av无码专区亚洲av麻豆 夜夜未满十八勿进的爽爽影院 h肉动漫无码无修6080动漫网 手机在线看永久av片免费 美女扒开阳道口图片 看全色黄大色大片免费久久 少妇人妻在线无码天堂视频网 老太婆毛多bbwbbwbbwbbw播放 男同桌把我腿打开摸到高潮 男同桌把我腿打开摸到高潮 欧美日韩国产免费一区二区三区 精品BBwBBwBBwBBw 神马影院我不卡 阳茎伸入女人的阳道免费视频 人与动人物XXXX毛片 av无码久久久久不卡网站 国产精品va在线观看无码电影 欧美极品少妇做受 国产精品大屁股白浆一区二区 欧美成人经典三级在线观看 精品久久久久久中文字幕无码 同性男男黄G片免费网站 男同桌把我腿打开摸到高潮 性xxxxfreexxxxx欧美牲交 玩弄少妇高潮A片 伊伊人成亚洲综合人网香 欧美成人免费观看在线看 中文字幕一区二区人妻 色先锋av影音先锋在线 韩国三级伦在线观看久 国产精品边做奶水狂喷无码 影音先锋女人av鲁色资源网 久久人人做人人妻人人玩精品 大胆欧美熟妇xxmature 女邻居的大乳中文字幕 中文字幕精品无码亚洲字幕 大又大粗又爽又黄少妇毛片 永久免费观看美女裸体的网站 娇妻被生人粗大猛烈进出高潮 国产jizzjizz麻豆全部免费 孕妇奶水仑乱A级毛片免费看 男人边吃奶边添下面好爽视频 被男狂揉吃奶胸60分钟视频 天天夜碰日日摸日日澡 亚洲熟妇少妇任你躁在线观看 日本被黑人强伦姧人妻完整版 一女多男同时进6根同时进行 少妇乱子伦精品无码专区 中文字幕av无码不卡免费 国产激情久久久久影院老熟女 西西大胆国模人体艺 亚洲国产精品无码久久一线夕 在线播放免费人成毛片乱码 久久精品无码专区免费东京热 亚洲欧洲自拍拍偷午夜色无码 看全色黄大色大片免费久久 神马影院我不卡 性激烈的欧美三级视频 欧美xxxxzozo另类特级 黑人巨大精品欧美一区二区 舌头伸进我下面很爽的动态图 亚洲日产无码中文字幕 国产精品原创巨作av无遮挡 欧美另类69xxxxx 白丝极品老师娇喘呻吟视频 被老头玩弄邻居人妻中文字幕 无码av免费一区二区三区 亚洲va中文字幕无码久久一区 国内揄拍国内精品少妇 亚洲日韩在线中文字幕综合 男吃奶玩乳尖高潮60分钟视频 性欧美丰满熟妇XXXX性 欧美XXXX做受欧美 veronica吸茎女王avluv 亲嘴扒胸摸屁股激烈网站 最刺激的交换夫妇中文字幕 老妇肥熟凸凹丰满刺激 同性男男黄G片免费网站 日本被黑人强伦姧人妻完整版 juliaann女医生在办公室 色欲日日拍夜夜嗷嗷叫 veronica吸茎女王avluv 免费看国产成年无码av 137裸交肉体摄影无需要下载 zzijzzij亚洲日本少妇jizjiz 老湿机69福利区无码 亚洲欧洲自拍拍偷午夜色无码 欧美精品亚洲精品日韩久久 精品一久久香蕉国产线看观看 大尺度无遮挡激烈床震网站 欧美成人经典三级在线观看 永久免费观看美女裸体的网站 亂倫近親相姦中文字幕 国产三级精品三级男人的天堂 在厨房乱子伦在线观看 亚洲人成绝费网站色www吃脚 草莓视频在线 俄罗斯少妇性XXXX 免费国产黄网站在线观看视频 日本被黑人强伦姧人妻完整版 色先锋AV影音先锋在线 丰满多毛的大隂户 丰满熟妇乱又伦 精品无码中出一区二区 各种姿势玩小处雏女视频 精品无码中出一区二区 美女极品粉嫩美鮑20p图 综合久久给合久久狠狠狠97色 免费网站看v片在线18禁无码 天天操天天干 哒哒哒免费视频观看在线www 国产99视频精品免视看7 中国农村真实BBWBBWBBW 国产精品边做奶水狂喷无码 日本被黑人强伦姧人妻完整版 看全色黄大色大片免费久久 美女扒开阳道口图片 亚洲丁香五月激情综合 韩国三级伦在线观看久 女人扒开屁股让男人桶30分钟 顶级丰满少妇a级毛片 亚洲AV男人电影天堂热APP 18禁超污无遮挡无码免费网站 国产在线精品一区二区三区不卡 999ZYZ玖玖资源站永久 jzzijzzij日本成熟少妇 国产在线精品一区二区三区不卡 色先锋av影音先锋在线 免费看奶头视频的网站 JAPANESE成熟丰满熟妇 熟妇高潮喷沈阳45熟妇高潮喷 偷窥厕所AAAAAA片 久久国产乱子伦精品免费女 亚洲色偷拍区另类无码专区 一女多男同时进6根同时进行 中文字幕精品无码亚洲字幕 欧美xxxxzozo另类特级 jzzijzzij日本成熟少妇 人妻少妇伦在线无码 久久国产乱子伦精品免费女 男人狂躁进女人下面视频 厕所偷窥撒尿wcpeeingtube 欧美人体XXXX在线观看 性俄罗斯少妇交xx00 少妇爽滑多水高潮 亚洲日韩在线中文字幕综合 性激烈的欧美三级视频 久久人人做人人妻人人玩精品 久久人人做人人妻人人玩精品 亚洲丁香五月激情综合 孕妇奶水仑乱A级毛片免费看 国产三级在线观看播放 欧洲肉欲k8播放毛片 国产激情久久久久影院老熟女 国产精品永久免费 国产精品视频yjizz 欧美极品少妇做受 GOGO西西人体大尺寸大胆高清 国产精品永久免费 毛茸茸性xxxx毛茸茸毛茸茸 特级大黄a片免费播放 孕妇奶水仑乱A级毛片免费看 一女多男同时进6根同时进行 办公室娇喘的短裙老师在线 日本黄色视频 老湿机69福利区无码 国产激情久久久久影院老熟女 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 又大又粗欧美黑人a片 无码av免费一区二区三区 337p人体粉嫩胞高清大图 出差我被公高潮a片 人禽杂交18禁网站免费 亚洲国产综合无码一区二区三区 女人与公拘交酡过程 老太婆毛多bbwbbwbbwbbw播放 人妻中文字系列无码专区 女人与公拘交酡过程 国模大胆一区二区三区 欧美大胆A级视频 亚洲人成绝费网站色www吃脚 中文字幕av无码不卡免费 手机看片久久国产永久免费 国产精品合集久久久久 日本黄色视频 chinese猛男自慰gv白袜喷浆 韩国三级伦在线观看久 欧美人与动牲交片免费 精品久久久久香蕉网 亚洲av无码一区二区乱子伦 日本黄色视频 小说 亚洲 无码 中国农村真实BBWBBWBBW 亚洲成a∨人片在线观看无码 影音先锋女人av鲁色资源网 欧美性受xxxx黑人xyx性爽 捆绑白丝jk震动捧娇喘 公车好紧好爽再搔一点浪一点 亚洲日韩在线中文字幕综合 人妻夜夜爽天天爽欧美色院 韩国三级伦在线观看久 中文字幕韩国三级理论 色欲日日拍夜夜嗷嗷叫 久久亚洲天天做日日做 久久精品99久久香蕉国产 欧美大胆A级视频 国产精品va在线观看无码电影 日本XXXX色视频在线观看免费 亚洲丁香五月激情综合 哒哒哒免费视频观看在线www 男女无遮挡羞羞视频免费网站 人妻夜夜爽天天爽欧美色院 国产jizzjizz麻豆全部免费 日本黄色视频 在线播放免费人成毛片乱码 大胆欧美熟妇xxmature 狠狠狠的在啪线香蕉亚洲应用 久久精品无码专区免费东京热 国产在线精品一区二区三区不卡 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频 各种姿势玩小处雏女视频 欧美另类69xxxxx 农村极度乱人伦的小说1一3续 草莓视频在线 欧美人体XXXX在线观看 被十几个男人扒开腿猛戳 H肉动漫无码无修6080动漫网 中文字幕av无码一区电影dvd 同性男男黄G片免费网站 人妻夜夜爽天天爽欧美色院 手机在线看永久av片免费 神马影院我不卡 欧美日韩一区二区综合 强奷绝色年轻女教师 精品久久久久香蕉网 性俄罗斯少妇交xx00 国内揄拍国内精品少妇 又黄又爽的成人免费视频 中文字幕精品无码亚洲字幕 伊伊人成亚洲综合人网香 手机在线看永久av片免费 老太婆毛多bbwbbwbbwbbw播放 亚洲色大成网站WWW永久男同 人妻中文字系列无码专区 欧美大胆A级视频 jzzijzzij日本成熟少妇 爽看1069gey男男视频 av永久天堂一区二区三区 毛茸茸性xxxx毛茸茸毛茸茸 欧美人与动牲交片免费 3344成年在线视频免费播放 国产真实夫妇交换视频 veronica吸茎女王avluv 中国老妇BBB视频老少配 免费a级作爱片免费观看美国 18禁超污无遮挡无码免费网站 久久久久无码精品国产 国产av无码专区亚洲av麻豆 在厨房乱子伦在线观看 国产三级精品三级在专区 最刺激的交换夫妇中文字幕 国产草莓视频无码a在线观看 熟妇高潮喷沈阳45熟妇高潮喷 久久人人做人人妻人人玩精品 久久久亚洲欧洲日产国码AⅤ GOGO西西人体大尺寸大胆高清 色先锋av影音先锋在线 人人添人人澡人人澡人人人人 玩弄少妇高潮A片 人人添人人澡人人澡人人人人 国产av无码专区亚洲av麻豆 JAPANESE成熟丰满熟妇 国产又色又爽又黄刺激的视频 在线亚洲高清揄拍自拍一品区 999ZYZ玖玖资源站永久 美国毛片 久久人人做人人妻人人玩精品 欧美XXXX做受欧美 精品欧美高清vivoesosex 成在线人av免费无码高潮喷水 性俄罗斯少妇交xx00 久久人人做人人妻人人玩精品 久久亚洲欧美国产精品 狠狠狠的在啪线香蕉亚洲应用 看全色黄大色大片免费久久 国模国产精品嫩模大尺度视频 中文字幕av无码不卡免费 亚洲日韩在线中文字幕综合 精品久久久久久中文字幕无码 免费看国产成年无码av 日本黄色视频 色先锋av影音先锋在线 黑人巨大精品欧美一区二区 亚洲日韩在线中文字幕综合 丰满少妇被猛烈进入高清播放 国产三级精品三级在专区 亚洲国产精品无码久久一线夕 亚洲日韩在线中文字幕综合 中文字幕av无码不卡免费 精品一久久香蕉国产线看观看 国模国产精品嫩模大尺度视频 久久国产乱子伦精品免费女 毛茸茸性xxxx毛茸茸毛茸茸 两个男人添我下面试看十分钟 美女扒开阳道口图片 永久免费观看美女裸体的网站 色欲日日拍夜夜嗷嗷叫 国产三级在线观看播放 亚洲av无码一区二区乱子伦 人禽杂交18禁网站免费 欧美FREESEX黑人又粗又大 中文字幕韩国三级理论 亚洲AV男人电影天堂热APP 丰满熟妇乱又伦 伊伊人成亚洲综合人网香 欧美日韩国产免费一区二区三区 国产av无码专区亚洲av麻豆 天天天欲色欲色www免费 久久精品无码专区免费东京热 大胆欧美熟妇xxmature 欧美FREESEX黑人又粗又大 chinese猛男自慰gv白袜喷浆 久久亚洲欧美国产精品 老妇肥熟凸凹丰满刺激 久久国产乱子伦精品免费女 亚洲AV综合色区无码一区爱AV 中文字幕av无码不卡免费 337p日本欧洲亚洲大胆色噜噜 欧美人体XXXX在线观看 嫖农村40的妇女舒服正在播放 国产精品第一页 亚洲va中文字幕无码久久一区 免费国产黄网站在线观看视频 chinese熟妇与小伙子mature 公车好紧好爽再搔一点浪一点 久久精品中文字幕一区 久久人人做人人妻人人玩精品 国内揄拍国内精品少妇 手机在线看永久av片免费 亚洲国产成人精品无码区 久久免费看黄A级毛片 中文字幕av无码一区电影dvd 国精品午夜福利视频不卡麻豆 av永久天堂一区二区三区 国产无遮挡裸体免费视频 人妻夜夜爽天天爽欧美色院 337p日本欧洲亚洲大胆色噜噜 中文字幕亚洲欧美在线不卡 一本大道久久A久久综合 性俄罗斯少妇交xx00 少妇乱子伦精品无码专区 GOGO西西人体大尺寸大胆高清 捆绑白丝jk震动捧娇喘 国产精品边做奶水狂喷无码 免费a级作爱片免费观看美国 欧美日韩国产免费一区二区三区 丰满熟妇乱又伦 国产香蕉尹人在线视频你懂的 杨贵妃4级纵欲丰满裸体毛片 老妇肥熟凸凹丰满刺激 性偷窥tube凸凹视频 chinese 性 熟女bbw 毛茸茸性xxxx毛茸茸毛茸茸 捆绑白丝jk震动捧娇喘 中文字幕av无码不卡免费 女人与公拘交的A片视频网站 国产无遮挡裸体免费视频 被十几个男人扒开腿猛戳 黑人巨大精品欧美一区二区 欧美FREESEX黑人又粗又大 女闺蜜把我下面摸到高潮喷水 丰满多毛的大隂户 亚洲日韩在线中文字幕综合 亂倫近親相姦中文字幕 出差我被公高潮a片 国产精品va在线观看无码电影 久久99精品久久久久久清纯 亚洲熟妇无码一区二区三区 东北女人毛多水多牲交视频 亚洲欧洲自拍拍偷午夜色无码 又大又粗欧美黑人a片 137裸交肉体摄影无需要下载 天天天欲色欲色www免费 chinese猛男自慰gv白袜喷浆 女人扒开屁股让男人桶30分钟 办公室娇喘的短裙老师在线 国产成人剧情AV麻豆映画 公车好紧好爽再搔一点浪一点 国产三级精品三级在线专区1 毛茸茸性xxxx毛茸茸毛茸茸 在线亚洲高清揄拍自拍一品区 精品无码中出一区二区 色欲人妻综合网 veronica吸茎女王avluv 欧美日韩国产免费一区二区三区 亚洲日产无码中文字幕 久久精品国产亚洲av高清! 野花高清在线观看视频www 永久免费观看美女裸体的网站 免费A片在线观看 天天天欲色欲色www免费 久久99精品久久久久久清纯 337p人体粉嫩胞高清大图 孕妇奶水仑乱A级毛片免费看 同性男男黄G片免费网站 欧美人体XXXX在线观看 久久99精品久久久久久清纯 欧美另类69xxxxx H动漫无遮挡成本人H视频 中国老妇BBB视频老少配 chinese熟女熟妇1乱老女人 免费a级作爱片免费观看美国 女子自慰喷潮A片免费观看 欧美另类69xxxxx 夜夜未满十八勿进的爽爽影院 中文字幕亚洲欧美在线不卡 亚洲制服丝袜av一区二区三区 韩国三级伦在线观看久 少妇爽滑多水高潮 国产在线精品一区二区三区不卡 veronica吸茎女王avluv 末发育娇小性色xxxxx chinese熟妇与小伙子mature 久久久久无码精品国产 亚洲AV男人电影天堂热APP 日本XXXX色视频在线观看免费 老太婆毛多bbwbbwbbwbbw播放 夜夜未满十八勿进的爽爽影院 国产成人免费无庶挡视频 亚洲国产综合无码一区二区三区 性xxxxfreexxxxx欧美牲交 粗大挺进朋友的未婚妻 国产粉嫩高中生第一次不戴套 九色综合狠狠综合久久 看全色黄大色大片免费久久 日本肉体XXXX裸体137大胆 欧美成人免费观看在线看 一女多男同时进6根同时进行 亚洲国产综合无码一区二区三区 chinese猛男自慰gv白袜喷浆 国产色爱av资源综合区 欧美另类69xxxxx 大尺度无遮挡激烈床震网站 精品欧美高清vivoesosex 国产精品va在线观看无码电影 国产精品边做奶水狂喷无码 久久亚洲欧美国产精品 国产粉嫩高中生第一次不戴套 毛茸茸性xxxx毛茸茸毛茸茸 婷婷色婷婷开心五月四房播播 永久免费观看美女裸体的网站 中文字幕亚洲欧美在线不卡 久久亚洲天天做日日做 女邻居的大乳中文字幕 人人人澡人人人妻人人人少妇 国产成人剧情AV麻豆映画 九色综合狠狠综合久久 免费国产A国产片高清网站 国模大胆一区二区三区 chinese熟女熟妇1乱老女人 亚洲日韩在线中文字幕综合 欧美另类69xxxxx 黑人巨大精品欧美一区二区 亚洲日韩在线中文字幕综合 精品久久久久久中文字幕无码 白丝极品老师娇喘呻吟视频 国产真实夫妇交换视频 国产无遮挡裸体免费视频 影音先锋女人av鲁色资源网 国内揄拍国内精品少妇 男人j进女人p免费视频 chinese猛男自慰gv白袜喷浆 狠狠狠的在啪线香蕉亚洲应用 捆绑白丝jk震动捧娇喘 人妻夜夜爽天天爽欧美色院 国产精品合集久久久久 厕所偷窥撒尿wcpeeingtube 少妇乱子伦精品无码专区 国产精品无码2021在线观看 粗大挺进朋友的未婚妻 亂倫近親相姦中文字幕 欧美xxxxzozo另类特级 男人边吃奶边添下面好爽视频 影音先锋女人av鲁色资源网 中文字幕av无码一区电影dvd 国产精品久久久久精品三级 欧美人体XXXX在线观看 久久国产乱子伦精品免费女 久久人人做人人妻人人玩精品 国内真实愉拍系列在线视频 九色综合狠狠综合久久 舌头伸进我下面很爽的动态图 各种姿势玩小处雏女视频 两个人日本免费完整版高清 国产av无码专区亚洲av麻豆 av鲁丝一区鲁丝二区鲁丝三区 国产帅男男GAY网站视频 久久99精品久久久久久清纯 被男狂揉吃奶胸60分钟视频 嫖农村40的妇女舒服正在播放 国产精品原创巨作av无遮挡 亚洲AV综合色区无码一区爱AV 国产午夜福利在线观看红一片 办公室娇喘的短裙老师在线 影音先锋女人av鲁色资源网 欧美XXXX做受欧美 同性男男黄G片免费网站 国产精品va在线观看无码电影 九色综合狠狠综合久久 精品久久久久久中文字幕无码 又黄又爽的成人免费视频 国产av无码专区亚洲av麻豆 久久精品中文字幕一区 哒哒哒免费视频观看在线www 免费看美女被靠到爽的视频 国产精品第一页 chinese 性 熟女bbw 老妇肥熟凸凹丰满刺激 亚洲日韩在线中文字幕综合 中文字幕韩国三级理论 H动漫无遮挡成本人H视频 久久精品99久久香蕉国产 中文字幕一区二区人妻 女子自慰喷潮A片免费观看 毛茸茸性xxxx毛茸茸毛茸茸 国产精品久久久久精品三级 chinese 性 熟女bbw 国产精品大屁股白浆一区二区 日本肉体XXXX裸体137大胆 Chinese男高中生白袜Gay自慰 韩国日本三级在线观看 H肉动漫无码无修6080动漫网 国产粉嫩高中生第一次不戴套 熟妇高潮喷沈阳45熟妇高潮喷 亚洲日韩在线中文字幕综合 少妇爽滑多水高潮 永久免费观看美女裸体的网站 欧美成人经典三级在线观看 顶级丰满少妇a级毛片 欧美xxxx极品丰满 国产无遮挡裸体免费视频 曰韩亚洲AV人人夜夜澡人人爽 少妇爽滑多水高潮 中文字幕被公侵犯的漂亮人妻 人妻夜夜爽天天爽欧美色院 国模国产精品嫩模大尺度视频 丰满人妻被公侵犯日本电影 老太婆毛多bbwbbwbbwbbw播放 粗大挺进朋友的未婚妻 韩国精品无码一区二区三区 Chinese男高中生白袜Gay自慰 日韩精品无码视频免费专区 精品无码中出一区二区 男女肉粗暴进来120秒动态图 在厨房乱子伦在线观看 亚洲欧洲自拍拍偷午夜色无码 老妇肥熟凸凹丰满刺激 久久久亚洲欧洲日产国码AⅤ 中文字幕av无码一区电影dvd 欧美性受xxxx黑人xyx性爽 欧美极品少妇做受 免费网站看v片在线18禁无码 男人边吃奶边添下面好爽视频 美女极品粉嫩美鮑20p图 同性男男黄G片免费网站 久久精品国产亚洲av高清! 137裸交肉体摄影无需要下载 一女多男同时进6根同时进行 舌头伸进我下面很爽的动态图 久久亚洲欧美国产精品 中国老妇BBB视频老少配 中文字幕av无码不卡免费 欧美性受xxxx黑人xyx性爽 人与动人物XXXX毛片 中文字幕一区二区人妻 久久国产乱子伦精品免费女 久久亚洲欧美国产精品 孕妇奶水仑乱A级毛片免费看 免费看美女被靠到爽的视频 真实国产乱子伦清晰对白视频 亚洲AV综合色区无码一区爱AV zzijzzij亚洲日本少妇jizjiz 亚洲熟妇无码一区二区三区 厕所偷窥撒尿wcpeeingtube 韩国精品无码一区二区三区 18禁无翼乌口工全彩大全 国产粉嫩高中生第一次不戴套 久久亚洲欧美国产精品 西西大胆国模人体艺 国产激情久久久久影院老熟女 性激烈的欧美三级视频 jzzijzzij日本成熟少妇 欧美人与动牲交片免费 久久人人做人人妻人人玩精品 国产三级精品三级在专区 国产a∨国片精品青草社区 国产精品久久久久精品三级 亚洲国产精品无码久久一线夕 永久免费观看美女裸体的网站 韩国三级伦在线观看久 中文字幕亚洲欧美在线不卡 欧美大胆A级视频 男女肉粗暴进来120秒动态图 中国老妇BBB视频老少配 欧美日韩一区二区综合 精品无码中出一区二区 毛茸茸性xxxx毛茸茸毛茸茸 欧美大胆a级视频 久久国产乱子伦精品免费女 久久精品无码专区免费东京热 久久人人做人人妻人人玩精品 juliaann女医生在办公室 女邻居夹得好紧太爽了A片 久久精品99久久香蕉国产 人妻夜夜爽天天爽欧美色院 中文字幕精品无码亚洲字幕成a人 国产三级精品三级男人的天堂 中文字幕一区二区人妻 国产精品永久免费 中文字幕一区二区人妻 女人扒开屁股让男人桶30分钟 国产av无码亚洲avh 欧美性受xxxx黑人xyx性爽 免费无码不卡视频在线观看