晚期糖基化終產物受體RNA的調節劑和調節的制作方法

本發明涉及使用剪接轉換反義寡核苷酸(AON)調節編碼晚期糖基化終產物受體(RAGE)或其部分的前體mRNA的選擇性剪接以修飾RAGE同種型的表達和/或活性的方法，以及使用所述調節劑治療RAGE相關病癥的方法。
背景技術：
晚期糖基化終產物受體(RAGE)是屬于免疫球蛋白(Ig)超家族的一種多價I型跨膜糖蛋白。人RAGE(Ager)基因位于第6號染色體的主要組織相容性復合物III類區域內。它包含11個外顯子和10個內含子，以及調控其轉錄的5'側翼區。轉錄的RAGEmRNA為～1.4kb，具有短的3'UTR。50-55kDa糖基化RAGE蛋白在有限范圍的細胞(例如血管內皮細胞、I型肺細胞、白細胞)中組成型表達，但是損傷、應激、缺氧或炎癥后在大多數細胞類型和組織中可誘導RAGE表達，為促炎和促增殖信號傳導提供通道。因此，RAGE表達在炎性和代謝病癥中上調，這些病癥包括但不限于神經退行性疾病、癌癥、心血管疾病、糖尿病、自身免疫和缺血性損傷，其中RAGE也與這些疾病的發展和進展有牽連。RAGE與一系列腦部病癥有牽連，這些病癥包括阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease)；肌萎縮性側索硬化；亨廷頓病(Huntington'sdisease)；克-雅病(Creutzfeld-Jakob'sdisease)；神經退行性病狀，諸如糖尿病性神經病、家族性淀粉樣多神經病、夏科氏神經性關節病(Charcotneuroarthropathy)和血管炎性神經??；神經性疼痛；膠質瘤發展和進展；缺血性腦損傷/中風，和多發性硬化。RAGE與腫瘤生物學的許多方面有牽連，這些方面包括腫瘤細胞的生長、遷移和侵襲。許多癌癥表達較高水平的RAGE(示例性實例有乳腺癌、結腸癌、腎癌和胃癌)。肺癌是例外，在肺癌中，由于隨著肺細胞分化和惡性變高發生RAGE損失，RAGE表達降低。在C6神經膠質瘤細胞中，腫瘤體積在包含RAGE被阻斷的細胞的腫瘤中顯著減小。相反，過表達野生型RAGE的腫瘤快速生長并非常有效地侵襲周圍組織。期望具有阻斷RAGE信號傳導的治療劑作為許多常見癌癥的癌癥治療，這些常見癌癥諸如：神經膠質瘤/多形性成神經管細胞瘤；胰腺癌；黑素瘤；前列腺癌；乳腺癌；肝癌/肝細胞瘤；和結腸癌。在健康狀況下，肺部的RAGE表達是所有組織中最高的。然而，肺部中的RAGE表達通常僅見于I型肺細胞。肺部中其他細胞和其他位點處RAGE信號傳導的上調與一系列肺病(lungdisorder)存有牽連，這些肺病包括：慢性阻塞性肺病(COPD)/肺氣腫；哮喘；吸煙/污染引起的損傷；急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征；和肺纖維化。RAGE也關鍵性地參與了多種炎性病狀，諸如炎性關節炎；骨關節炎；視網膜疾??；動脈粥樣硬化；血管鈣化；缺血性心臟病/心臟重塑/纖維化；心力衰竭；糖尿病性和非糖尿病性腎??；炎癥性腸??；先兆子癇；多囊卵巢綜合征；肝脂肪變性、纖維化、缺血性和非缺血性肝損傷；肌營養不良；脊髓損傷；皮膚炎癥和衰老；和角膜炎。人RAGE由免疫球蛋白樣胞外域、單個跨膜結構域和短(42個氨基酸)胞質尾組成。RAGE的胞外域(也稱為細胞外結構域)包括三個免疫球蛋白樣區域：N端V型結構域，其后是兩個C型結構域(稱為C和C'或替代性地稱為C1和C2)。晚期糖基化終產物(AGE)和非AGE配體與RAGE的胞外域的結合會激活與炎癥、損傷及細胞增殖和分化有牽連的細胞內信號轉導級聯。RAGE激活還觸發正反饋回路，其中RAGE配體-受體相互作用經由NFκB激活而增加RAGE的表達，從而增強后續RAGE誘導的細胞激活。事實上，發明人知道的強烈下調RAGE表達的唯一手段是減少RAGE的激活。這種情形與其他受體不同，其中增加配體水平會降低受體的表達。在人類中，RAGE的胞質尾長度為43個氨基酸(殘基362至殘基404)。該胞質尾含有對RAGE依賴性細胞激活而非配體結合至關重要的基序。RAGE的胞質尾可以在共同定位的G蛋白偶聯受體被其同源配體激活后被反式激活，而非AGE配體的AGE不與RAGE胞外域結合(也稱為RAGE的配體非依賴性激活)，從而導致相同途徑的激活(Pickering等人，JClinInvest[臨床研究雜志]2019；129:406-421)。某些共同定位的激活G蛋白偶聯受體對RAGE胞質尾的RAGE配體非依賴性激活似乎是體內激活RAGE的重要途徑。在RAGE的配體依賴性激活和RAGE的配體非依賴性激活中，細胞內信號傳導由RAGE的胞質結構域介導，該胞質結構域與一系列信號傳導配偶體相互作用。通過生成具有改變的通過配體依賴性和配體非依賴性信號傳導途徑激活的能力的RAGE同種型，對RAGE的選擇性剪接對于調控RAGE活性也很重要。在包括惡性腫瘤、糖尿病和阿爾茨海默病在內的疾病狀態中RAGE的選擇性剪接發生改變。但是雖然選擇性剪接似乎對于RAGE調控/失調很重要，但沒有辦法特異性地靶向這種機制。正是在這一背景下，描述了使用剪接轉換AON來調節RAGE剪接以相對于全長RAGE優先生成細胞保護性RAGE同種型的本發明方法。以上對
背景技術：
的討論只是為了方便理解本發明。該討論并不意味著確認或承認所提及的任何材料在本申請的優先權日或之前是公知常識的一部分。技術實現要素：廣泛地說，根據本發明的一種形式，提供了經分離或純化的AON，其用于調節編碼晚期糖基化終產物受體(RAGE)或其部分的前體mRNA基因轉錄物的選擇性剪接。在本發明的一個方面，提供了10-50個核苷酸的AON，其包含與在RAGE前體mRNA內含子附近或內部的區域互補的靶向序列。在本發明的一個方面，提供了10-50個核苷酸的AON，其包含與RAGE前體mRNA的剪接位點互補或相鄰的靶向序列。因為諸如RNA二級結構、AON與SR蛋白之間的競爭、核內不均一核糖核蛋白(hnRNP)和/或構成剪接體的其他元件等因素可影響AON的作用，所以針對關鍵受體或供體剪接位點的AON將不總是會改變剪接。因此，在本發明的一個方面，提供了10至50個核苷酸的AON，其包含與RAGE前體mRNA中充當增強子或沉默子的順式作用RNA元件互補或相鄰的靶向序列，當被剪接體元件(例如蛋白剪接因子、uRNA、lncRNA)結合時，該靶向序列調節附近外顯子的剪接。在本發明的一個方面，提供了10至50個核苷酸的AON，其包含與RAGE前體mRNA互補的靶向序列的，該靶向序列調節所述mRNA的二級結構以影響剪接位點選擇。在本發明的一種形式中，提供了用于誘導RAGE基因轉錄物或其部分中的一個或多個外顯子序列的排除(也稱為跳躍)的經分離或純化的AON。在本發明的一種形式中，提供了用于誘導RAGE基因轉錄物或其部分中內含子序列的保留的經分離或純化的AON。在本發明的一種形式中，AON經化學修飾以防止前體mRNA-AON復合物的降解，包括但不限于磷酰二胺嗎啉代寡聚物(PMO)、2′O-甲基硫代磷酸寡核苷酸(2OMe)和2′-O-甲氧基乙基硫代磷酸寡核苷酸(2OMe)、鎖核酸(LNA)修飾的AON、熱穩定扭曲插入核酸(TINA)和肽核酸(PNA)。在本發明的一種形式中，AON與多個部分綴合以增加它們的遞送，包括但不限于細胞穿透肽(CPP)、體內嗎啉代寡聚物(vivo-morpholino，VMO)或肽磷酰二胺嗎啉代寡聚物(PPMO)。優選地，AON選自包括表3a-3d中任一個所示的序列的組。優選地，AON選自包括以下項的列表：SEQIDNO:1-31。更優選地，AON是SEQIDNO:11、18、19或20。本發明的AON可以被選擇為能夠與選定的靶位點結合的AON，其中該靶位點是推定的mRNA剪接位點，其選自剪接供體位點、剪接受體位點、剪接增強子序列、剪接沉默子序列或調節前體mRNA二級結構的位點。當靶向供體或受體剪接位點時，靶位點也可包括一些側翼內含子序列。更具體地，AON可以選自包括SEQIDNO:1-31中的任何一個或多個和/或表3a-3d中的任何一個所示的序列，及其組合或混合物的組。更優選地，AON是SEQIDNO:11、18、19或20。AON的組合優選地是SEQIDNO:11和10的組合或SEQIDNO:11和13的組合。這包括可以在嚴格雜交條件下與此類序列雜交的序列，與其互補的序列，含有經修飾的堿基的序列，經修飾的骨架，以及在RAGE基因轉錄物中具有或調節前體mRNA加工活性的其功能性截短物或延伸物。在某些實施例中，AON可以與靶序列100％互補，或者可以包括錯配，例如以適應變體，只要在寡核苷酸與靶序列之間形成的異源雙鏈體足夠穩定以承受細胞核酸酶的作用和可能在體內發生的其他降解模式。因此，某些寡核苷酸可以在寡核苷酸與靶序列之間具有約或至少約70％的序列互補性，例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列互補性。本發明還擴展到能夠與選定靶標結合以調節RAGE前體mRNA的選擇性剪接的兩種或更多種AON的組合，包括包含兩種或更多種此類AON的構建體。這些構建體可一起用于基于AON的聯合療法。AON的組合優選地是SEQIDNO:11和10的組合或SEQIDNO:11和13的組合。根據本發明的另一方面，本發明擴展到本發明的AON序列的cDNA或克隆拷貝，以及含有本發明的AON序列的載體。本發明還進一步擴展到含有此類序列和/或載體的細胞。還提供了一種用于操縱RAGE基因轉錄物的剪接的方法，該方法包括以下步驟：a)提供一種或多種如本文所述的AON，并且使所述一種或多種寡聚物與靶核酸位點結合。還提供了一種用于治療、預防或緩解患者中與RAGE表達有關的疾病的影響的預防性或治療性藥物組合物，該組合物包含：a)一種或多種如本文所述的AON；以及b)一種或多種藥學上可接受的載劑和/或稀釋劑。該組合物可以包含約1nM至1000nM的本發明的每種所需AON。優選地，該組合物可以包含約10nM至500nM，最優選1nM至10nM的本發明的每種AON。還提供了一種用于治療、預防或緩解與RAGE表達相關的疾病的影響的方法，該方法包括以下步驟：a)向該患者施用有效量的一種或多種如本文所述的AON或包含一種或多種AON的藥物組合物。還提供了如本文所述的經純化和分離的AON用于制造用于治療、預防或緩解與RAGE表達和/或活性相關的疾病的影響的藥物的用途。還提供了一種用于治療、預防或緩解患者中與RAGE表達相關的疾病的影響的藥盒，該藥盒至少包含包裝在合適容器中的如本文所述的AON及其組合或混合物，以及其使用說明書。優選地，患者中與RAGE表達相關的疾病是神經退行性疾病、癌癥、肺病或炎性疾病?；加信cRAGE表達相關的疾病的受試者可以是哺乳動物，包括人?，F將參照所附非限制性實例和附圖描述本發明的其他方面。附圖說明在下面對本發明的幾個非限制性實施例的描述中更充分地描述了本發明的其他特征。將該描述包括在內僅用于舉例說明本發明的目的。不應將其理解為對上述本發明的廣泛概括、披露內容或描述的限制。該描述將參考附圖進行，其中：圖1a示出了生成RAGE和RAGE_v1的RAGE的選擇性剪接。外顯子以方框示出。編碼序列為黑色而非編碼序列為白色。成角度的線條指示剪接事件。S＝提前終止密碼子。圖1b示出了在A579細胞中，通過實時RT-PCR檢測，在用靶向外顯子10的選定AON處理后或在對照(亂序RNA處理的)細胞中，任何RAGEmRNA(總人RAGE)剪接形式(splicoform)和含有人RAGE9b序列的RAGEmRNA剪接形式的表達的倍數變化。圖1c示出了在用靶向外顯子10的選定AON處理A579細胞后或在對照(亂序RNA處理的)細胞中通過實時RT-PCR檢測，任何RAGEmRNA(總人RAGE)剪接形式和含有外顯子10的人RAGEmRNA剪接形式的mRNA表達的倍數變化。圖1d示出了在用靶向與推定的hnRNPF結合位點相鄰的外顯子10的選定AON處理A579細胞后或在對照(亂序RNA處理的)細胞中通過實時RT-PCR檢測，任何RAGE(總人RAGE)剪接形式和含有外顯子10的人RAGEmRNA剪接形式的mRNA表達的倍數變化。圖1e示出了編碼含有不同大小的外顯子8-11片段的構建體的RAGE克隆物的百分比，指示用靶向外顯子10的特異性AON處理A579細胞后或對照(亂序RNA處理的)細胞中不同RAGEmRNA剪接形式的相對表達。例如，300條帶指示含有外顯子8、9、10和11的剪接形式(即能夠信號傳導的剪接形式)，而250條帶指示含有RAGE9b的剪接形式，沒有條帶指示與外顯子8缺失相關的RAGEmRNA剪接形式。圖1f是跨越外顯子8-11的DNAPCR產物的代表性凝膠圖像，有不同大小的條帶或沒有條帶(箭頭)指示不同剪接形式的存在。圖1g示出了與對照(亂序RNA處理的)細胞相比，用AON3779處理A579細胞后，通過數字PCR測量的含有外顯子10的RAGEmRNA的拷貝數。圖1h示出了與對照(亂序RNA處理的)細胞相比，用靶向外顯子10的選定AON處理A579細胞后在細胞培養基中檢測到的內源可溶性RAGE蛋白的濃度。圖1i示出了在有和沒有AON3779或AON87或對照(CTL)RNA的情況下，用編碼人RAGE基因組序列(gRAGE)的DNA轉染CHO細胞后，通過使用RAGE特異性抗體檢測的蛋白印跡測定的，細胞培養基(左)和細胞裂解物(右)中RAGE蛋白的表達。泳道M是標志物，泳道2是載體對照(不表達內源性RAGE)，泳道3是gRAGE+對照(亂序)RNA，泳道3是gRAGE+AON3779，且泳道4是gRAGE+AON87。箭頭指示細胞培養基中較小的可溶性RAGE(紅色)和細胞裂解物中較大的全長RAGE(白色)的大小。圖1j示出了在用編碼人RAGE基因組序列(gRAGE)的DNA轉染CHO細胞后，在用和不用靶向外顯子10的AON轉染的情況下，通過ELISA測量的培養基中可溶性RAGE蛋白的表達。圖1k示出了在有或沒有靶向與也被AON3779靶向的位點相鄰或重疊的外顯子10的選定AON的情況下，在用編碼人RAGE基因組序列(gRAGE)的DNA轉染CHO細胞后，通過ELISA測量的培養基中可溶性RAGE蛋白的表達。圖1l示出了在有或沒有AON3779的情況下，在用編碼人RAGE基因組序列的DNA轉染CHO細胞后，通過ELISA測量的培養基中可溶性RAGE表達的劑量依賴性誘導。虛線表示用亂序RNA(10nM)轉染的CHO細胞中可溶性RAGE的表達。圖1m示出了與對照(亂序RNA處理的)細胞相比在用RAGE配體S100A8/9(0.6μg/ml)處理A549細胞后ICAM-1基因表達的誘導及其通過用靶向外顯子10的選定AON預轉染的調節。圖1n示出了與對照(亂序RNA處理的)細胞相比在用RAGE配體S100A8/9(0.6μg/ml)處理原代人主動脈內皮細胞(HAEC)后ICAM-1基因表達的誘導及其通過用靶向外顯子10的選定AON預轉染的調節。圖1o示出了用能夠誘導RAGE的反式激活的AngII處理A549細胞后ICAM-1基因表達的誘導。值得注意的是，與對照(亂序RNA處理的)細胞相比，ICAM-1基因表達的這種誘導也通過用靶向外顯子10的選定AON預轉染A579細胞來調節。圖1p示出了與對照(亂序RNA處理的)細胞相比在用血管緊張素II(1μM)處理原代人主動脈內皮細胞(HAEC)后ICAM-1基因表達的誘導及其通過用靶向外顯子10的選定AON預轉染的調節。圖1q示出了在用特異性靶向與推定hnRNP-F/H1結合位點相鄰的外顯子10的AON處理HMEC細胞后或在對照(亂序RNA處理的)細胞中通過實時RT-PCR檢測，任何RAGEmRNA(總人RAGE)剪接形式和含有外顯子10的人RAGEmRNA剪接形式的表達的倍數變化。圖1r示出了用靶向與推定的hnRNPF結合位點相鄰的外顯子10的AON處理HMEC后或在對照(亂序RNA處理的)細胞中，含有人RAGE9b序列的RAGEmRNA剪接形式的mRNA表達的倍數變化。圖1s示出了與非靶嗎啉代AON對照相比，用AON3779的體內嗎啉代寡聚物制劑(0.1-1μM)處理原代人主動脈內皮細胞(HAEC)對含有外顯子9b的RAGEmRNA剪接形式的表達的影響。圖1t示出了與非靶嗎啉代AON對照相比，用AON3779的體內嗎啉代寡聚物制劑(0.1-1μM)處理原代人主動脈內皮細胞(HAEC)對培養基中可溶性RAGE蛋白的表達的影響。圖1u示出了與非靶嗎啉代AON對照相比，用AON3779的體內嗎啉代寡聚物制劑(1μM)處理表達基因組人RAGE的CHO細胞對培養基中可溶性RAGE蛋白表達的影響。圖1v示出了包括并界定外顯子10的人RAGEDNA的序列，指示了上述實驗中采用的不同AON及其互補靶標。紫色方框指示hnRNPF結合的推定聚G靶標。圖1w示出了hnRNP的推定聚G靶標突變后所表達的人RAGE(突變體gRAGEM3)的選擇性剪接對觀察到的響應于AON3779轉染的可溶性RAGE增加的影響的缺乏。圖2a示出了包括并界定外顯子9的人AGER的基因序列，指示下面利用的不同AON和它們在RAGE前體mRNA上的互補靶標。圖2b示出了在用靶向外顯子9的選定AON處理A579細胞后或在對照(亂序RNA處理的)細胞中通過實時RT-PCR檢測，任何RAGEmRNA(總人RAGE)剪接形式和含有外顯子10的人RAGEmRNA剪接形式的表達。圖2c是跨越外顯子8-11的DNAPCR產物的代表性凝膠圖像，有不同大小的條帶或沒有條帶指示不同剪接形式的存在。圖2d表示編碼含有不同大小的外顯子8-11片段的構建體的RAGEmRNA克隆物的百分比，指示用靶向外顯子10的選定AON或亂序RNA對照(CTL)處理A579細胞后不同剪接形式mRNA的相對表達。例如，300條帶指示含有外顯子8、9、10和11的RAGEmRNA剪接形式(即能夠信號傳導的剪接形式)，而250條帶指示含有RAGE9b的剪接形式，沒有條帶指示與外顯子8缺失相關的RAGEmRNA剪接形式。圖2e示出了在有和沒有靶向外顯子9的選定AON的情況下，在用編碼人RAGE基因組序列的DNA轉染CHO細胞后和在對照(亂序RNA處理的)細胞中通過ELISA測量的培養基中可溶性RAGE蛋白的表達。ND＝未檢測到圖2f示出了與對照(亂序RNA處理的)細胞相比在用RAGE配體S100A8/9(0.6μg/mL)處理后TLR-4基因表達的誘導及其在用靶向外顯子9的選定AON轉染后的調節。圖2g示出了用能夠誘導RAGE的反式激活的AngII(1μM)處理后ICAM-1基因表達的誘導。值得注意的是，與對照(亂序RNA處理的)細胞相比，ICAM-1基因表達的這種誘導在用靶向外顯子9的選定AON轉染A579細胞后受到調節。圖2h示出了在用靶向外顯子9的選定AON處理HMEC1細胞后或在對照(亂序RNA)處理的細胞中通過實時RT-PCR檢測，任何RAGEmRNA(總人RAGE)剪接形式和含有外顯子10的人RAGEmRNA剪接形式的表達的倍數變化。圖3a示出了在用靶向外顯子9的選定AON即AON3779(作為陽性對照)處理A579細胞后或在對照(亂序RNA處理的)細胞中通過實時RT-PCR檢測，任何RAGEmRNA(總RAGE)剪接形式和含有外顯子10的人RAGEmRNA剪接形式的表達的倍數變化。圖3b示出了在用靶向外顯子9的選定AON即AON3779(作為陽性對照)處理A549細胞后或在對照(亂序RNA處理的)細胞中通過實時RT-PCR檢測，含有外顯子9b序列的RAGEmRNA剪接形式的表達的倍數變化。圖3c示出了在用靶向外顯子9的選定AON即AON3779(作為陽性對照)處理HMEC1細胞后或在對照(亂序RNA處理的)細胞中通過實時RT-PCR檢測，任何RAGEmRNA(總人RAGE)剪接形式和含有外顯子10的人RAGEmRNA剪接形式的表達。圖3d示出了在用靶向外顯子9的選定AON即AON3779(作為陽性對照)處理HMEC1細胞后或在對照(亂序RNA處理的)細胞中通過實時RT-PCR檢測，含有外顯子9b的RAGEmRNA剪接形式的表達的倍數變化。圖3e示出了在用靶向內含子9的特異性AON即AON3779(作為陽性對照)處理表達基因組人RAGE的A579細胞后，或在對照(亂序RNA處理的)細胞中，通過ELISA檢測的培養基中可溶性RAGE的濃度。圖3f示出了包括并界定內含子9的人RAGEDNA的序列，指示了AON及其互補靶標。圖4a示出了在用靶向RAGE前體mRNA的AON處理表達基因組鼠類RAGE的CHO細胞后，或在對照(亂序RNA處理的)細胞中，通過ELISA檢測的培養基中可溶性RAGE的濃度。圖4b示出了在用靶向鼠類RAGE的外顯子9的選定AON(50nM)處理PMAEC后或在對照(亂序RNA處理的)細胞中，實時RT-PCR上任何RAGEmRNA(總鼠類RAGE)剪接形式和含有外顯子10和11的RAGEmRNA剪接形式的表達的倍數變化。圖4c示出了在用靶向鼠類RAGE的外顯子9的選定AON(10nM)處理PMAEC后或在對照(亂序RNA處理的)細胞中任何mRNARAGE(總鼠類RAGE)和含有外顯子10和11的RAGEmRNA剪接形式的表達的倍數變化。圖4d示出了在用靶向鼠類RAGE的外顯子9的特異性AON(10nM)處理PMAEC細胞后或在對照(亂序RNA處理的)細胞中，培養基中可溶性RAGE蛋白的濃度。圖4e示出了在用AONm3779(10nM)處理PMAEC后或在對照(亂序RNA處理的)細胞中，實時RT-PCR上任何RAGEmRNA(總鼠類RAGE)剪接形式和含有外顯子10和11的RAGEmRNA剪接形式的表達的倍數變化。圖4f示出了在用AON3779(10nM)即AONm3779處理表達基因組鼠類RAGE的CHO細胞后，或在對照(亂序RNA處理的)細胞中，培養基中可溶性RAGE蛋白的濃度。圖4g示出了在用AON3779(10nM)即AONm3779處理表達基因組人RAGE的CHO細胞后，或在對照(亂序RNA處理的)細胞中，培養基中可溶性RAGE蛋白的濃度。圖4h示出了在用AONm3779或非靶嗎啉代AON處理小鼠精確切下的肺部切片48小時后，在實時RT-PCR上任何RAGEmRNA(總RAGE)剪接形式和含有外顯子10和11的RAGEmRNA剪接形式的表達。圖4i示出了在用AONm3779或媒介物(鹽水)處理小鼠精確切下的肺部切片后，在實時RT-PCR上任何RAGEmRNA(總RAGE)和含有外顯子9b的RAGEmRNA剪接形式的時間依賴性表達。圖4j示出了與非靶AON對照相比，在向C57Bl6小鼠每日皮下注射AONm3779一周后，在實時RT-PCR上任何RAGEmRNA(總小鼠RAGE)剪接形式和含有外顯子9b或外顯子10的鼠類RAGEmRNA剪接形式的肺部表達的倍數變化。圖4k示出了與非靶AON對照相比，在將AONm3779的嗎啉代制劑經氣管內滴注到C57Bl6小鼠中后48小時，在實時RT-PCR上任何RAGEmRNA(總小鼠RAGE)剪接形式和含有外顯子10和11的鼠類RAGEmRNA剪接形式的肺部表達的倍數變化。圖4l示出了與媒介物對照相比，在將AONm3779的2-0’Me制劑經氣管內滴注到C57Bl6小鼠中后48小時，在實時RT-PCR上任何RAGEmRNA(總小鼠RAGE)剪接形式和含有外顯子10和11的鼠類RAGEmRNA剪接形式的肺部表達的倍數變化。*指示相對于基線p＝0.01。圖4m示出了向C57Bl6小鼠氣管內注射AONm3779、AON4105和無菌水對照兩天后，與基線出血相比，循環可溶性RAGE的倍數變化(％)。圖5a示出了在有和沒有靶向不同區域外顯子10的選定AON的組合的情況下用編碼人RAGE基因組序列(gRAGE)的DNA轉染CHO細胞后，或在對照(亂序RNA處理的)細胞中，通過實時RT-PCR測量的含有外顯子9b的RAGEmRNA剪接形式的表達。圖5b示出了在有和沒有靶向外顯子10的5’剪接位點的選定AON的組合的情況下用編碼人RAGE基因組序列(gRAGE)的DNA轉染CHO細胞后，或在對照(亂序RNA處理的)中，通過ELISA測量的培養基中可溶性RAGE蛋白的表達。圖5c示出了在有和沒有靶向外顯子10的3’和5’剪接位點的選定AON的組合或對照RNA的情況下用編碼人RAGE基因組序列(gRAGE)的DNA轉染CHO細胞后，通過ELISA測量的培養基中可溶性RAGE蛋白的表達。方框指示包括AON3779的處理。圖5d示出了在有和沒有靶向外顯子10的相鄰區域的選定AON的組合的情況下用編碼人RAGE基因組序列的DNA轉染CHO細胞后，或在對照(亂序RNA)處理的細胞中，通過實時RT-PCR測量的含有外顯子9b的RAGEmRNA剪接形式的表達。圖5e示出了在有和沒有選定AON的組合或對照(亂序RNA)的情況下，用編碼小鼠RAGE的鼠類基因組序列的DNA轉染CHO細胞后，通過ELISA測量的培養基中可溶性RAGE蛋白的表達。具體實施方式發明詳述反義寡核苷酸(AON)是短的、合成的、反義的、經修飾的DNA或RNA鏈，這些鏈可以通過沃森-克里克堿基配對與前體RNA/mRNA選擇性地雜交并選擇性地調節靶RNA的功能。當AON用于調節mRNA的選擇性剪接時，常常將它們稱為剪接轉換寡核苷酸(SSO)。在本發明中，術語AON和SSO可以互換使用。SSO與前體mRNA堿基配對并通過阻斷剪接機制的組分與前體mRNA之間發生的RNA-RNA堿基配對或蛋白-RNA結合相互作用來破壞轉錄物的正常剪接庫。SSO可以誘導選定外顯子的“跳躍”和/或內含子序列的保留以調節翻譯產物。這可以通過以下方式來實現：直接靶向剪接位點，或靶向在通過調節特異性蛋白的結合或改變前體mRNA的二級結構來使剪接增強或沉默中所涉及到的順式作用序列。治療性SSO可用于治療遺傳病癥，以跳躍有缺陷或未對齊的部分，從而允許生成內部缺失的，但現在作為治療劑的功能性蛋白。選擇性剪接被認為是晚期糖基化終產物受體(RAGE)轉錄后基因調控的重要層。盡管大多數RAGE以其全長同種型表達，但通過選擇性剪接生成許多不同的編碼同種型(也稱為剪接形式)，包括具有N端截短、C端截短的剪接形式和保留內含子序列的剪接形式。這些不同的剪接形式可以通過競爭性配體結合或通過從結合配偶體置換全長蛋白而充當全長RAGE受體的可能調控劑。在不同組織諸如肺、肝、腎、平滑肌、內皮細胞和腦中已經鑒定了超過二十種剪接形式。不同的RAGE基因剪接變體已根據人類基因命名委員會(HumanGeneNomenclatureCommittee)命名為RAGE：RAGE_v1至RAGE_v19。例如，內含子9(外顯子9b)的(連續)保留導致跨膜結構域和胞質結構域的提前終止和完全損失，生成占人類循環RAGE的～5％的C截短的可溶性剪接形式(RAGE_v1，內源分泌型RAGE或esRAGE)。由于缺乏任何信號傳導元件或跨膜結構域，esRAGE能夠充當誘餌受體，從而與全長RAGE競爭配體或增加配體清除。較高的esRAGE循環水平與改善的健康結果和壽命相關，而較低的esRAGE與許多疾病狀態相關，包括但不限于動脈粥樣硬化、糖尿病、代謝綜合征、心血管病死亡、貧血、孤獨癥和各種致瘤狀態。用重組esRAGE治療糖尿病小鼠會減輕動脈粥樣硬化、血管炎癥、腎和視網膜損傷。RAGEΔ(也稱為DNRAGE或RAGEv20)缺乏細胞內結構域的16個氨基酸，但保留配體結合和跨膜結構域，因此充當細胞表面RAGE的顯性負抑制劑。通過RAGE的一些或全部Ig-V結構域的插入、缺失或去除，在細胞外結構域中產生變化的剪接事件也可影響配體結合結構域。例如，N-RAGE始于外顯子3中的交替起始位點，因此沒有配體結合所需的信號肽或V結構域。據報道，在糖尿病、一些癌癥和阿爾茨海默病中，RAGE的剪接出現異常(因此RAGE信號傳導功能失調)。esRAGE型剪接中外顯子10的跳躍歸因于高等真核生物中內含子長度的限制。大約45個核苷酸必須將5'剪接位點與分支點隔開，并且分支點與3'剪接位點之間的最小距離似乎分別為約18個核苷酸。因此，短于70個核苷酸的內含子在哺乳動物中極為罕見，并且不能有效地剪掉。當選擇內含子9中的esRAGE5’剪接位點時，此位點與鄰接外顯子10的3'剪接位點之間的距離為46個核苷酸，大大短于內含子長度的下限。因此，使用內含子9的下游esRAGE5’剪接位點和包含外顯子10將是互斥的。在所分析的已知剪接變體中，使用內含子9中的下游esRAGE5’剪接位點的所有變體跳躍外顯子10；相反，使用內含子9中的上游RAGE5’剪接位點的所有變體則包括外顯子10。因此，可獲得的證據表明內含子9中兩個替代性5'剪接位點中的任一個的選擇與外顯子10的包含或排除相結合。調控這種剪接的手段或外部調節手段以前一直是未知的。本發明使用SSO選擇性地操縱RAGE前體mRNA的選擇性剪接模式，導致生成非功能性的或充當誘餌受體以拮抗全長RAGE的配體依賴性激活和配體非依賴性反式激活的天然RAGEmRNA剪接形式。值得注意的是，在這些剪接位點處沒有共同的RAGE多態性。RAGE序列是高度保守的。因此，與用外顯子跳躍技術管理遺傳病癥不同，不需要個性化或個體化的序列修飾。本發明提供了通過開發調節RAGE前體mRNA或其部分的選擇性剪接的AON來治療、預防或改善其中RAGE與發展或進展有牽連的疾病的影響的替代性方法，這些疾病包括但不限于神經退行性疾病、癌癥、肺病或炎性疾病。廣泛地說，根據本發明的一個方面，提供了用于調節晚期糖基化終產物受體(RAGE)基因轉錄物或其部分中的前體mRNA剪接的經分離或純化的AON。優選地，提供了用于誘導RAGE前體mRNA或其部分中的外顯子排除和/或內含子保留的經分離或純化的AON。本發明提供了能夠與晚期糖基化終產物受體(RAGE)基因轉錄物上的選定靶標結合以調節RAGE基因轉錄物或其部分中的前體mRNA剪接的AON。例如，在本發明的一個方面，提供了10至50個核苷酸的AON，其包含與RAGE前體mRNA的區域或其部分互補的靶向序列，該區域或其部分與在調控mRNA的選擇性剪接中涉及到的蛋白的結合相關。表1：人RAGE基因序列表2：人RAGE基因的結構域外顯子結構域1N端信號肽2V型免疫球蛋白結構域3V型免疫球蛋白結構域4V型免疫球蛋白結構域5C型免疫球蛋白結構域1和26C型免疫球蛋白結構域1和27C型免疫球蛋白結構域1和28C型免疫球蛋白結構域1和29C型免疫球蛋白結構域1和210跨膜結構域11疏水性細胞內胞質結構域與其他基于AON的療法不同，本發明不通過RNA酶H的募集來誘導增加的RNA降解，其中RNA酶H優先結合并降解雙鏈體中與RAGE基因的DNA結合的RNA。它也不依賴于AON與RAGE基因組DNA的雜交或AON與mRNA的結合來調節通過干擾正常功能諸如復制、轉錄、易位和翻譯而產生的RAGE蛋白的量。相反，AON用于調節RAGE基因轉錄物或其部分中的前體mRNA剪接，并誘導外顯子“跳躍”或內含子序列的(連續)保留。該策略優選降低能夠介導RAGE依賴性信號傳導的RAGEmRNA剪接形式的表達和/或增加缺乏能夠介導RAGE依賴性信號傳導的功能結構域的RAGEmRNA剪接形式的生成。根據本發明的第一方面，提供了能夠與RAGE基因轉錄物上的選定靶標結合以調節RAGE基因轉錄物或其部分中的前體mRNA剪接的AON。廣泛地說，提供了用于在RAGE基因轉錄物或其部分中誘導靶向外顯子排除/內含子保留的經分離或純化的AON?！胺蛛x的”是指大體上或基本上不含在其天然狀態下通常伴隨它的組分的物質。例如，如本文所用，“分離的多核苷酸”或“分離的寡核苷酸”可以指已從天然存在狀態下位于其側翼的序列中純化或移除的多核苷酸，例如從基因組中與DNA片段相鄰的序列中移除的該DNA片段。當涉及細胞時，術語“分離”是指從來源受試者(例如，患有多核苷酸重復疾病的受試者)中純化細胞(例如，成纖維細胞、淋巴母細胞)。在DNA、mRNA或蛋白的上下文中，“分離”是指從來源(例如細胞)中回收DNA、mRNA或蛋白?？梢哉fAON是“針對”或“靶向”與之雜交的靶序列。在某些實施例中，靶序列包括包含預加工的mRNA的3'或5'剪接位點、分支點或剪接調控中涉及到的其他序列(包括剪接增強子和剪接沉默子以及決定影響剪接的RNA的二級結構的位點)的區域。靶序列可以處于外顯子內或處于內含子內或跨越內含子/外顯子連接處。在某些實施例中，AON與靶RNA(即，剪接位點選擇受調節的RNA)具有足夠的序列互補性，以有效的方式阻斷靶RNA(例如，前體mRNA)的區域。在示例性的實施例中，RAGE前體mRNA的此類阻斷用以通過掩蔽剪接體蛋白的結合位點(否則將調節剪接)和/或通過改變靶向RNA的結構來調節剪接。在一些實施例中，靶RNA是靶前體mRNA(例如，RAGE基因前體mRNA)。AON與靶RNA序列具有足夠的序列互補性以調節靶RNA剪接意指AON具有足以觸發否則將調節剪接的天然蛋白的結合位點的掩蔽的序列，和/或改變靶RNA的三維結構?？梢允惯x定的AON更短，例如約12個堿基，或更長，例如約50個堿基，并且包括少量的錯配，只要該序列足夠互補以在與靶序列雜交時實現剪接調節，并且任選地與RNA形成具有45℃或更高的Tm的異源雙鏈體。優選地，AON選自包括SEQIDNO:1-31和/或表3a-3d中任一個所示的序列的組。更優選地，AON是SEQIDNO:11、18、19或20。在某些實施例中，靶序列與AON之間的互補程度足以形成穩定的雙鏈體。AON與靶RNA序列的互補區域可以短至8-11個堿基，但可以是12-15個堿基或更多，例如10-50個堿基、10-40個堿基、12-30個堿基、12-25個堿基、15-25個堿基、12-20個堿基或15-20個堿基，包括這些范圍之間的所有整數。約16-17個堿基的AON通常足夠長以具有獨特的互補序列。在某些實施例中，如本文所討論的，可能需要最小長度的互補堿基來達到必需的結合Tm。在某些實施例中，長達50個堿基的寡核苷酸可能是合適的，其中至少最小數目的堿基，例如10-12個堿基與靶序列互補。然而，一般而言，在小于約30個堿基的寡核苷酸長度下細胞中受到促進的攝取或主動攝取得以優化。對于本文進一步描述的磷酰二胺嗎啉代寡聚物(PMO)AON，結合穩定性和攝取的最佳平衡通常發生在18-25個堿基的長度下。包括由約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個堿基組成的AON(例如，PMO、PMO-X、PNA、LNA、TINA、2’-OMe)。在某些實施例中，AON可以與靶序列100％互補，或者可以包括錯配，例如以適應變體，只要在寡核苷酸與靶序列之間形成的異源雙鏈體足夠穩定以承受細胞核酸酶的作用和可能在體內發生的其他降解模式。因此，某些寡核苷酸可以在寡核苷酸與靶序列之間具有約或至少約70％的序列互補性，例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列互補性。如果存在錯配，通常在雜交雙鏈的末端區域比中間不穩定性低。根據充分理解的雙鏈體穩定性原理，允許的錯配數目將取決于寡核苷酸的長度、雙鏈體中G:C堿基對的百分比、雙鏈體中的錯配位置。盡管此類AON不一定與靶序列100％互補，但它有效地與靶序列穩定且特異性地結合，以便調節靶前體RNA的剪接。AON與靶序列之間形成的雙鏈體的穩定性是結合Tm和雙鏈體對細胞酶促裂解的敏感性的函數。寡核苷酸相對于互補序列RNA的Tm可通過常規方法測量，諸如Hames等人，NucleicAcidHybridization[核酸雜交],IRL出版社,1985,第107-108頁描述的那些或如MiyadaC.G.和WallaceR.B.,1987,OligonucleotideHybridizationTechniques[寡核苷酸雜交技術],MethodsEnzymol.[酶學方法]第154卷第94-107頁所述的那些。在某些實施例中，相對于互補序列RNA，AON可具有高于體溫且優選高于約45℃或50℃的結合Tm。還包括在60-80℃或更高范圍內的Tm。變體另外的實例包括在SEQIDNO:1-31和/或表3a-3d中任一個所示序列的整個長度上具有約或至少約70％序列同一性或同源性，例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性或同源性的AON。更優選地，AON是SEQIDNO:11、18、19或20。更具體地，提供了能夠與選定靶位點結合以修飾RAGE基因轉錄物或其部分中的前體mRNA剪接的AON。AON優選地選自SEQIDNO:1-31和/或表3a-3d中任一個所示的序列。更優選地，AON是SEQIDNO:11、18、19或20。對前體mRNA剪接的修飾優選地誘導mRNA的一個或多個外顯子的“跳躍”或去除或內含子的保留。由于內部截短或提前終止，與親本全長RAGE蛋白相比時，所得蛋白優選具有較短的長度。這些截短的RAGE蛋白可稱為全長RAGE蛋白的剪接形式。生成的mRNA的剩余外顯子可以是框內的并且產生較短的蛋白，該較短的蛋白具有類似于親本全長蛋白的序列，只是它在原始3'與5'末端之間的區域中具有內部截短。在另一種可能性中，外顯子跳躍可以誘導產生下述蛋白的移碼，其中該蛋白的第一部分與親本全長蛋白基本上相同，但是其中該蛋白的第二部分由于移碼而具有不同的序列(例如無義序列)。替代性地，由于閱讀框的破壞和翻譯提前終止的存在，外顯子跳躍可誘導提前終止蛋白的產生。提前終止蛋白可以是mRNA提前終止(例如，外顯子10和/或11的跳躍)的結果，或者可以是內含子(例如RAGE9b)連續或錯義跳躍的結果，從而提供含有外顯子10和/或11mRNA的mRNA，但不提供由這些外顯子編碼的蛋白的表達。跳躍外顯子1至9中的單個外顯子將優選地破壞RAGE轉錄物的閱讀框。這將通過無義介導的衰變導致RNA的降解增加。跳躍外顯子1至11的單個外顯子將優選地保持閱讀框完好。這將優選地導致翻譯成內部截短的蛋白。截短的蛋白或RAGEmRNA剪接形式可具有完全消除的功能，可具有降低的功能或充當誘餌受體。優選地，這些截短的、無義的或提前終止的蛋白缺乏一個或多個功能結構域，這些功能結構域涉及RAGE配體對細胞內信號傳導途徑的誘導或并置的GPCR對RAGE的非配體依賴性反式激活。例如，外顯子10編碼跨膜結構域，并且去除該外顯子可以生成可溶性RAGE蛋白，該蛋白可以潛在地充當配體誘導的經由RAGE進行的信號傳導的可溶性誘餌或競爭性拮抗劑。截短的、無義的或提前終止的蛋白可進一步缺乏其他因子的附著或結合位點，去除這些位點可導致RAGE蛋白與相關信號傳導途徑的相互作用減少。替代性地，去除一個或多個外顯子可導致RAGE蛋白的錯誤折疊和蛋白成功轉運通過膜的能力降低。存在內部截短的蛋白(即，缺乏由一個或多個外顯子編碼的氨基酸的蛋白)是優選的。如果RAGE蛋白受到抑制，則當身體試圖補償RAGE蛋白總量的減少時，可能存在RAGE轉錄升高的問題。相反，內部截短的蛋白(優選缺乏完整RAGE蛋白的一個或多個特征)的存在應足以防止轉錄升高，但由于功能性RAGE蛋白總量的減少仍提供治療優勢。本發明的AON誘導的外顯子跳躍不需要完全或甚至基本上消除RAGE蛋白的功能。優選地，經由外顯子跳躍過程調節選擇性剪接導致RAGE蛋白的功能降低或受損。使用不同跳躍策略產生的RAGE的不同同種型可產生信號傳導活性消除或降低的蛋白，這些蛋白可優選地用于治療或預防與RAGE活性相關的不同疾病，諸如神經退行性疾病、癌癥、肺病或炎性疾病。選擇性剪接策略可形成截短的蛋白或功能降低的蛋白，這些蛋白可優選地用作與RAGE表達和活性相關的疾病的特定方面、形式或進展的治療。使用AON的本發明的跳躍過程可以排除(跳躍)單個外顯子，或者可以導致一次跳躍兩個或更多個外顯子。使用AON的本發明的跳躍過程可以包括保留內含子序列，有或沒有直接跳躍一個或多個外顯子。本發明的AON可以是能夠與選定靶標結合以誘導RAGE基因轉錄物中的外顯子排除的兩種或更多種AON的組合。該組合可以是兩種或更多種AON的混合物和/或包含連接在一起的兩種或更多種或者兩種或更多種AON的構建體。表3a：用于調節人RAGE外顯子9中的選擇性剪接的AON序列表3b.用于調節人RAGE外顯子10中的選擇性剪接的AON序列表3c.用于調節人RAGE內含子9中的選擇性剪接的AON序列表3d.用于調節鼠類RAGE的選擇性剪接的AON序列本發明進一步提供了一種用于調節RAGE基因轉錄物中的選擇性剪接的方法，該方法包括以下步驟：提供一種或多種如本文所述的AON，并且使所述一種或多種寡聚物與靶核酸位點結合。根據本發明的另一個方面，提供了一種用于調節RAGE前體mRNA的選擇性剪接的核酸序列靶標，該核酸序列靶標包含選自由SEQIDNO:1-31和/或表3a-3d中任一個所示的序列組成的組核酸序列的DNA等效物，以及與其互補的序列。更優選地，AON是SEQIDNO:11、18、19或20。AON可以是AON的組合，優選SEQIDNO:11和10的組合或SEQIDNO:11和13的組合。設計AON以完全掩蔽共有剪接位點可能不一定會在靶向外顯子的剪接方面產生變化。此外，發明人已經發現，當設計AON時，AON本身的大小或長度并不總是主要因素。對于一些靶標，短至20個堿基的AON能夠誘導一些外顯子包含，在某些情況下比針對相同外顯子的其他較長(例如25個堿基)的寡聚物更有效。發明人還已發現，似乎不存在可被AON阻斷或掩蔽以重新定向剪接的任何標準基序。已經發現，必須憑經驗對每個基因靶標設計AON并且評估它們各自的功效。更具體地，AON可選自表3a-3d中任一個所示的那些。序列優選地選自由SEQIDNO:1-31中的任何一個或多個及其組合或混合物組成的組。更優選地，AON是SEQIDNO:11、18、19或20。AON的組合優選地是SEQIDNO:11和10的組合或SEQIDNO:11和13的組合。這包括可以在嚴格雜交條件下與此類序列雜交的序列，與其互補的序列，含有經修飾的堿基的序列，經修飾的骨架，以及在RAGE基因轉錄物中具有或調節前體mRNA加工活性的其功能性截短物或延伸物。當每個分子中足夠數目的相應位置被可以彼此氫鍵結合的核苷酸占據時，寡聚物和DNA、cDNA或RNA彼此互補。因此，“可特異性雜交的”和“互補的”是用于表示足夠程度的互補或配對使得在寡聚物與DNA、cDNA或RNA靶標之間發生穩定且特異性的結合的術語。本領域中應理解，AON的序列不必與其可特異性雜交的靶序列100％互補。當化合物與靶DNA或RNA分子的結合干擾靶DNA或RNA產物的正常功能，并且在需要特異性結合的條件下，即在體內測定或治療性處理的情況下在生理條件下，以及在體外測定的情況下在進行這些測定的條件下，有足夠程度的互補性以避免AON與非靶序列的非特異性結合，則該AON是可特異性雜交的。選擇性雜交可以在低、中或高嚴格條件下進行，但優選在高嚴格條件下進行。本領域技術人員將認識到，除了堿基組成、互補鏈的長度和雜交核酸之間核苷酸堿基錯配的數目之外，雜交的嚴格性還將受到諸如鹽濃度、溫度或有機溶劑等條件的影響。嚴格的溫度條件通常將包括超過30℃，典型地超過37℃，以及優選地超過45℃，優選地至少50℃，并且典型地60℃-80℃或更高的溫度。嚴格的鹽條件一般將小于1000mM，典型地小于500mM，且優選地小于200mM。然而，參數的組合比任何單個參數的量度重要得多。嚴格的雜交條件的實例是65℃和0.1xSSC(1xSSC＝0.15MNaCl，0.015M檸檬酸鈉pH7.0)。因此，本發明的AON可包括與表3a-3d中任一個提供的序列或SEQIDNO:1-31選擇性雜交的寡聚物。更優選地，AON是SEQIDNO:11、18、19或20。應理解，結構蛋白中外顯子末端的密碼子排列可能并非總是在密碼子末端處斷裂，因此可能需要從前體mRNA中刪除一個以上外顯子以確保mRNA的框內閱讀。在此類情形下，可能需要通過本發明的方法選擇多種AON，其中每一種針對負責誘導所需外顯子和/或內含子的包含的不同區域。在給定的離子強度和pH下，Tm是50％的靶序列與互補多核苷酸雜交所處的溫度。此類雜交可以發生在AON與靶序列“接近”或“基本”互補以及精確互補的情況下。通常，當與AON的核苷酸在至少約14個核苷酸的鏈段上存在至少約55％同一性，優選至少約65％，更優選至少約75％且最優選至少約90％、95％、98％或99％同一性時，將發生選擇性雜交。如所述，同源性比較的長度可以是更長的鏈段，并且在某些實施例中常常將是至少約九個核苷酸，通常至少約12個核苷酸，更通常至少約20個，常常至少約21、22、23或24個核苷酸，至少約25、26、27或28個核苷酸，至少約29、30、31或32個核苷酸，至少約36個或更多個核苷酸的鏈段。因此，本發明的AON序列優選地與本文序列表中所示的序列具有至少75％，更優選至少85％，更優選至少86％、87％、88％、89％或90％的同源性。更優選存在至少91％、92％、93％、94％或95％，更優選至少96％、97％、98％或99％的同源性。通常，AON的長度越短，獲得選擇性雜交所需的同源性越高。因此，在本發明的AON由少于約30個核苷酸組成的情況下，優選的是，與本文序列表中列出的AON相比，百分比同一性大于75％，優選大于85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。核苷酸同源性比較可以通過序列比較程序進行，諸如GCGWisconsinBestfit程序或GAP(Deveraux等人，1984,NucleicAcidsResearch[核酸研究]12,387-395)。以這種方式，可以通過在比對中插入空位來比較與本文引用的序列長度相似或基本上不同的序列，此類空位例如通過GAP使用的比較算法來確定。本發明的AON可以具有與靶序列同源性降低的區域以及與靶序列有精確同源性的區域。寡聚物不必在其整個長度上具有精確同源性。例如，寡聚物可以具有與靶序列相同的至少4或5個堿基的連續鏈段，優選與靶序列相同的至少6或7個堿基的連續鏈段，更優選與靶序列相同的至少8或9個堿基的連續鏈段。寡聚物可以具有與靶序列相同的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26個堿基的鏈段。寡聚物序列的剩余鏈段可間斷性地與靶序列相同；例如，剩余序列可以具有相同的堿基，后面是不相同的堿基，后面是相同的堿基。替代性地(或同樣)，寡聚物序列可具有散布有不完全同源的鏈段的若干相同序列鏈段(例如3、4、5或6個堿基)。此類序列錯配將優選沒有或很少有剪接轉換活性損失。術語“調節(modulate)”或“調節(modulates)”包括“增加”或“減小(decrease)”一個或多個可量化的參數，任選地以限定的和/或統計上顯著的量。術語“增加(increase)”或“增加(increasing)”、“增強(enhance)”或“增強(enhancing)”或“刺激(stimulate)”或“刺激(stimulating)”通常是指一種或多種AON或組合物在細胞或受試者中產生或引起相對于沒有AON時或對照化合物引起的反應更大的生理反應(即，下游效應)的能力。術語“減小(decreasing)”或“減小(decrease)”通常是指一種或多種AON或組合物在細胞或受試者中產生或引起相對于沒有AON時或對照化合物引起的反應降低的生理反應(即，下游效應)的能力。相關的生理或細胞反應(體內或體外)對于本領域技術人員而言將是顯而易見的，并且可以包括在有需要的細胞、組織或受試者中增加編碼RAGE的前體mRNA中特定外顯子的排除，減少編碼RAGE的前體mRNA的量或減少功能性RAGE蛋白的表達?！霸黾拥摹被颉霸鰪姷摹绷客ǔＪ墙y計上顯著的量，并且可以包括是沒有AON(不存在試劑)時或對照化合物產生的量的1.1倍、1.2倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包括其間且在1以上的所有整數和小數點，例如1.5、1.6、1.7、1.8)的增加。術語“降低”或“抑制”通?？缮婕耙环N或多種AON或組合物“減少”相關生理或細胞反應(諸如本文所述的疾病或病狀的癥狀)的能力，如根據診斷領域中的常規技術所測量。相關的生理或細胞反應(體內或體外)對于本領域技術人員而言將是顯而易見的，并且可以包括疾病諸如癌癥、神經退行性疾病、肺病和其他炎性疾病的癥狀或病理的減輕。與沒有AON時或對照組合物產生的反應相比，反應的“減少”可以是統計上顯著的，并且可以包括1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的減少，包括其間的所有整數。AON的長度可以變化，只要它能夠與前體mRNA分子內的預期位置選擇性地結合。此類序列的長度可根據本文所述的選擇程序來確定。通常，AON的長度將為約10個核苷酸，長度最多約50個核苷酸。然而，應當理解，該范圍內的任何核苷酸長度都可用于該方法中。優選地，AON的長度為10至40、10至35、15至30個核苷酸長或20至30個核苷酸長，最優選約25至30個核苷酸長。例如，寡聚物的長度可以是20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。如本文所用，“AON”是指允許核堿基通過沃森-克里克堿基配對與RNA中的靶序列雜交以在靶序列內形成寡核苷酸:RNA異源雙鏈體的核苷酸或核苷酸類似物的線性序列。術語“AON”、“AON”、“寡聚物”和“反義化合物”可以互換用于指寡核苷酸。環狀亞基可基于核糖或另一種戊糖，或在某些實施例中，基于嗎啉基(參見以下對嗎啉代寡核苷酸的描述)。除了本領域已知的其他反義試劑外，還考慮到肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)和2'-O-甲基寡核苷酸。包括非天然存在的AON或“寡核苷酸類似物”，包括具有以下方面的AON或寡核苷酸：(i)經修飾的骨架結構(例如不同于天然存在的寡核苷酸和多核苷酸中發現的標準磷酸二酯連鍵的骨架)和/或(ii)經修飾的糖部分(例如嗎啉基部分而非核糖或脫氧核糖部分)。寡核苷酸類似物支持能夠通過沃森-克里克堿基配對與標準多核苷酸堿基氫鍵結合的堿基，其中類似物骨架以容許寡核苷酸類似物分子與標準多核苷酸(例如單鏈RNA或單鏈DNA)中的堿基之間以序列特異性方式進行這種氫鍵結合的方式呈現堿基。優選的類似物是具有基本上不帶電荷的含磷骨架的那些。產生AON的一種方法是2'羥基核糖位置的甲基化和硫代磷酸酯骨架的并入產生表面上類似于RNA但對核酸酶降解更具抗性的分子，但是本發明領域的技術人員將知道可用于本發明目的的其他形式的合適骨架。為了避免前體mRNA在與AON形成雙鏈體期間降解，該方法中使用的AON可適于最小化或防止內源RNA酶H的裂解。這種性質是高度優選的，因為用未甲基化的寡聚物(胞內或在含有RNA酶H的粗提物中)處理RNA導致前體mRNA:AON雙鏈體的降解。能夠繞過或不誘導此類降解的任何形式的經修飾的AON都可以用于本發明方法中?？赏ㄟ^修飾本發明的AON使其包含部分不飽和脂族烴鏈和一個或多個極性基團或帶電基團(包括羧酸基團、酯基團和醇基團)來獲得核酸酶抗性。當與RNA形成雙鏈體時不被細胞RNA酶H裂解的AON的實例是2'-O-甲基衍生物。此類2'-O-甲基-寡核糖核苷酸在細胞環境和動物組織中是穩定的，并且它們與RNA的雙鏈體具有比它們的核糖或脫氧核糖對應物更高的Tm值。替代性地，本發明的核酸酶抗性AON可以有最后3'-末端核苷酸中的至少一個被氟化。還替代性地，本發明的核酸酶抗性AON在最后3-末端核苷酸堿基中的至少兩個之間具有硫代磷酸酯鍵連接，優選在最后四個3'-末端核苷酸堿基之間具有硫代磷酸酯鍵連接。也可以用替代性的寡核苷酸化學方法實現增加的剪接轉換。例如，AON可以選自包括以下項的列表：氨基磷酸酯或磷酰二胺嗎啉代寡聚物(PMO)；PMO-X；PPMO；肽核酸(PNA)；鎖核酸(LNA)及其衍生物，包括α-L-LNA、2'-氨基LNA、4'-甲基LNA和4'-O-甲基LNA；乙烯橋接核酸(ENA)及其衍生物；硫代磷酸酯寡聚物；三環DNA寡聚物(tcDNA)；三環硫代磷酸酯寡聚物；2’O-甲基修飾的寡聚物(2'-OMe)；2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)；2'-氟代，2'-氟代阿拉伯糖(FANA)；非鎖核酸(UNA)；熱穩定扭曲插入核酸(TINA)、己糖醇核酸(HNA)；環己烯基核酸(CeNA)；2'-氨基(2'-NH2)；2'-O-亞乙基胺或作為mixmer或作為gapmer的前述的任何組合。為了進一步提高遞送功效，上面提到的經修飾的核苷酸常常與脂肪酸/脂質/膽固醇/氨基酸/碳水化合物/多糖/納米顆粒等一起綴合至糖或核堿基部分。這些綴合的核苷酸衍生物也可用于構建外顯子跳躍AON。反義寡核苷酸誘導的人RAGE基因轉錄物的剪接修飾通常使用硫代磷酸酯骨架上的寡核糖核苷酸、PNA、2OMe或MOE修飾的堿基。盡管2OMeAO用于寡核苷酸設計，但由于當作為陽離子脂質復合物遞送時它們在體外有效攝取，這些化合物對核酸酶降解敏感，并且被認為對于體內或臨床應用不是理想的。當使用替代性化學方法生成本發明的AON時，本文提供的序列的尿嘧啶(U)可被胸腺嘧啶(T)置換。在本發明的AON內包括非天然存在的寡聚物或“寡核苷酸類似物”，包括具有以下方面的寡聚物：(i)經修飾的骨架結構(例如不同于天然存在的寡核苷酸和多核苷酸中發現的標準磷酸二酯連鍵的骨架)和/或(ii)經修飾的糖部分(例如嗎啉基部分而非核糖或脫氧核糖部分)。寡聚物類似物支持能夠通過沃森-克里克堿基配對與標準多核苷酸堿基氫鍵結合的堿基，其中類似物骨架以容許寡聚物類似物分子與標準多核苷酸(例如單鏈RNA或單鏈DNA)中的堿基之間以序列特異性方式進行這種氫鍵結合的方式呈現堿基。優選的類似物是具有基本上不帶電荷的含磷骨架的那些。不激活RNA酶H的反義寡核苷酸可以根據已知技術制備(參見，例如，美國專利5,149,797)。此類AON，可以是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列，僅僅含有在空間上阻礙或防止RNA酶H與含有寡聚物作為其一個成員的雙鏈體分子結合的任何結構修飾，該結構修飾基本上不會阻礙或破壞雙鏈體形成。因為雙鏈體形成中所涉及的寡聚物部分基本上不同于RNA酶H與其結合中所涉及的那些部分，所以可獲得許多不激活RNA酶H的AON。例如，此類AON可以是寡聚物，其中至少一個或全部核苷酸間橋接磷酸殘基是經修飾的磷酸酯，諸如甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯、磷酰嗎啉、磷酰哌嗪、硼磷酸酯、酰胺連鍵和氨基磷酸酯。例如，每隔一個核苷酸間橋接磷酸殘基可以如所述進行修飾。在另一個非限制性實例中，此類AON是其中至少一個或全部核苷酸含有2'低級烷基部分(諸如C1-C4直鏈或支鏈、飽和或不飽和烷基，諸如甲基、乙基、乙烯基、丙基、1-丙烯基、2-丙烯基和異丙基)的分子。例如，每隔一個核苷酸可以如所述進行修飾。雖然上述AON是本發明AON的優選形式，但本發明包括其他寡聚反義分子，包括但不限于如下所述的寡聚物模擬物?？捎糜诒景l明的優選AON的具體實例包括含有經修飾的骨架或非天然核苷間連鍵的寡聚物。如本說明書中所定義，具有經修飾的骨架的寡聚物包括在骨架中保留磷原子的那些和在骨架中沒有磷原子的那些。出于本說明書的目的，并且如本領域中有時提及的，在它們的核苷間骨架中沒有磷原子的經修飾的寡聚物也可以被認為是AON。在其他優選的寡聚物模擬物中，核苷酸單元的糖和核苷間連鍵(即骨架)均被新基團置換。維持堿基單元以與適當的核酸靶化合物雜交。一種此類寡聚化合物，即已經證實具有優異雜交性質的寡聚物模擬物，被稱為肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡聚物的糖骨架被含酰胺的骨架，尤其是氨基乙基甘氨酸骨架置換。這些核堿基得以保留并且直接或間接地結合至該骨架的酰胺部分的氮雜氮原子。另一種優選的化學物質是不受任何已知的核酸酶或蛋白酶降解的磷酰二胺嗎啉代寡聚物(PMO)寡聚化合物。這些化合物不帶電荷，當與RNA鏈結合時不激活RNA酶H活性，并且已經證實在體內施用后會發揮持續的剪接調節作用(Summerton和Weller,AntisenseNucleicAcidDrugDevelopment[反義核酸藥物開發],7,187-197)。經修飾的寡聚物可以含有一個或多個經取代的糖部分。寡聚物也可以包括核堿基(在本領域中常常簡稱為“堿基”)修飾或取代。某些核堿基對提高本發明的寡聚化合物的結合親和力是特別有用的。這些包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已經證實5-甲基胞嘧啶取代會使核酸雙鏈體穩定性增加0.6-1.2℃，甚至更特別是當與2'-O-甲氧基乙基糖修飾組合時。本發明寡聚物的另一種修飾涉及將增強寡聚物的活性、細胞分布或細胞攝取的一個或多個部分或綴合物化學連接到寡聚物。此類部分包括但不限于脂質部分(諸如膽固醇部分)、膽酸、硫醚(例如己基-S-三苯甲基硫醇)、硫代膽固醇、脂肪鏈(例如十二烷二醇或十一烷基殘基)、磷脂(例如二-十六烷基-外消旋甘油或三乙銨1,2-二-O-十六烷基外消旋甘油-3-H-膦酸酯)、聚胺或聚乙二醇鏈或金剛烷乙酸、棕櫚基部分、肉豆蔻基或十八烷基胺或己氨基-羰基-羥膽固醇部分。已經將細胞穿透肽添加到磷酰二胺嗎啉代寡聚物中以增強細胞攝取和核定位。已經證實不同的肽標簽會影響攝取效率和靶組織特異性，如Jearawiriyapaisarn等人(2008),Mol.Ther.[分子療法]169,1624-1629中所示。對于給定化合物中的所有位置而言不需要均一地進行修飾，并且事實上可以將上述修飾中的多于一種并入單一化合物中，或者甚至并入寡聚物內的單一核苷處。本發明還包括是嵌合化合物的AON。在本發明的上下文中，“嵌合”AON或“嵌合體”是AON，特別是寡聚物，其含有兩個或更多個化學上不同的區域，每個區域由至少一個單體單元組成，在寡聚物化合物的情況下即是核苷酸。這些寡聚物通常含有至少一個區域，其中寡聚物經修飾以便賦予寡聚物或AON對核酸酶降解增加的抗性，增加的細胞攝取，和用于增加對靶核酸的結合親和力的附加區域。AON及其變體的活性可以根據本領域的常規技術進行測定。例如，檢查的RNA和蛋白的剪接形式和表達水平可以通過用于檢測轉錄的核酸或蛋白的剪接形式和/或表達的多種公知方法中的任一種來評估。此類方法的非限制性實例包括RNA剪接形式的RT-PCR，接著是PCR產物的大小分離，核酸雜交方法例如Northern印跡和/或使用核酸陣列；核酸擴增方法；用于檢測蛋白的免疫學方法；蛋白純化方法；以及蛋白功能或活性測定。RNA表達水平可以通過從細胞、組織或生物體制備mRNA/cDNA(即，轉錄的多核苷酸)，并通過使mRNA/cDNA與參考多核苷酸(測定的核酸的補體)或其片段雜交來評估。cDNA可任選地在與互補多核苷酸雜交之前使用多種聚合酶鏈反應或體外轉錄方法中的任一種進行擴增；優選地，它不進行擴增。還可以使用定量PCR檢測一種或多種轉錄物的表達以評估轉錄物的表達水平。本發明提供了AON誘導的RAGE基因轉錄物的剪接轉換，臨床相關的寡聚物化學和遞送系統，以將RAGE剪接操縱引導至治療水平。全長RAGEmRNA的量大幅降低，以及因此RAGE基因轉錄的RAGE蛋白的量大幅降低通過以下方式實現：a)使用成纖維細胞細胞系通過以下的實驗評估進行體外寡聚物精制：(i)內含子增強子靶基序，(ii)AON長度和寡聚物混合物的開發，(iii)化學物質的選擇，和(iv)添加細胞穿透肽(CPP)以增強寡聚物遞送；以及b)詳細評價生成具有一個或多個缺失外顯子的RAGE轉錄物的新方法。因而，本文證明RAGE前體mRNA的選擇性剪接可用特異性AON調節。以這種方式，可以獲得全長(能夠進行信號傳導的)RAGE蛋白的量的功能性顯著減少，和/或可以實現非信號傳導誘餌受體RAGEmRNA剪接形式(RAGE_v1)或其他誘餌受體的增加，從而減少與諸如神經退行性疾病、癌癥、肺病和其他炎性疾病等疾病相關的嚴重病理。根據本發明使用的AON可以通過公知的固相合成技術方便地制備。用于此類合成的設備由包括例如應用生物系統公司(AppliedBiosystems)(加州福斯特市(FosterCity,Calif.))在內的幾個供應商銷售。在美國專利號4,458,066中描述了一種用于在改性固體支撐物上合成寡聚物的方法?？梢粤硗獾鼗蛱娲缘夭捎帽绢I域已知的用于此類合成的任何其他手段。使用類似技術制備寡聚物諸如硫代磷酸酯和烷基化衍生物是公知的。在一個此類自動化實施例中，二乙基-亞磷酰胺用作原材料并且可以如Beaucage等人(1981)TetrahedronLetters[四面體快報],22:1859-1862所述那樣合成。本發明的AON是體外合成的，不包括生物來源的反義組合物，或設計用于指導AON體內合成的遺傳載體構建體。本發明的分子還可以與其他分子、分子結構或化合物的混合物，例如脂質體，受體靶向分子，口服、直腸、局部或其他制劑包封、綴合或以其他方式締合，以輔助攝取、分布和/或吸收。本發明的AON還可用作可用于疾病治療目的的預防劑或治療劑。因此，在一個實施例中，本發明提供以治療有效量與藥學上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑配混的與RAGE前體mRNA中的選定靶標結合以誘導如本文所述的有效且一致的外顯子跳躍的AON。因此本發明提供了一種用于治療、預防或緩解患者中與RAGE表達相關的疾病的影響的預防性或治療性藥物組合物，該組合物包含：a)一種或多種如本文所述的AON，和b)一種或多種藥學上可接受的載劑和/或稀釋劑。優選地，與RAGE表達相關的疾病選自包括以下項的列表：神經病癥、癌癥；心血管病癥；消化病癥；呼吸病癥、肌肉骨骼病癥、結締組織病癥、腎臟病癥、生殖病癥、皮膚病癥、眼部病癥和內分泌病癥。在本發明的一種形式中，RAGE相關病癥是選自下組的心血管病癥：動脈粥樣硬化、缺血性心臟病、心肌炎、心內膜炎、心肌病、急性風濕熱、慢性風濕性心臟病、腦血管疾病/中風、心力衰竭、血管鈣化、外周血管疾病和淋巴管炎。在本發明的一種形式中，RAGE相關病癥是選自下組的消化系統病癥：牙周炎、食管炎、胃炎、胃十二指腸潰瘍、克羅恩病(Crohndisease)、潰瘍性結腸炎、缺血性結腸炎、腸炎和小腸結腸炎、腹膜炎、酒精性肝病、肝炎、中毒性肝病、膽汁性肝硬化、肝纖維化/肝硬化、非酒精性脂肪肝病/非酒精性脂肪肝炎(NAFLD/NASH)、肝臟創傷以及肝損傷、創傷或手術恢復。在本發明的一種形式中，RAGE相關病癥是選自下組的癌癥：唇、口和咽的惡性腫瘤，消化器官的惡性腫瘤，呼吸和胸內器官的惡性腫瘤，骨和關節軟骨的惡性腫瘤，黑素瘤和皮膚的其他惡性腫瘤，間皮和軟組織的惡性腫瘤，乳房的惡性腫瘤，女性生殖器官的惡性腫瘤，男性生殖器官的惡性腫瘤，泌尿道的惡性腫瘤，眼、腦和中樞神經系統其他部分的惡性腫瘤，甲狀腺和其他內分泌腺的惡性腫瘤，淋巴、造血組織和相關組織的惡性腫瘤，不明確的、繼發性和/或未特定部位的惡性腫瘤。在本發明的一種形式中，RAGE相關病癥為神經病癥并且選自下組：中樞神經系統的炎性疾病、主要影響中樞神經系統的全身性萎縮、錐體束外和運動障礙，帕金森病(Parkinson’sdisease)、中樞神經系統的脫髓鞘疾病、阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease)、局限性腦萎縮、路易體病(Lewybodydisease)、癲癇、偏頭痛、神經性疼痛、糖尿病性神經病、多神經病、神經膠質瘤發展和進展、脊髓創傷和缺血性腦損傷/中風、腦創傷以及腦損傷、創傷或手術恢復。在本發明的一種形式中，RAGE相關病癥為肌肉骨骼病癥并且選自下組：肌營養不良、先天性和沉積性肌病、多肌炎、重癥肌無力、皮肌炎、包涵體肌炎、肌肉萎縮和肌肉損傷。在本發明的一種形式中，RAGE相關病癥為精神病癥并且選自下組：癡呆、阿爾茨海默病、血管性癡呆、成癮、精神分裂癥、主要情感障礙、抑郁癥、躁狂癥、雙相型障礙和焦慮癥。在本發明的一種形式中，RAGE相關病癥為呼吸(肺部)病癥并且選自下組：急性上呼吸道感染、鼻炎、鼻咽炎、鼻竇炎、喉炎、流感和肺炎、急性支氣管炎、急性細支氣管炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、支氣管擴張、肺氣腫、由外部試劑引起的慢性肺病、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、肺嗜酸性粒細胞增多癥和胸膜炎、肺部創傷以及肺損傷、創傷或手術恢復。在本發明的一種形式中，RAGE相關病癥為結締組織病癥并且選自下組：骨關節炎、感染性關節炎、類風濕性關節炎、銀屑病性和腸病性關節病、幼年型關節炎、痛風和其他晶體性關節病、糖尿病性關節病、結節性多動脈炎、變應性肉芽腫性血管炎(Churg-Strauss)、黏膜皮膚淋巴結綜合征[川崎病]、超敏性血管炎、古德帕斯丘綜合征(Goodpasturesyndrome)、血栓性微血管病、韋格納肉芽腫病(Wegenergranulomatosis)、主動脈弓綜合征[高安(Takayasu)]、巨細胞動脈炎、風濕性多肌痛、顯微鏡下多血管炎、低補體血癥性血管炎、全身性紅斑狼瘡、皮多肌炎、多肌炎、系統性硬化、CR(E)ST綜合征、干燥綜合征(Siccasyndrome)[舍格倫]、混合性結締組織病、白塞氏病創傷性肌肉損傷、扭傷、勞損和骨折。在本發明的一種形式中，RAGE相關病癥為腎臟病癥并且選自下組：腎小球腎炎、腎炎、糖尿病性腎病、間質性腎炎、阻塞性和反流性腎病、急性腎衰竭和慢性腎病。在本發明的一種形式中，RAGE相關病癥為生殖病癥并且選自下組：前列腺炎、前列腺肥大、前列腺發育不良、輸卵管炎、卵巢炎、盆腔炎性疾病(PID)、多囊卵巢綜合征、宮頸炎、宮頸非典型增生、陰道炎、外陰炎。在本發明的一種形式中，RAGE相關病癥是選自下組的皮膚病癥：皮炎、濕疹、天皰瘡/類天皰瘡、銀屑病、玫瑰糠疹、扁平苔蘚、蕁麻疹、多形性紅斑、結節性紅斑、曬傷、角化病、光老化性皮膚潰瘍、淺表皮膚損傷和開放性傷口。在本發明的一種形式中，RAGE相關病癥是選自下組的眼部病癥：角膜炎、結膜炎、視網膜炎、青光眼、鞏膜炎、鞏膜外層炎、脈絡膜視網膜炎、糖尿病性視網膜病、黃斑水腫、早產兒視網膜病和視神經炎、眼創傷以及眼損傷、創傷或手術恢復。在本發明的一種形式中，RAGE相關病癥是選自下組的內分泌病癥：糖尿病、胰島素抵抗、葡萄糖耐量降低和甲狀腺炎。該組合物可以包含約1nM至1000nM的本發明的每種所需AON。優選地，該組合物可包含約1nM至500nM、10nM至500nM、50nM至750nM、10nM至500nM、1nM至100nM、1nM至50nM、1nM至40nM、1nM至30nM、1nM至20nM，最優選1nM至10nM的本發明的每種AON。該組合物可包含約1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、20nm、50nm、75nm、100nm、150nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、750nm、800nm、850nm、900nm、950nm或1000nm的本發明的每種所需AON。本發明進一步提供了一種或多種AON，其適于以適合遞送至患者的形式幫助對諸如RAGE表達相關疾病或病理等疾病癥狀的預防性或治療性處理、預防或改善。短語“藥學上可接受的”是指分子實體和組合物是生理上可耐受的，并且當施用給患者時，通常不會產生過敏或類似不良反應，諸如胃部不適等。術語“載劑”是指與化合物一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。此類藥物載劑可以是無菌液體，諸如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的那些，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。水或鹽水溶液及右旋糖和甘油水溶液優選用作載劑，特別是對于注射液而言。合適的藥物載劑在Martin,Remington'sPharmaceuticalSciences[雷明頓藥物科學],第18版,賓夕法尼亞州伊斯頓的馬克出版有限公司(MackPublishingCo.,Easton,PA),(1990)中有描述。在本發明的更具體的形式中，提供了包含治療有效量的一種或多種本發明的AON以及藥學上可接受的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載劑的藥物組合物。此類組合物包括各種緩沖液含量(例如Tris-HCI、乙酸鹽、磷酸鹽)、pH和離子強度的稀釋劑以及添加劑，諸如洗滌劑和增溶劑(例如吐溫80(Tween80)、聚山梨醇酯80)，抗氧化劑(例如抗壞血酸、焦亞硫酸鈉)，防腐劑(例如硫柳汞、苯甲醇)和填充物質(例如乳糖、甘露醇)。該材料可以摻入聚合化合物諸如聚乳酸、聚乙醇酸等的顆粒制備物中或摻入脂質體中。也可以使用透明質酸。此類組合物可影響本發明蛋白和衍生物的物理狀態、穩定性、體內釋放速率和體內清除率。參見，例如，Martin,Remington'sPharmaceuticalSciences[雷明頓藥物科學],第18版(1990,賓夕法尼亞州伊斯頓的馬克出版有限公司(MackPublishingCo.,Easton,PA)18042)第1435-1712頁，其通過援引并入本文。該組合物可以制成液體形式，或者可以呈干粉，諸如凍干形式。應當理解，根據本發明提供的藥物組合物可以通過本領域已知的任何手段施用。優選地，用于施用的藥物組合物通過注射、口服、局部施用或通過肺或鼻途徑施用。適當的途徑可由本領域技術人員視治療中受試者的狀況來確定。在某些實施例中，本披露的AON可通過肺或鼻途徑遞送(例如，經由摻入AON的霧化鹽水)。在肺部中發現RAGEmRNA在健康人組織中的最高內源性表達并且可經由氣道接近。吸入式寡核苷酸是呼吸道疾病的新興治療方式。氣道獨特地襯有肺表面活性物質，這些表面活性物質主要由兩性離子脂質組成。這些表面活性物質脂質在呼吸道的pH下具有陽離子特性。當吸入陰離子寡核苷酸時，它們傾向于被表面活性物質吸附，產生重新配制的顆粒，已經假設這些顆粒被支氣管和肺泡上皮細胞有效地吸收到肺細胞中。值得注意的是，已經證實AON能夠經受霧化過程。在某些實施例中，AON更優選通過靜脈內、動脈內、腹膜內、肌內或皮下施用途徑遞送。血管或血管外循環、血液或淋巴系統和腦脊髓液是可以引入AON的一些非限制性部位。在某些實施例中，可以采用直接CNS遞送，例如，可以使用腦室內或鞘內施用作為施用途徑。用于局部施用的制劑包括其中本披露的寡聚物與局部遞送劑諸如脂質、脂質體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑和表面活性劑配混的那些。脂質和脂質體包括中性(例如，二油?；字OPE乙醇胺、二肉豆蔻?；字Ｄ憠ADMPC、二硬脂?；字Ｄ憠A)、陰性(例如二肉豆蔻?；字８视虳MPG)和陽離子性(例如二油?；募谆被鵇OTAP和二油?；字Ｒ掖及稤OTMA)。對于局部或其他施用，本披露的寡聚物可包封在脂質體內或者可與脂質體形成復合物，特別與陽離子脂質體形成復合物。替代性地，寡聚物可以與脂質，特別是與陽離子脂質復合。脂肪酸和酯、其藥學上可接受的鹽及其用途在美國專利號6,287,860和/或1999年5月20日提交的美國專利申請序列號09/315,298中有進一步描述。在某些實施例中，本披露的AON可通過透皮方法遞送(例如，經由將AON摻入到例如乳液中，其中此類AON任選地包裝到脂質體中)。此類透皮和乳液/脂質體介導的遞送方法在本領域中描述用于AON遞送，例如在美國專利號6,965,025中。本文所述的AON也可經由可植入裝置遞送。此類裝置的設計是本領域公認的方法，例如美國專利號6,969,400中描述的合成植入物設計。用于口服施用的組合物和制劑包括粉末或顆粒劑、微粒、納米顆粒、在水或非水介質中的懸浮液或溶液、膠囊、凝膠膠囊、小袋、片劑或小片?？赡苄枰龀韯?、調味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑?？诜苿┦瞧渲斜九兜墓丫畚镞B同一種或多種滲透增強劑表面活性劑和螯合劑一起施用的那些。表面活性劑包括脂肪酸和/或其酯或鹽、膽汁酸和/或其鹽。膽汁酸/鹽和脂肪酸及其用途在美國專利號6,287,860中有進一步描述。在一些實施例中，本披露提供了滲透增強劑的組合，例如脂肪酸/鹽與膽汁酸/鹽組合。示例性的組合是月桂酸、癸酸和UDCA的鈉鹽。其他滲透增強劑包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-十六烷基醚。本披露的寡聚物可以以顆粒形式(包括噴霧干燥的顆粒)口服遞送，或復合形成微?；蚣{米顆粒。寡聚物復合劑及其用途在美國專利號6,287,860中有進一步描述。寡聚物的口服制劑及其制備在U.S.6,887,906、09/315,298(1999年5月20日提交)和/或US20030027780中有詳細描述。用于腸胃外、鞘內或心室內施用的組合物和制劑可包括無菌水溶液，該無菌水溶液還可以含有緩沖劑、稀釋劑和其他合適的添加劑，諸如但不限于滲透增強劑、載劑化合物和其他藥學上可接受的載劑或賦形劑。治療有用量的AON的遞送可以通過先前公開的方法實現。例如，AON的細胞內遞送可以經由包含AON與有效量的嵌段共聚物的配混物的組合物進行。在美國專利申請US20040248833中描述了這種方法的實例。在MannCJ等人(2001)Proc,Natl.Acad.Science[美國國家科學院院刊],98(1)42-47和在Gebski等人(2003)HumanMolecularGenetics[人類分子遺傳學],12(15):1801-1811中描述了將AON遞送到細胞核的其他方法。在US6,806,084中描述了將核酸分子通過表達載體以裸DNA或與脂質載劑復合的方式引入細胞中的方法?？赡苄枰谀z體分散體系中遞送AON。膠體分散體系包括大分子復合物、納米囊、微球、珠粒和基于脂質的體系，包括水包油乳液、膠束、混合膠束和脂質體或脂質體制劑。這些膠體分散體系可用于制造治療性藥物組合物。脂質體是可以用作體外和體內遞送媒介物的人工膜囊泡。這些制劑可以具有凈陽離子、陰離子或中性電荷特征，并且具有用于體外、體內和離體遞送方法的有用特征。已經證實大的單層囊泡可包封相當大百分比的含有大分子的水性緩沖液。RNA和DNA可以包封在水性內部并以生物活性形式遞送至細胞(Fraley等人，TrendsBiochem.Sci.[生物化學趨勢]6:77,1981)。為了使脂質體成為有效的基因轉移媒介物，應當存在以下特征：(1)高效包封目標AON，同時不損害其生物活性；(2)與非靶細胞相比，與靶細胞優先大幅結合；(3)高效遞送囊泡的水性內容物至靶細胞的細胞質；以及(4)遺傳信息的準確和有效表達(Mannino等人，Biotechniques[生物技術],6:682,1988)。脂質體的組成通常是磷脂(特別是高相變溫度磷脂)通常與類固醇(尤其是膽固醇)的組合。也可以使用其他磷脂或其他脂質。脂質體的物理特征取決于pH、離子強度和二價陽離子的存在。陽離子脂質體是帶正電荷的脂質體，據信，帶正電荷的脂質體與帶負電荷的DNA分子相互作用形成穩定的復合物。據信，pH敏感性或帶負電荷的脂質體會捕獲DNA而不是與它復合。陽離子和非陽離子脂質體均已用于將DNA遞送至細胞。脂質體還包括“空間穩定的”脂質體，如本文所用的術語“空間穩定的”脂質體是指包含一種或多種特化脂質的脂質體，特化脂質當摻入到脂質體中時，相對于缺乏此類特化脂質的脂質體，導致循環壽命增加?？臻g穩定的脂質體的實例是其中脂質體的形成囊泡的脂質部分的一部分包含一種或多種糖脂或是具有一種或多種親水性聚合物諸如聚乙二醇(PEG)部分的衍生物的那些脂質體。脂質體及其用途在U.S.6,287,860中有進一步描述。本文所述的AON也可經由可植入裝置遞送。此類裝置的設計是本領域公認的方法，例如美國專利號6,969,400中描述的合成植入物設計，該專利的內容通過援引以其全文并入本文?？梢允褂帽绢I域公認的技術(例如，轉染、電穿孔、融合、脂質體、膠體聚合物顆粒和病毒及非病毒載體以及本領域已知的其他手段)將反義寡核苷酸引入細胞中。所選擇的遞送方法將至少取決于待治療的細胞和細胞的位置，并且對于本領域技術人員將是顯而易見的。例如，可以通過表面上具有特定標志物的脂質體實現定位以引導脂質體，直接注射到含有靶細胞的組織中，特異性受體介導的攝取等。如本領域已知的，可以使用例如涉及脂質體介導的攝取、脂質綴合物、聚賴氨酸介導的攝取、納米顆粒介導的攝取和受體介導的胞吞作用的方法，以及另外的非胞吞遞送模式，諸如顯微注射、透化(例如，鏈球菌溶血素-O透化、陰離子肽透化)、電穿孔和本領域已知的各種非侵入性非胞吞遞送方法(參考Dokka和Rojanasakul,AdvancedDrugDeliveryReviews[高級藥物遞送綜述]44,35-49，通過援引以其全文并入)來遞送AON。AON還可與其他藥學上可接受的載劑或稀釋劑組合以產生藥物組合物。合適的載劑和稀釋劑包括等滲鹽水溶液，例如磷酸鹽緩沖鹽水。組合物可以配制成用于腸胃外、肌內、靜脈內、皮下、眼內、口服或透皮施用。所描述的施用途徑僅旨在作為指導，因為熟練的從業者將能夠容易地確定用于任何特定動物和病狀的最佳施用途徑和任何劑量。已經嘗試了在體外和體內將功能性新遺傳物質引入細胞中的多種方法(Friedmann(1989)Science[科學],244:1275-1280)。這些方法包括將待表達的基因整合到經修飾的逆轉錄病毒中(Friedmann(1989)同上；Rosenberg(1991)CancerResearch[癌癥研究]51(18),增刊:5074S-5079S)；整合到非逆轉錄病毒載體中(Rosenfeld等人(1992)Cell[細胞],68:143-155；Rosenfeld等人(1991)Science[科學],252:431-434)；或經由脂質體遞送與異源啟動子-增強子元件連接的轉基因(Friedmann(1989)同上；Brigham等人(1989)Am.J.Med.Sci.[美國醫學科學雜志],298:278-311；Nabel等人(1990)Science[科學],249:1285-1288；Hazinski等人(1991)Am.J.Resp.CellMolec.Biol.[美國呼吸細胞與分子生物學雜志],4:206-209；以及Wang和Huang(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.[美國國家科學院院刊](USA),84:7851-7855)；與配體特異性的基于陽離子的轉運系統偶聯(Wu和Wu(1988)J.Biol.Chem.[生物化學雜志],263:14621-14624)或使用裸DNA、表達載體(Nabel等人(1990)，同上)；Wolff等人(1990)Science[科學],247:1465-1468)。將轉基因直接注射到組織中僅產生局部表達(Rosenfeld(1992)同上)；Rosenfeld等人(1991)同上；Brigham等人(1989)同上；Nabel(1990)同上；和Hazinski等人(1991)同上)。Brigham等人的小組(Am.J.Med.Sci.[美國醫學科學雜志](1989)298:278-311和ClinicalResearch[臨床研究](1991)39(摘要))報道了靜脈內或氣管內施用DNA脂質體復合物后僅體內轉染小鼠的肺部。人類基因治療程序的綜述文章的實例是：Anderson,Science[科學](1992)256:808-813；Barteau等人(2008),CurrGeneTher[當今基因療法]；8(5):313-23；Mueller等人(2008).ClinRevAllergyImmunol[過敏與免疫學臨床綜述]；35(3):164-78；Li等人(2006)GeneTher.[基因療法],13(18):1313-9；Simoes等人(2005)ExpertOpinDrugDeliv[藥物遞送專家見解]；2(2):237-54。本發明的AON涵蓋任何藥學上可接受的鹽、酯或此類酯的鹽，或在施用給包括人在內的動物后能夠(直接或間接)提供其生物活性代謝物或殘基的任何其他化合物。因此，作為實例，本披露還涉及本發明化合物的前藥和藥學上可接受的鹽、此類前藥的藥學上可接受的鹽和其他生物等效物。術語“藥學上可接受的鹽”是指本發明化合物的生理學上和藥學上可接受的鹽：即，保留母體化合物的所需生物活性而不會對其產生不期望的毒理學作用的鹽。對于寡聚物，藥學上可接受的鹽的優選實例包括但不限于(a)與陽離子(諸如鈉、鉀、銨、鎂、鈣)、聚胺(諸如精胺和亞精胺)等形成的鹽；(b)與無機酸(例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等)形成的酸加成鹽；(c)與有機酸形成的鹽，這些有機酸例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、鞣酸、棕櫚酸、海藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等；以及(d)由元素陰離子(諸如氯、溴和碘)形成的鹽。本發明的藥物組合物可以多種方式施用，這取決于需要局部治療還是全身治療以及待治療的區域。施用可以是局部(包括眼部和粘膜，以及直腸遞送)、肺部(例如通過吸入或吹入粉末或氣霧劑)(包括通過噴霧器、經氣管內、鼻內、表皮和透皮)、口服或腸胃外。腸胃外施用包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌內注射或輸注；或顱內(例如鞘內或心室內)施用。據信，具有至少一個2'-O-甲氧基乙基修飾的寡聚物特別適用于口服施用。優選地，AON經由皮下或靜脈內途徑遞送?？梢苑奖愕匾詥挝粍┬统尸F的本發明的藥物制劑可以根據制藥業中公知的常規技術制備。此類技術包括將活性成分與藥物載劑或賦形劑締合的步驟。一般而言通過將活性成分與液體載劑或細分固體載劑或兩者均勻且緊密地締合，然后，如果需要，使產品成形來制備制劑。在一個實施例中，以有效產生至少200-400nMAON的峰值血液濃度的量和方式施用AON。典型地，通常定期施用一劑或多劑AON，持續約一周至兩周?？诜┯玫膬炦x劑量為每70kg約1mg至1000mg寡聚物。在一些情況下，可能需要大于1000mg寡聚物/患者的劑量。對于靜脈施用，優選的劑量為每70kg約0.5mg至1000mg寡聚物。對于靜脈內或皮下施用，AON可以約120mg/kg的劑量每天或每周施用。AON可以在短時間內定期施用，例如每天施用，持續兩周或更短時間。然而，在一些情況下，在更長的時間段內間歇性地施用寡聚物。施用之后或同時可以是抗生素或其他治療性處理的施用。治療方案可以基于免疫測定、其他生物化學試驗和接受治療的受試者的生理檢查的結果按照指示進行調整(劑量、頻率、途徑等)。給藥取決于待治療的疾病狀態的嚴重程度和反應性，治療過程持續幾天至幾個月，或直至實現治愈或達到疾病狀態的減弱。最佳給藥方案可以根據患者體內藥物積聚的測量值計算。普通技術人員可以容易地確定最佳劑量、給藥方法和重復率。最佳劑量可以根據單個寡聚物的相對效力而變化，并且通?？梢曰谠隗w外和體內動物模型中發現有效的EC50來估計。一般而言，劑量為0.01μg至100g/kg體重，并且可以每天、每周、每月或每年給予一次或多次，或甚至每2至20年給予一次?；跍y量的藥物在體液或組織中的停留時間和濃度，本領域的普通技術人員可以容易地估計給藥的重復率。在治療成功后，可能需要讓患者進行維持治療以防止疾病狀態的復發，其中以范圍為0.01μg至100g/kg體重的維持劑量施用寡聚物，每天一次或多次至每20年一次。使用本發明的AON的有效體內治療方案可以根據施用的持續時間、劑量、頻率和途徑以及接受治療的受試者的狀況而變化(即，預防性施用對比響應于局部或全身感染的施用)。因此，為了獲得最佳治療結果，此類體內療法常常將會需要通過適于治療的特定類型的病癥的試驗進行監測，并相應地調整劑量或治療方案?？梢岳缤ㄟ^本領域已知的疾病的一般指標來監測治療。體內施用的本發明的AON的功效可以從在施用AON之前、期間和之后取自受試者的生物樣品(組織、血液、尿液等)確定。此類樣品的測定包括(1)使用本領域技術人員已知的程序，例如電泳凝膠遷移率測定，監測存在或不存在與靶序列和非靶序列形成異源雙鏈體；(2)監測通過標準技術諸如RT-PCR、Northern印跡、ELISA或Western印跡測定的突變mRNA相對于參照正常mRNA或蛋白的量。核內寡聚物遞送是AON的主要挑戰。不同的細胞穿透肽(CPP)在不同的條件和細胞系中不同程度地定位PMO，發明人評價了新型CPP將PMO遞送至靶細胞的能力。術語CPP或“增強細胞攝取的肽部分”可互換使用并且是指陽離子細胞穿透肽，也稱為“轉運肽”、“載體肽”或“肽轉導結構域”。如本文所示的肽具有在給定細胞培養群體的約或至少約30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％細胞內誘導細胞穿透的能力，并且在全身施用后允許大分子在體內多個組織內易位。CPP是本領域中公知的，并且例如在美國申請號2010/0016215中披露，該申請通過援引以其全文并入。因此，本發明提供了與細胞穿透肽組合用于制造治療性藥物組合物的本發明的AON。根據本發明的另一方面，提供了一種或多種如本文所述的用于基于AON的療法的AON。優選地，該療法用于與RAGE表達有關的病狀。更優選地，用于與RAGE表達有關的病狀的療法是用于選自以下的疾病的療法：癌癥、神經退行性疾病、肺病和炎性疾病。更具體地，AON可選自由表3a-3d中任一個中所列的任何一種或多種AON和/或SEQIDNO:1-31，以及它們的組合或混合物組成的組。更優選地，AON是SEQIDNO:11、18、19或20。這包括可以在嚴格雜交條件下與此類序列雜交的序列，與其互補的序列，含有經修飾的堿基的序列，經修飾的骨架，以及在RAGE基因轉錄物中具有或調節前體mRNA加工活性的其功能性截短物或延伸物。本發明還擴展到能夠與選定靶標結合以誘導RAGE基因轉錄物中的外顯子排除的兩種或更多種AON的組合。該組合可以是兩種或更多種AON的混合物，包含連接在一起的兩種或更多種或兩種或更多種AON的構建體，用于基于AON的療法。AON的組合優選地是SEQIDNO:11和10的組合或SEQIDNO:11和13的組合。本發明提供了一種用于治療、預防或緩解與RAGE表達相關的疾病的影響的方法，該方法包括以下步驟：a)向該患者施用有效量的一種或多種如本文所述的AON或包含一種或多種AON的藥物組合物。此外，本發明提供了一種用于治療、預防或緩解癌癥、神經退行性疾病、肺病和炎性疾病的影響的方法，該方法包括以下步驟：a)向該患者施用有效量的一種或多種如本文所述的AON或包含一種或多種AON的藥物組合物。優選地，該療法用于經由外顯子跳躍策略降低功能性RAGE蛋白的水平。RAGE水平的降低優選通過修飾RAGE基因轉錄物或其部分中的前體mRNA剪接而降低轉錄物水平來實現。RAGE的降低將優選導致RAGE相關病狀或病理(諸如神經退行性疾病、癌癥、肺病和炎性疾病)的癥狀的數量、持續時間或嚴重程度的降低。如本文所用，受試者(例如哺乳動物，諸如人)或細胞的“治療”是在試圖改變個體或細胞的自然過程中使用的任何類型的干預。治療包括但不限于施用藥物組合物，并且可以預防性地進行或在病理事件開始或與病原體接觸后進行。還包括“預防性”治療，這可以涉及降低所治療的疾病或病狀的進展速率、延遲該疾病或病狀的發作、或降低其發作的嚴重程度?！爸委煛被颉邦A防”不一定表示完全根除、治愈或預防疾病或病狀或其相關癥狀。根據本發明的另一方面，提供了一種或多種如本文所述的AON在制造用于調節或控制與RAGE表達相關的疾病的藥物中的用途。本發明還提供了如本文所述的經純化和分離的AON用于制造用于治療與RAGE表達相關的疾病的藥物的用途。提供了如本文所述的經純化和分離的AON用于制造用于治療、預防或緩解與RAGE表達相關的疾病的影響的藥物的用途。優選地，RAGE相關病理或疾病是神經退行性疾病、癌癥、肺病或炎性疾病。根據本發明的另一方面，本發明擴展到本發明的AON序列的cDNA或克隆拷貝，以及含有本發明的AON序列的載體。本發明還進一步擴展到含有此類序列和/或載體的細胞。本發明的AON可以與另一種治療分子共同施用。例如，AON可以與第二治療劑一起施用，該第二治療劑是能夠調節RAGE胞質尾的化合物，諸如肽。此類化合物包括：IQGAP-1、diaphanous-1、蛋白激酶Cζ(PKCζ)、Dock7、MyD88、TIRAP、ERK1/2、嗅覺受體2T2、ADP/ATP移位酶2、蛋白磷酸酶1G、IRAK4、蛋白DJ-1(PARK7)、調寧蛋白-3、腦發育蛋白(Drebrin)、細絲蛋白(Filamin)B、Ras相關蛋白Rab-13、根蛋白(Radixin)/埃茲蛋白(Ezrin)/膜突蛋白(Moesin)、蛋白脂質蛋白2、冠蛋白(Coronin)、S100A11、琥珀酰輔酶A連接酶[形成GDP]亞基α、Hsc70相互作用蛋白、凋亡抑制劑5、神經氈蛋白(neuropilin)、裂解刺激因子、生長因子受體結合蛋白2、sec61β亞基或Nck1。本發明還提供了用于治療、預防或緩解患者中與RAGE表達相關的疾病或病狀的藥盒，該藥盒至少包含包裝在合適容器中的用于修飾RAGE基因轉錄物或其部分中的前體mRNA剪接的經分離或純化的AON，以及其使用說明書。在一個優選的實施例中，藥盒將含有至少一種如本文所述的AON，SEQIDNO:1-31和/或表3a-3d中任一個所示的序列中的任何一個或多個，或如本文所述的AON的混合物。藥盒還可以包含外圍試劑，諸如緩沖劑、穩定劑等。更優選地，AON是SEQIDNO:11、18、19或20。因此，提供了一種用于治療、預防或緩解患者中與RAGE表達相關的疾病或病狀的藥盒，該藥盒至少包含包裝在合適容器中的本文所述的AON，SEQIDNO:1-31和/或表3a-3d中任一個所示的序列中的任何一個或多個及其組合或混合物，以及其使用說明書。更優選地，AON是SEQIDNO:11、18、19或20。AON的組合優選地是SEQIDNO:11和10的組合或SEQIDNO:11和13的組合。優選地，該疾病或病狀選自包括以下項的列表：癌癥、神經退行性疾病、肺病或炎性疾病。藥盒的內容物可以是凍干的，并且藥盒可以另外含有用于重構凍干組分的合適溶劑。藥盒的各個組分將被包裝在單獨的容器中，與此類容器相關的可以是由監管藥物或生物產品的制造、使用或銷售的政府機構規定的形式的通知，該通知反映了該機構批準制造、使用或銷售以供人類施用。當藥盒的組分以一種或多種液體溶液提供時，液體溶液可以是水溶液，例如無菌水溶液。對于體內使用，可以將表達構建體配制成藥學上可接受的可注射組合物。在這種情況下，容器裝置本身可以是吸入器、注射器、移液管、滴眼管或其他類似設備，可以從這些容器裝置中將制劑施加到動物的受影響區域(諸如肺部)，注射到動物體內，或甚至施加到藥盒的其他組分中并與藥盒的其他組分混合。藥盒的組分也可以干燥或凍干形式提供。當試劑或組分以干燥形式提供時，通常通過添加合適的溶劑進行重構。設想溶劑也可以提供在另一容器裝置中。不考慮容器的數目或類型，本發明的藥盒還可以包括或包裝有用于輔助將最終的復合組合物注射/施用或放置在動物體內的儀器。此類儀器可以是吸入器、注射器、移液管、鑷子、量匙、滴眼管或任何此類醫學上批準的遞送媒介物。本領域的普通技術人員應當理解，上述方法的應用對于鑒定適合用于治療許多其他疾病的AON具有廣泛的應用。本發明的AON還可以與替代療法諸如藥物療法聯合使用。因此，本發明提供了一種治療、預防或改善與RAGE表達相關的疾病或病狀的影響的方法，其中本發明的AON和另一種與治療、預防或改善與RAGE表達相關的疾病或病狀的影響相關的替代療法依次或同時施用。優選地，該疾病或病狀選自包括以下項的列表：神經退行性疾病、癌癥、肺病或炎性疾病?？倓t本領域技術人員將理解，除了具體描述的那些之外，本文描述的本發明易于改變和修改。應當理解，本發明包括所有此類改變和修改。本發明還包括說明書中單獨或共同提及或指出的所有步驟、特征、組合物和化合物，以及這些步驟或特征的任何和所有組合或任何兩個或更多個。本發明的范圍不受本文描述的特定實施例的限制，這些實施例僅旨在用于舉例說明的目的。功能上等效的產品、組合物和方法顯然在本文所述的本發明的范圍內。本文引用的所有出版物(包括專利、專利申請、期刊論文、實驗室手冊、書籍或其他文件)的全部披露內容通過援引并入本文。不承認任何參考文獻都構成現有技術或者是在本發明所涉領域中工作的技術人員的公知常識的一部分。在本文中引用的每個文件、參考文獻、專利申請或專利明確地通過援引以其全文并入本文，這意味著讀者應將它作為本文的一部分來閱讀和考慮。在本文中引用的文件、參考文獻、專利申請或專利在本文中不再重復僅僅是出于簡潔的原因。本文或通過援引并入本文的任何文件中提及的任何產品的任何制造商的說明書、描述、產品規格和產品清單特此通過援引并入本文，并且可用于本發明的實踐。如本文所用，術語“導出的”和“導出自”應理解為表示特定整數可從特定來源獲得，但不一定直接從該來源獲得。如本文所用，除非上下文另外明確指出，否則單數形式“一”、“一種(個)”和“該”包括復數指示物。在整個說明書中，除非上下文另有要求，否則詞語“包含(comprise)”或諸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的變型將被理解為暗示納入所陳述的整數或整數的組，但不排除任何其他整數或整數的組。除了在操作實例中，或在另外指明的情況下，否則在說明書和權利要求書中使用的表示成分的量、反應條件等的所有數字均應理解為在所有情況下由術語“約”修飾。因此，除非指出相反，否則在說明書和權利要求書中列出的數值參數是近似值，其可以根據本發明所尋求獲得的所需性質而變化。因此，“約80％”意指“約80％”還有“80％”。至少，每個數值參數都應當根據有效數位的數字和普通的舍入方法來解釋。盡管闡述本發明廣泛范圍的數值范圍和參數是近似值，但具體實例中列出的數值是盡可能精確地報告的。然而，任何數值固有地含有由其相應的試驗測量中存在的標準偏差所必然引起的某些誤差。本文所用的選定術語的其他定義可在本發明的詳細描述中找到并通篇適用。除非另有定義，否則本文所使用的所有其他科學和技術術語均具有與本發明所屬領域普通技術人員所通常理解的相同含義。包含本說明書中所包括的核苷酸和氨基酸序列信息的序列標識號(“SEQIDNO:”)匯總于說明書結尾并且已經使用Patentln3.0版程序進行了編制。每個核苷酸或氨基酸序列在序列表中用數字指示符<210>，其后是序列標識符(例如<210>1、<210>2等)來標識。每個核苷酸或氨基酸序列的長度、序列類型和來源生物體分別由數字指示符字段<211>、<212>和<213>中提供的信息標識。提出并公開了反義寡聚物命名系統以區分不同的反義寡聚物(參見Mann等人，(2002)JGenMed[普通醫學雜志]4,644-654)。當測試全部針對相同靶區域的幾種略有不同的反義寡聚物時，這種命名變得特別相關，如下所示：H#A/D(x:y)第一個字母標明物種(例如H：人，M：鼠類)“#”標明靶外顯子數目“A/D”分別指示外顯子起點/末端處的受體或供體剪接位點(xy)表示退火坐標，其中“-”或“+”分別指示內含子或外顯子序列。例如，A(-6+18)指示靶外顯子之前的內含子的最后6個堿基和靶外顯子的前18個堿基。最近的剪接位點將是受體，所以這些坐標前面將會有“A”。描述供體剪接位點處的退火坐標可以是D(+2-18)，其中最后2個外顯子堿基和前18個內含子堿基對應于反義寡聚物的退火位點。將由A(+65+85)表示的完全外顯子退火坐標是從該外顯子開始的第65個和第85個核苷酸之間(包括端值)的位點。以下實例更全面地描述使用上述發明的方式，以及闡述實施本發明各個方面的最佳模式。應當理解，這些方法并不限制本發明的范圍，而是為了說明的目的而呈現。實例在以下每個實例中，除非上下文另有要求，否則以下一般材料和方法適用。將人微血管內皮細胞(HMEC1)在MCDB131培養基(含10mM谷氨酰胺、EGF和氫化可的松的10％FCS)中培養。將人肺上皮細胞(A549)(癌)在F-12K培養基(含2mM谷氨酰胺的10％FBS)中培養。從(野生型)C57bl6小鼠和AGERKO小鼠的主動脈分離原代主動脈內皮細胞(PMAEC)，并在杜爾貝科改良伊格爾培養基(DMEM)/補充有F12內皮細胞生長補充物(ECGS)的培養基中培養。對于用AON轉染，將上皮細胞或內皮細胞接種到48孔板中保持24或48小時，然后使用lipofectamine3000試劑(0.15ul/孔的lipofectamine3000；0.4ul/孔P3000/孔)，用靶向人AGER(對于HMEC1和A549)和小鼠PMAEC細胞的鼠AGER的外顯子9的AON或用相應對照(表3a-3d)轉染。將細胞與AON/陽離子脂質復合物在37℃下孵育24小時，此后將細胞裂解，提取RNA并使用TRIZOL技術或CellstoCT方法生成cDNA。為了測量對人RAGE前體mRNA選擇性剪接的影響，使用實時RT-PCR引物測定RAGE的第11外顯子、外顯子9b或跨越外顯子8-10的表達，分別表示所有RAGEmRNA剪接變體中保留的表達(mRNA)，外顯子9b的保留或編碼跨膜-胞質尾的RAGEv1同種型的表達。胞質尾的外顯子8-10的PCR信號相對于外顯子11的減少表明較少的RAGEmRNA剪接形式含有外顯子10，并且細胞產生較少的全長RAGE蛋白同種型(能夠信號傳導)。在鼠類細胞和組織中，跨越鼠類RAGEmRNA外顯子10-11的引物用于表示含有外顯子10的RAGEmRNA剪接形式的表達。還收集培養基并通過ELISA測定可溶性RAGE的水平。在通過ELISA測試之前，使用分子量截留過濾器濃縮培養基(6ml)。中國倉鼠卵巢(CHO)細胞高水平表達重組蛋白，使其成為研究以改變蛋白分泌為終點的前體mRNA剪接的調控的理想系統。作為更好地研究AON對導致胞外可溶性RAGE表達和分泌的RAGE剪接的影響的模型系統，使用Lipofectamine2000，用編碼人基因組AGER(gRAGE)序列(排除天然5'和3'非翻譯區)的質粒連同AON轉染在F12培養基(補充有10％FBS)中生長的CHO細胞。2天后，收集培養基，使用分子量截留過濾器濃縮并使用抗hRAGE抗體(R&D系統公司(R&Dsystems))通過western印跡檢測。為了確定施用AON后檢測到的RAGE變體的確切序列，使用Trizol方法提取RNA并且使用寡dT引物生成cDNA，之后使用RAGE的5'和3'UTR序列的RAGE特異性引物進行PCR并且進行半嵌套PCR擴增RAGE序列的混合物。將凝膠純化的RAGE條帶克隆到TA克隆載體中，然后轉化到大腸桿菌Top10細胞中。選擇50個以上的菌落使用MultiNA序列分析儀，使用跨越外顯子8-11的引物進行表征以確定RAGE插入片段的大小。將每種大小的5種克隆送去進行桑格測序(sangersequencing)以確認與條帶大小一致的RAGE序列剪接形式。為了測量干預RAGE的配體依賴性和配體非依賴性激活的功能影響，將細胞暴露于AT1R同源配體AngII(1μM)或RAGE配體S100A8/A9(0.6ug/mL)細胞4小時。然后將細胞冷凍儲存，直到使用CellstoCt方法提取mRNA和合成cDNA。通過定量實時RT-PCR估計NFκB亞基、p65(RelA)或NFκB激活的靶基因(例如ICAM-1)的基因表達的變化，該定量實時RT-PCR使用基于對累積熒光的實時檢測的TaqMan系統(ABIPrism7700，美國加州福斯特市PE生物系統，珀金埃爾默公司(Perkin-ElmerInc,PEBiosystems,FosterCity,CA,USA))進行。將基因表達歸一化為18SmRNA并報告為與未處理的對照小鼠/細胞中的表達水平相比的倍數變化，未處理的對照小鼠/細胞中的表達水平給予任意值1。實例1.使用靶向外顯子10中的順式作用RNA元件的反義寡核苷酸調節人細胞中RAGE的選擇性剪接本實例證明RAGE前體mRNA的剪接可使用靶向RAGE前體mRNA的外顯子10中的順式作用RNA元件的AON來調節。RAGE前體mRNA天然地經受選擇性剪接，生成一系列mRNA剪接形式。這些RAGE剪接形式的大多數含有外顯子10和11兩者，分別編碼RAGE的跨膜結構域和胞質結構域，因此產生的蛋白同種型能夠被RAGE配體激活并被并置的GPCR反式激活，以誘導促炎和促增殖信號傳導。外顯子9中的替代性5′剪接位點選擇也可導致外顯子9的83個核苷酸延伸(外顯子9B；圖1a)。因為該替代性剪接位點與外顯子10起始處的3'(受體)剪接位點之間的距離僅為46個核苷酸，比真核生物中內含子長度的下限短得多，因此跳過外顯子10，而選擇外顯子11起始處的3'(受體)位點。這種選擇性剪接也引入了提前終止密碼子，但由于它與最后一個外顯子-外顯子連接處緊密(29bp)靠近而不經受無義介導的衰變。因此，由這種選擇性剪接產生的成熟mRNA(RAGE_v1，圖1a)編碼缺少分別由外顯子10和11編碼的膜保留和胞質信號傳導所需的元件的蛋白同種型，因此分泌并天然存在于循環、支氣管肺泡和腦脊髓液中。這種esRAGE可以充當誘餌受體，從而與細胞表面全長RAGE競爭配體或增加配體的清除。由外顯子9b編碼的新型17-氨基酸C端也可以對RAGE信號傳導或多聚化具有獨立的作用。用10nM靶向外顯子10的AON轉染人肺上皮細胞(A549)導致含有外顯子9b的RAGEmRNA剪接形式的表達變化(圖1b)。如通過實時RT-PCR測量的，一些AON，尤其是AON3779，與對照(亂序RNA處理的)細胞相比，增加了含有外顯子9b的RAGEmRNA剪接形式的表達。其他也靶向外顯子10的AON，尤其是AON3777和3781沒有影響。用10nM濃度的靶向外顯子10的AON轉染人肺上皮細胞(A549)也導致RAGEmRNA剪接形式的表達變化，使得如通過實時RT-PCR所測量的，當與對照(亂序RNA處理的)細胞相比時，一些AON，尤其是AON3779、3780、3781、82、83和87降低含有外顯子10的RAGEmRNA剪接形式(即編碼胞質尾的信號傳導元件)的表達(圖1c和圖1d)。其他也靶向外顯子10的AON，尤其是AON3777、84和85沒有影響。然后分離在存在和不存在靶向外顯子10的選定AON時在人肺上皮細胞(A549)中表達的所有RAGEmRNA剪接形式，并克隆到大腸桿菌Top10細胞中。使用跨越外顯子8和外顯子11的引物，測定每個RAGE插入片段的大小。用靶向外顯子10的選定AON，尤其是AON3779和3778處理，導致含有250kB大小片段的RAGEmRNA剪接形式的表達增加(圖1e)，表明外顯子9b的保留。靶向外顯子10的所有AON也降低了表達300kB條帶的mRNA克隆的表達百分比，表示外顯子8-10中含有的能夠信號傳導的元件的完全表達。具體而言，AON3779導致含有300kB大小片段的RAGEmRNA剪接形式減少49％(圖1f)。靶向外顯子10的所有AON還誘導完全缺失外顯子8(通過桑格測序確認并通過MultiNA分析儀上的凝膠上箭頭指示的空泳道表示；圖1f)和“無帶”片段(圖1e)的RAGEmRNA剪接形式的從頭表達。用靶向外顯子10的AON，尤其是AON3777和3778轉染人肺上皮細胞(A549)也導致含有大小為276和430kB片段的RAGEmRNA剪接形式的從頭表達(圖1e)，分別表示外顯子9的非典型去除和外顯子9、9b和外顯子10的保留。用10nM靶向外顯子10的AON，尤其是AON3779轉染人肺上皮細胞(A549)也導致含有外顯子10的RAGEmRNA剪接形式的拷貝數與對照(亂序RNA處理的)細胞相比變化，如數字PCR所測量的(圖1g)。用10nM靶向外顯子10的AON，尤其是AON3779轉染人肺上皮細胞(A549)也增加了內源可溶性RAGE釋放到培養基中(圖1h)，這與含有外顯子9b的RAGEmRNA剪接形式的表達增加一致。用編碼人RAGE基因組序列(gDNA)的質粒轉染CHO細胞導致基因產物的選擇性剪接，基因產物包括通過Western印跡檢測分泌到細胞培養基中的少量內源性RAGE(紅色箭頭)，與RAGE的正常剪接模式一致(圖1i)。當這些表達人基因組RAGE的CHO細胞用AON3779或AON87共轉染時，分泌到培養基中的內源可溶性RAGE(esRAGE)的量增加(圖1i)。同時，當表達人基因組RAGE的CHO細胞用AON3779或AON87共轉染時，細胞(白色箭頭)中表達和保留的全長RAGE減少。細胞還在細胞內含有增加量的C-截短的RAGE。在表達人基因組RAGE的CHO細胞中，在用靶向外顯子10的選定AON(包括AON3779、AON82、83、84和85)轉染后，如ELISA測量的可溶性RAGE的定量的量也增加(圖1j)。其中，AON3779的效果最大。用在與AON3779相似的區域中靶向外顯子10的一些其他AON，包括AON90和93(圖1k)，以與AON3779相似的量(10nM)，如ELISA測量的可溶性RAGE的定量的量也增加。在用AON3779轉染后，從表達人基因組RAGE的CHO細胞中釋放的可溶性RAGE的定量的量以劑量依賴性方式增加(圖1l)。用10nM靶向外顯子10的AON，尤其是AON3779轉染人肺上皮細胞(A549)，也調節在用RAGE-配體S100A8/A9(0.6μg/mL)激活RAGE后對促炎信號傳導的誘導，導致對ICAM-1表達的誘導(圖1m)。用10nM靶向外顯子10的AON，尤其是AON3779、3780、81、82和83轉染人主動脈內皮細胞(HAEC)也防止在暴露于RAGE配體S100A8/A9(0.6μg/mL；圖1m)后對ICAM-1表達的誘導。用10nM靶向外顯子10的AON，尤其是AON3779轉染人肺上皮細胞(A549)，也調節了在通過血管緊張素II(IμM)激活AT1受體后，RAGE反式激活后對促炎信號傳導的誘導，導致對ICAM-1表達的誘導(圖1o)。用10nM靶向外顯子10的AON，尤其是AON3777、3779、3780、3780、3782和3783轉染人主動脈內皮細胞(HAEC)，也調節對促炎信號傳導的誘導，包括在用血管緊張素II(1μM；圖1p)激活AT1受體后，在RAGE的配體非依賴性反式激活后對ICAM-1表達的誘導。其他靶向外顯子10的AON，尤其是AON3778和84沒有影響。用10nM靶向外顯子10的AON，尤其是AON3779、3780、82、83和87轉染人微血管內皮細胞(HMEC1)導致RAGEmRNA剪接形式的表達變化，包括含有外顯子10的RAGEmRNA剪接形式的表達降低(圖1q)。用10nM靶向外顯子10的AON，尤其是AON3779和87轉染人微血管內皮細胞(HMEC1)也誘導含有外顯子9b的RAGEmRNA剪接形式的表達增加(圖1r)。具有共價連接的八-胍樹形分子的嗎啉代-寡核苷酸(稱為體內嗎啉代寡聚物)可用于體外和體內而不需要轉染試劑。用AON3779的體內嗎啉代寡聚物制劑(1μM)處理人主動脈內皮細胞(HAEC)導致RAGEmRNA剪接形式的表達變化，包括含有外顯子9b的RAGEmRNA剪接形式的增加，如通過RT-PCR測量的(圖1s)。另外，與用對照嗎啉代AON處理的細胞相比，細胞培養基中esRAGE的表達也增加(圖1t)。在沒有轉染試劑的情況下用AON79處理沒有效果。在有轉染試劑的情況下用AON3779轉染示為陽性對照。用AON3779的體內嗎啉代寡聚物制劑(1μM)處理表達人基因組RAGE的CHO細胞也增加可溶性RAGE的表達，如ELISA所測量的(圖1u)。已知聚(G)鏈段，特別是GGGG基序可充當表達沉默子，并且它們常常被hnRNPH和F結合(Sohail等人，BMCGenomics[BMC基因組學].2014)。假設RAGE剪接部分地受內含子9/外顯子9b內富含G的順式元件和核內不均一核糖核蛋白H調控，這對于上游RAGE5’剪接位點的優先利用是必需的。聚(G)鏈段有利于外顯子跳躍，因為hnRNPH的結合需要連續的G鏈段。AON在富含G的區域中通常具有弱親和力和降低的功效。外顯子10含有三個GGGG基序，其中一個基序被識別為hnRNPF結合靶標并且側翼為AON3779、3787和AON3782(圖1v)。然而，使該區域突變(RAGE突變體M3)對外顯子剪接或對AON3779的反應沒有影響(圖1w)，表明我們通過使AON靶向這些區域以調節RAGE的剪接來調節RAGE剪接的新型沉默子，這從現有技術中尚未預測。實例2.使用靶向外顯子9中的順式作用RNA元件的反義寡核苷酸調節人細胞中RAGE的選擇性剪接本實例證明RAGE前體mRNA的選擇性剪接可使用靶向RAGE前體mRNA的外顯子9中的順式作用RNA元件的AON來調節(圖2a)。用10nM濃度的一些靶向外顯子9的AON，尤其是AON3668、3669、3670、4103、4104、4105轉染人肺上皮細胞(A549)，當與對照(亂序RNA處理的)細胞相比時，降低了含有外顯子10的RAGEmRNA剪接形式的表達，如通過實時RT-PCR所測量的(圖2b)。另外的靶向外顯子9的AON，尤其是AON4106沒有影響。然而，RAGEmRNA的總體表達在用靶向外顯子9的所有AON處理后略微升高。分離在存在和不存在靶向外顯子9的選定AON時在人肺上皮細胞(A549)中表達的所有RAGEmRNA剪接形式，并克隆到大腸桿菌Top10細胞中。使用跨越外顯子8-11的引物，測定每個RAGE插入片段的大小(圖2c)。靶向外顯子9的所有AON降低了表達300kB條帶的mRNA克隆的表達百分比(圖2d)，表示外顯子10和11中含有的能夠信號傳導的元件的完全表達。具體而言，AON3670導致含有300kB大小片段的RAGEmRNA剪接形式減少(圖2d)。用靶向外顯子9的AON，尤其是AON3669、3670、4103轉染人肺上皮細胞(A549)也誘導RAGEmRNA剪接形式的從頭表達，其中外顯子8被跳過(在multiNA分析儀上用空泳道表示；圖2c)用靶向外顯子9的AON，尤其是AON3669、3670、4103和4105轉染人肺上皮細胞(A549)也導致含有276kB片段的RAGEmRNA剪接形式的從頭表達，表明外顯子9從剪接形式中去除(圖2d)。在用含有人RAGE基因組序列(gRAGE)的質粒轉染的CHO細胞中，用靶向外顯子9中的RAGE剪接位點的一些AON，特別是AON3669和3671，如ELISA測量的，分泌到培養基中的可溶性RAGE的量當與對照(亂序RNA處理的)細胞相比時適度地增加(圖2e)。用不同濃度的靶向外顯子9的AON，尤其是AON3669、3670和4103轉染人肺上皮細胞(A549)，也抑制在用RAGE-配體S100A8/A9(0.6μg/mL)激活RAGE后對促炎信號傳導的誘導，包括對TLR-4基因表達的誘導(圖2f)。其他靶向外顯子9的AON，尤其是AON3668和4104沒有影響。用10nM靶向外顯子9的AON，尤其是AON3669、3670和4104轉染人肺上皮細胞(A549)也調節在用血管緊張素II(1μM；圖2g)激活AT1受體后，經由RAGE的配體非依賴性反式激活后對促炎信號傳導的誘導。其他靶向外顯子9的AON，尤其是AON3668、3671和4103沒有影響。用10nM靶向外顯子9的AON，尤其是AON3669和3670轉染人微血管內皮細胞(HMEC)也降低含有外顯子10的內源RAGEmRNA剪接形式的表達(圖2h)。實例3.使用靶向外顯子9B中的順式作用RNA元件的反義寡核苷酸調節人細胞中RAGE的選擇性剪接本實例證明RAGE的選擇性剪接可使用靶向RAGE前體mRNA的外顯子9b中的RNA元件的AON來調節。在大多數RAGE同種型中通過選擇性剪接去除外顯子9b(圖1e)。這種去除可能需要剪接形式與外顯子9b中的基序相互作用。我們假設使用AON調節這些結合元件也可以調節RAGE前體mRNA的選擇性剪接。用10nM濃度的靶向外顯子9b的AON轉染人肺上皮細胞(A549)導致RAGEmRNA剪接形式的mRNA表達變化。RAGE的總體表達在用靶向外顯子9b的兩種AON處理后略微升高(圖3a)。另外，如通過實時RT-PCR測量的，與亂序對照處理的細胞相比，在用AON88轉染后，含有外顯子10的RAGEmRNA剪接形式的表達適度降低(圖3a)。用AON88和89，含有外顯子9b的RAGEmRNA剪接形式的表達也適度增加(圖3b)。用靶向外顯子10的AON3779轉染示為陽性對照。用10nM濃度的靶向外顯子9b的AON轉染人微血管內皮細胞(HMEC)也導致含有外顯子10的RAGEmRNA剪接形式的表達降低(圖3c)和含有外顯子9b的RAGEmRNA剪接形式的表達增加(圖3d)。同樣，RAGEmRNA的總體表達在用靶向外顯子9b的兩種AON處理后略微升高(圖3c)。用靶向外顯子10的AON3779轉染示為陽性對照。在用含有人RAGE基因組序列(gRAGE)的質粒轉染的CHO細胞中，用靶向外顯子9b的一些AON，特別是AON89(圖3e)，如ELISA測量的，分泌到培養基中的可溶性RAGE的量當與對照RNA相比時適度地增加。用靶向外顯子10的AON3779轉染示為陽性對照。圖3f中示出了內含子9和用于AON88和89互補靶向的人RAGE序列。實例4.使用靶向RAGE前體mRNA中的順式作用RNA元件的反義寡核苷酸調節鼠類RAGE的選擇性剪接本實例證明RAGE前體mRNA的選擇性剪接也可以使用靶向鼠類RAGE前體mRNA中的外顯子9、9B和10中的順式作用RNA元件的某些AON來調節，并且可以在體外、離體和體內證明這種調節。為了測試AON對鼠類RAGE的選擇性剪接的影響，用含有鼠類RAGE基因組序列的質粒轉染CHO細胞。這導致分泌少量的esRAGE。用靶向鼠類RAGE的AON，尤其是AONm3779(設計成在實例1中詳述的人RAGE序列中被AON3779所靶向的同等序列中靶向鼠類RAGE序列的外顯子10的AON)和AONm101轉染，增加esRAGE分泌到細胞培養基中(圖4a)。用靶向RAGE外顯子9的AON(50mM)轉染原代小鼠主動脈內皮(PMAEC)細胞(表3d)。與它們各自的陰性對照相比，這種處理導致RAGEmRNA剪接形式表達的適度變化。具體而言，AON3674和3675能夠降低含有外顯子10的RAGEmRNA剪接形式的表達，如通過實時RT-PCR所測量的(圖4b)。然而，用10nM的這些AON轉染PMAEC對RAGEmRNA剪接形式的表達沒有顯示出顯著影響(圖4c)。用50nM的AON3674和3675轉染培養的PMAEC后24小時，分泌到培養基中的可溶性RAGE水平適度增加(圖4d)。用m3779(10nM)轉染表達鼠類基因組RAGE的CHO細胞降低了含有外顯子10的RAGEmRNA剪接形式的表達，如通過實時RT-PCR所估計的(圖4e)并且與對照(亂序RNA處理的)細胞相比增加了esRAGE的分泌(圖4f)。靶向人RAGE序列的AON3779也增加esRAGE分泌，但不如AONm3779多。當將設計成靶向鼠類RAGE序列的外顯子10的AON轉染到表達人RAGE基因組序列的CHO細胞中時，質粒AONm3779(設計成靶向鼠類RAGE外顯子10)也誘導細胞培養基中可溶性人RAGE的增加(圖4g)。然而，AON3779(特異性靶向人RAGE外顯子10)在調節人基因組RAGE方面比AONm3779更有效。該數據證明靶向外顯子10中特定序列的AON可有效調節RAGE剪接，盡管存在非同一性區域。為了測試靶向鼠類組織中的RAGE的AON的作用，從小鼠中獲得精確切下的肺部切片(PCLS)，然后離體培養。簡言之，將小鼠人道處死，用瓊脂糖灌注其取出的肺部，取圓柱形芯，然后用組織切片機切割，從而產生具有均勻直徑和厚度的肺部切片。然后在組織培養條件下將PCLS浸沒在多孔板中的培養基中。24小時后，再用體內嗎啉代寡聚物AON3779或非靶對照轉染PCLS48小時。用AON3779處理導致含有外顯子9b的RAGEmRNA的表達顯著增加而含有外顯子10的RAGemRNA剪接形式的表達降低(圖4h)，在給藥后72小時觀察到對外顯子9b的作用最大(圖4i)。為了驗證靶向RAGE剪接的AON的體內相關性，給雄性C57bl6小鼠皮下注射AONm3779(每天1mg/kg)，持續7天。含有外顯子9b的RAGEmRNA剪接形式的表達在小鼠肺部中增加，而含有外顯子10的剪接形式在用AONm3779皮下處理一周后減少(圖4j)。為了驗證它們作為吸入治療劑的潛力，將活小鼠麻醉，然后將30μL在無RNA酶的水中的11μM體內嗎啉代寡聚物-AONm3779或非靶體內嗎啉代寡聚物對照(作為陰性對照)使用插管經由氣管或單獨使用水遞送到肺部。逆轉麻醉，并且在48小時后殺死小鼠。與單獨用水(沒有顯著影響)相比，用m3779進行氣管內處理導致含有外顯子10的RAGEmRNA剪接形式的肺表達顯著降低。含有外顯子9b的RAGEmRNA同種型的表達也增加。(圖4k)。當與單獨的媒介物(無菌水)相比時，氣管內遞送30ul的11uM2-0’Me-硫代磷酸酯AONm3779后觀察到含有外顯子10的RAGEmRNA剪接形式的表達的類似降低(圖4l)。另外，當與無菌水或靶向人RAGE的無效AON4105相比時，在用AONm3779處理小鼠后也觀察到循環可溶性RAGE的增加(圖4m)。實例5.使用靶向RAGE前體mRNA的反義寡核苷酸的組合調節RAGE的選擇性剪接本實例證明RAGE的選擇性剪接可使用靶向RAGE前體mRNA中不同的順式作用RNA元件的AON的組合來調節。外顯子的定義被認為是通過促進靶標保留或排除的多組分“跨外顯子”識別復合物的組裝來調控的。在AON3779與RAGE前體mRNA中的外顯子10結合以增加esRAGE的生成后，我們推測外顯子10中的其他調控靶標可能變得更關鍵，包括但不限于預測的剪接位點。而且，在AON3779的存在下，通過使用其他AON選擇性地靶向RAGE前體mRNA中外顯子10中的這些順式作用RNA元件，我們將防止從外顯子排除中的任何逃逸，并進一步調節RAGE剪接以優選生成esRAGE。預測RAGE外顯子10的二級結構含有通過中心鉸鏈區連接的兩個發夾環。推測使用AON3779靶向3'發夾中的外顯子增強子序列將增加備選5'發夾中靶標的重要性，包括外顯子10中的上游5'剪接位點。為了驗證該假說，將含有編碼人基因組RAGE的質粒的CHO細胞用AON3779(10nM)與靶向外顯子10中的5'(受體)預測剪接位點的其他AON(也是10nM)組合轉染。當與單獨的AON3779或對照亂序RNA處理的細胞相比時，該組合處理導致RAGEmRNA剪接形式的表達變化，使得一些組合，尤其是AON3779+3777、3779+3778顯著增加含有外顯子9b的RAGEmRNA同種型的表達，如通過實時RT-PCR所測量的(圖5a)。該組合還增加了通過ELISA在培養基中測量的esRAGE蛋白的產生(圖5b)。AON3997和AON3778的組合在低劑量(5nM+5nM)下也更有效。值得注意的是，AON3777和AON3778在10nM下本身幾乎沒有影響。在另一個實驗中，用AON3779與靶向外顯子10中的3'或5'剪接位點的其他AON組合轉染含有編碼人基因組RAGE的質粒的CHO細胞。一些組合也導致RAGEmRNA剪接形式的表達變化，使得一些組合，尤其是AON3779+3778、3779+3781和3779+3778+3781與單獨的AON3779或亂序對照處理的細胞相比顯著增加可溶性RAGE的表達，如通過ELISA所測量的(圖5c)。當使用AON93或AON87代替3779時這種增加是類似的，但與AON3779組合(以方框表示)是最強的并且總體上最一致。用也靶向外顯子10中的相鄰區域的AON的其他組合，尤其是AON3779+3782、3779+3784、3779+3785轉染人肺上皮細胞(A549)對含有外顯子9b的RAGE同種型的表達沒有超過單獨的AON3779的、顯著的影響(圖5d)。值得注意的是，這些AON也靶向5'發夾(類似于AON3779)和/或中心鉸鏈區，與組合有效的、靶向另一(3')發夾上的外顯子增強子的AON3777或3778不同。將含有編碼鼠類RAGE基因組序列的質粒的CHO細胞用AONm3779與靶向外顯子10中的3'或5'剪接位點的AON組合轉染。當與單獨的AONm3779相比時，這種組合處理導致RAGEmRNA剪接形式的表達變化，使得一些組合，尤其是AONm3779+m102顯著增加可溶性RAGE向細胞培養基中的分泌，如通過ELISA所測量的(圖5e)。當前第1頁12