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蛋白酶底物和包含蛋白酶切割序列的多肽的制作方法

文檔序號:29064532發布日期:2022-03-01 07:32
本公開提供蛋白酶底物、可被蛋白酶切割的肽序列、包含蛋白酶切割序列的多肽及其生產方法、包含包含蛋白酶切割序列的多肽的藥物組合物,以及通過切割包含在多肽中的蛋白酶切割序列釋放抗原結合結構域或配體的方法。
背景技術
蛋白酶是一種切割氨基酸殘基之間的肽鍵的酶。已知一些蛋白酶會根據蛋白質中特定氨基酸序列的存在來破壞特定的肽鍵。蛋白酶天然存在于所有生物體中,并參與各種生理反應,包括簡單的降解和高度調控的途徑。然而,許多病理狀態與蛋白酶的異常表達和/或活性有關。因此,不適當的蛋白水解可能在癌癥、心血管疾病、炎癥性疾病、神經退行性疾病、真核疾病、細菌性疾病、病毒性疾病和寄生蟲病的發生和發展中發揮關鍵作用。因此,需要鑒定蛋白酶的新底物并在各種治療、診斷和預防應用中使用底物。引用列表專利文獻[PTL1]WO2018/097307[PTL2]WO2018/097308技術實現要素:技術問題鑒于這些情況做出了本公開。本公開的目的是提供蛋白酶底物、可被蛋白酶切割的肽序列、包含蛋白酶切割序列的多肽及其生產方法、包含包含蛋白酶切割序列的多肽的藥物組合物,以及通過切割包含在多肽中的蛋白酶切割序列釋放抗原結合結構域或配體的方法。解決問題的方案作為實現上述目的的廣泛研究的結果,本公開的發明人發現了可用作蛋白酶底物的化合物,特別是可用作蛋白酶底物/可被蛋白酶切割的肽序列,并發現它們對疾病治療有用,包括施用包含可被蛋白酶切割的肽序列(簡稱為蛋白酶切割序列)的多肽,并且包含蛋白酶切割序列的多肽可用于生產用于治療疾病的藥物組合物。此外,本公開的發明人已經創造了包含蛋白酶切割序列的多肽及其生產方法,從而完成了本公開。本公開是基于這些發現,且具體包括以下舉例說明的實施方案:[1]蛋白酶底物,其蛋白酶切割比率高于包含SEQIDNO:1、2和3的任一項序列的蛋白酶底物的蛋白酶切割比率。[2]根據[1]所述的蛋白酶底物,其中所述底物比包含SEQIDNO:1、2和3的任一項序列的蛋白酶底物具有更高的被人uPA的切割比率。[3]根據[1]至[2]中任一項所述的蛋白酶底物,其中所述底物比包含SEQIDNO:1、2和3中任一項的序列的蛋白酶底物具有更高的被人MT-SP1的切割比率。[4]根據[1]至[3]中任一項所述的蛋白酶底物,其中所述底物比包含SEQIDNO:1、2和3中任一項的序列的蛋白酶底物具有更高的被小鼠uPA的切割比率。[5]根據[1]至[4]中任一項所述的蛋白酶底物,其中所述底物比包含SEQIDNO:1、2和3中任一項的序列的蛋白酶底物具有更高的被小鼠MT-SP1的切割比率。[6]根據[1]至[5]中任一項所述的蛋白酶底物,其中所述底物比包含SEQIDNO:1、2和3中任一項的序列的蛋白酶底物具有更高的被人uPA的切割比率與被人血清的切割比率的比值。[7]根據[1]至[6]中任一項所述的蛋白酶底物,其中所述底物比包含SEQIDNO:1、2和3中任一項的序列的蛋白酶底物具有更高的被人MT-SP1的切割比率與被人血清的切割比率的比值。[8]根據[1]至[7]中任一項所述的蛋白酶底物,其中所述底物比包含SEQIDNO:1、2和3中任一項的序列的蛋白酶底物具有更高的被小鼠uPA的切割比率與被人血清切割比率的比值。[9]根據[1]至[8]中任一項所述的蛋白酶底物,其中所述底物比包含SEQIDNO:1、2和3中任一項的序列的蛋白酶底物具有更高的被小鼠MT-SP1的切割比率與人血清的切割比率的比值。[10]根據[1]至[9]中任一項所述的蛋白酶底物,其中所述底物不被人血清切割。[11]根據[1]至[10]所述的蛋白酶底物,其中所述底物包含至少一種選自以下的序列:跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第15個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第6至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第1至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第11個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第10個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第3至第14個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第10個氨基酸的序列;和SEQIDNO:5-18003中任一項所示的序列。[12]蛋白酶底物,其包含至少一種選自以下的序列:跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第15個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第6至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第1至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第11個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第10個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第3至第14個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第10個氨基酸的序列;和SEQIDNO:5-18003中任一項所示的序列。[13]根據[12]所述的蛋白酶底物,其中所述蛋白酶是蛋白裂解酶(matriptase)和/或尿激酶。[14]根據[12]至[13]中任一項所述的蛋白酶底物,其中所述蛋白酶是選自人MT-SP1、小鼠MT-SP1、人uPA和小鼠uPA中的至少一種蛋白酶。[15]根據[12]至[14]中任一項所述的蛋白酶底物,其中所述底物比包含SEQIDNO:1、2和3中任一項的序列的蛋白酶底物具有更高的被所述蛋白酶的切割比率。[16]根據[12]至[15]中任一項所述的蛋白酶底物,其中所述底物比包含SEQIDNO:1、2和3中任一項的序列的蛋白酶底物具有更高的被人uPA的切割比率。[17]根據[12]至[16]中任一項所述的蛋白酶底物,其中所述底物比包含SEQIDNO:1、2和3中任一項的序列的蛋白酶底物具有更高的被人MT-SP1的切割比率。[18]根據[12]至[17]中任一項所述的蛋白酶底物,其中所述底物比包含SEQIDNO:1、2和3中任一項的序列的蛋白酶底物具有更高的被小鼠uPA的切割比率。[19]根據[12]至[18]中任一項所述的蛋白酶底物,其中所述底物比包含SEQIDNO:1、2和3中任一項的序列的蛋白酶底物具有更高的被小鼠MT-SP1的切割比率。[20]根據[12]至[19]中任一項所述的蛋白酶底物,其中所述底物比包含SEQIDNO:1、2和3中任一項的序列的蛋白酶底物具有更高的被人uPA的切割比率與人血清的切割比率的比值。[21]根據[12]至[20]中任一項所述的蛋白酶底物,其中所述底物比包含SEQIDNO:1、2和3中任一項的序列的蛋白酶底物具有更高的被人MT-SP1的切割比率與被人血清的切割比率的比值。[22]根據[12]至[21]中任一項所述的蛋白酶底物,其中所述底物比包含SEQIDNO:1、2和3中任一項的序列的蛋白酶底物具有更高的被小鼠uPA的切割比率與被人血清的切割比率的比值。[23]根據[12]至[22]中任一項所述的蛋白酶底物,其中所述底物比包含SEQIDNO:1、2和3中任一項的序列的蛋白酶底物具有更高的被小鼠MT-SP1的切割比率與被人血清的切割比率的比值。[24]根據[12]至[23]中任一項所述的蛋白酶底物,其中所述底物不被人血清切割。[25]選自以下的至少一種序列作為蛋白酶切割序列的用途:跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第15個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第6至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第1至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第11個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第10個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第3至第14個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第10個氨基酸的序列;和SEQIDNO:5-18003中任一項所示的序列。[26]多肽,其包含選自以下的至少一種序列:跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第15個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第6至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第1至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第11個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第10個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第3至第14個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第10個氨基酸的序列;和SEQIDNO:5-18003中任一項所示的序列。[27]根據[26]所述的多肽,其中選自以下的所述序列是可被蛋白酶切割的蛋白酶切割序列:跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第15個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第6至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第1至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第11個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第10個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第3至第14個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第10個氨基酸的序列;和SEQIDNO:5-18003中任一項所示的序列。[28]方法,用于生產根據[26]或[27]所述的多肽。[29]多核苷酸,其編碼根據[26]或[27]所述的多肽。[30]載體,其包含根據[29]所述的多核苷酸。[31]宿主細胞,其包含根據[29]所述的多核苷酸或根據[30]所述的載體。[32]用于生產根據[26]或[27]所述的多肽的方法,其中所述方法包括培養根據[31]所述的宿主細胞。[33]根據[32]所述用于生產多肽的方法,其中所述方法包括從培養物上清液中分離多肽。[A-1]根據[27]所述的多肽,其中所述多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分(carryingmoiety),其中所述攜帶部分具有抑制結構域,所述抑制結構域用于抑制抗原結合結構域的抗原結合活性。[A-2]根據[A-1]所述的多肽,其中在蛋白酶切割序列被蛋白酶切割的狀態下抑制結構域對抗原結合結構域的抗原結合活性的抑制弱于在蛋白酶切割序列未被切割的狀態下抑制結構域對抗原結合結構域的抗原結合活性的抑制。[A-3]根據[A-1]或[A-2]所述的多肽,其中所述抗原結合結構域在血液中的半衰期比未切割的多肽的短。[A-4]根據[A-1]至[A-3]中任一項所述的多肽,其中所述抗原結合結構域在血液中的半衰期比所述攜帶部分的短。[A-5]根據[A-1]至[A-4]中任一項所述的多肽,其中所述抗原結合結構域的分子量小于所述攜帶部分的分子量。[A-6]根據[A-1]至[A-5]中任一項所述的多肽,其中所述抗原結合結構域的分子量為60kDa或以下。[A-7]根據[A-1]至[A-6]中任一項所述的多肽,其中所述攜帶部分具有FcRn結合活性,并且所述抗原結合結構域不具有FcRn結合活性或具有比攜帶部分弱的FcRn結合活性。[A-8]根據[A-1]至[A-7]中任一項所述的多肽,其中所述抗原結合結構域可以從多肽釋放,并且其中所述抗原結合結構域在從多肽中釋放的狀態下的抗原結合活性比不從多肽中釋放的狀態下的抗原結合活性高。[A-9]根據[A-1]至[A-8]中任一項所述的多肽,其中所述抗原結合結構域的抗原結合活性通過所述抗原結合結構域與所述攜帶部分的抑制結構域締合而受到抑制。[A-10]根據[A-8]所述的多肽,其中所述抗原結合結構域由于蛋白酶切割蛋白酶切割序列而變得可從所述多肽釋放。[A-11]根據[A-9]所述的多肽,其中所述抗原結合結構域和所述攜帶部分的抑制結構域之間的締合通過蛋白酶切割蛋白酶切割序列而被破壞。[A-12]根據[A-1]至[A-11]中任一項所述的多肽,其中所述蛋白酶是蛋白裂解酶和/或尿激酶。[A-13]根據[A-1]至[A-11]中任一項所述的多肽,其中所述蛋白酶是選自人MT-SP1、小鼠MT-SP1、人uPA和小鼠uPA中的至少一種蛋白酶。[A-14]根據[A-1]至[A-13]中任一項所述的多肽,其中第一柔性接頭進一步連接至所述蛋白酶切割序列的一端。[A-15]根據[A-14]所述的多肽,其中所述第一柔性接頭是由甘氨酸-絲氨酸聚合物組成的柔性接頭。[A-16]根據[A-14]或[A-15]所述的多肽,其中第二柔性接頭進一步連接到所述蛋白酶切割序列的另一端。[A-17]根據[A-16]所述的多肽,其中所述第二柔性接頭是由甘氨酸-絲氨酸聚合物組成的柔性接頭。[A-18]根據[A-1]至[A-17]中任一項所述的多肽,其中所述抗原結合結構域包含或是單域抗體,并且其中所述攜帶部分的抑制結構域抑制單域抗體的抗原結合活性。[A-19]根據[A-18]所述的多肽,其中所述單域抗體是VHH,或通過其單域具有抗原結合活性的VH,或通過其單域具有抗原結合活性的VL。[A-20]根據[A-1]至[A-19]中任一項所述的多肽,其中所述抗原結合結構域包含單域抗體,其中所述攜帶部分的抑制結構域為VHH、抗體VH或抗體VL,并且其中單域抗體的抗原結合活性被VHH、抗體VH或抗體VL抑制。[A-21]根據[A-1]至[A-20]中任一項所述的多肽,其中所述抗原結合結構域包含單域抗體,其中所述攜帶部分的抑制結構域為VHH、抗體VH或抗體VL,并且其中單域抗體的抗原結合活性通過其與VHH、抗體VH或抗體VL的締合而受到抑制。[A-22]根據[A-18]至[A-21]中任一項所述的多肽,其中所述單域抗體是VHH,或通過其單域具有抗原結合活性的VH,其中攜帶部分的抑制結構域是抗體VL,并且其中VHH或通過其單域具有抗原結合活性的VH的抗原結合活性通過其與抗體VL的締合而受到抑制。[A-23]根據[A-18]至[A-22]中任一項所述的多肽,其中所述單域抗體是VHH,并且其中所述VHH在選自氨基酸位置37、44、45和47(均根據Kabat編號)的至少一個位置具有氨基酸取代。[A-24]根據[A-18]至[A-22]中任一項所述的多肽,其中所述單域抗體是VHH,并且其中所述VHH包含選自氨基酸37V、44G、45L和47W(均根據Kabat編號)的至少一個氨基酸。[A-25]根據[A-18]至[A-22]中任一項所述的多肽,其中所述單域抗體是VHH,并且其中所述VHH包含選自氨基酸取代F37V、Y37V、E44G、Q44G、R45L、H45L、G47W、F47W、L47W、T47W和S47W(均根據Kabat編號)的至少一個氨基酸取代。[A-26]根據[A-18]至[A-22]中任一項所述的多肽,其中所述單域抗體是VHH,并且其中所述VHH在選自37/44、37/45、37/47、44/45、44/47、45/47、37/44/45、37/44/47、37/45/47、44/45/47和37/44/45/47(均根據Kabat編號)的至少一組位置上具有氨基酸取代。[A-27]根據[A-18]至[A-22]中任一項所述的多肽,其中所述單域抗體是VHH,并且其中所述VHH包含選自37V/44G、37V/45L、37V/47W、44G/45L、44G/47W、45L/47W、37V/44G/45L、37V/44G/47W、37V/45L/47W、44G/45L/47W和37V/44G/45L/47W(均根據Kabat編號)的至少一組氨基酸。[A-28]根據[A-18]至[A-22]中任一項所述的多肽,其中所述單域抗體是VHH,并且其中所述VHH包含選自F37V/R45L、F37V/G47W、R45L/G47W和F37V/R45L/G47W(均根據Kabat編號)的至少一組氨基酸取代。[A-29]根據[A-18]至[A-21]中任一項所述的多肽,其中所述單域抗體是通過其單域具有抗原結合活性的VL,其中攜帶部分的抑制結構域是抗體VH,并且其中通過其單域具有抗原結合活性的VL的抗原結合活性通過其與抗體VH的締合而受到抑制。[A-30]根據[A-1]至[A-29]中任一項所述的多肽,其中所述攜帶部分具有FcRn結合區。[A-31]根據[A-1]至[A-30]中任一項所述的多肽,其中所述攜帶部分包含抗體恒定區。[A-32]根據[A-31]所述的多肽,其中所述攜帶部分的抗體恒定區通過或不通過接頭與抗原結合結構域融合。[A-33]根據[A-31]所述的多肽,其中所述攜帶部分包含抗體重鏈恒定區,并且其中所述抗體重鏈恒定區通過或不通過接頭與抗原結合結構域融合。[A-34]根據[A-31]所述的多肽,其中所述攜帶部分包含抗體輕鏈恒定區,并且其中所述抗體輕鏈恒定區通過或不通過接頭與抗原結合結構域融合。[A-35]根據[A-33]所述的多肽,其中所述攜帶部分的抗體重鏈恒定區的N-末端通過或不通過接頭與抗原結合結構域的C-末端融合,并且其中所述蛋白酶切割序列位于抗原結合結構域的序列內或比抗體重鏈恒定區的第122位氨基酸(根據EU編號)更靠近抗原結合結構域的一側。[A-36]根據[A-34]所述的多肽,其中所述攜帶部分的抗體輕鏈恒定區的N-末端通過或不通過接頭與抗原結合結構域的C-末端融合,并且其中所述蛋白酶切割序列位于抗原結合結構域的序列內或比抗體輕鏈恒定區的第113位氨基酸(根據Kabat編號)更靠近抗原結合結構域的一側。[A-37]根據[A-32]至[A-35]中任一項所述的多肽,其中所述攜帶部分的抗體恒定區的N-末端通過或不通過接頭與抗原結合結構域的C-末端融合,其中所述抗原結合結構域是單域抗體或由VH產生的VHH,并且其中所述蛋白酶切割序列位于抗體恒定區的序列內或比抗原結合結構域的單域抗體的第109位(根據Kabat編號)的氨基酸更靠近抗體恒定區的一側。[A-38]根據[A-32]所述的多肽,其中所述攜帶部分的抗體恒定區的N-末端通過或不通過接頭與抗原結合結構域的C-末端融合,并且其中所述蛋白酶切割序列位于抗原結合結構域和抗體恒定區之間的邊界附近。[A-39]根據[A-33]所述的多肽,其中所述攜帶部分的抗體重鏈恒定區的N-末端通過或不通過接頭與抗原結合結構域的C-末端融合,并且其中所述蛋白酶切割序列位于抗原結合結構域和抗體重鏈恒定區之間的邊界附近。[A-40]根據[A-34]所述的多肽,其中所述攜帶部分的抗體輕鏈恒定區的N-末端通過或不通過接頭與抗原結合結構域的C-末端融合,并且其中所述蛋白酶切割序列位于抗原結合結構域和抗體輕鏈恒定區之間的邊界附近。[A-41]根據[A-39]所述的多肽,其中所述抗原結合結構域是單域抗體或由VH產生的VHH,并且其中所述蛋白酶切割序列位于抗原結合結構域的單域抗體的第109位(根據Kabat編號)的氨基酸和抗體重鏈恒定區第122位(根據EU編號)的氨基酸之間。[A-42]根據[A-40]所述的多肽,其中所述抗原結合結構域是單域抗體或由VH產生的VHH,并且其中所述蛋白酶切割序列位于抗原結合結構域的單域抗體的第109位(根據Kabat編號)的氨基酸和抗體輕鏈恒定區第113位(根據Kabat編號)的氨基酸之間。[A-43]根據[A-39]所述的多肽,其中所述抗原結合結構域是由VL產生的單域抗體,并且其中所述蛋白酶切割序列位于抗原結合結構域的單域抗體的第104位(根據Kabat編號)的氨基酸和抗體重鏈恒定區第122位(根據EU編號)的氨基酸之間。[A-44]根據[A-40]所述的多肽,其中所述抗原結合結構域是由VL產生的單域抗體,并且其中所述蛋白酶切割序列位于抗原結合結構域的單域抗體的第109位(根據Kabat編號)的氨基酸和抗體輕鏈恒定區第113位(根據Kabat編號)的氨基酸之間。[A-45]根據[A-31]至[A-44]中任一項所述的多肽,其中所述多肽的抗體恒定區是IgG抗體恒定區。[A-46]根據[A-1]至[A-45]中任一項所述的多肽,其中所述多肽是IgG抗體樣分子。[A-47]根據[A-1]至[A-46]中任一項所述的多肽,其中在未釋放抗原結合結構域的狀態下,當使用生物層干涉測量法(BLI)(Octet)測定時未觀察到抗原結合結構域與抗原之間的結合。[A-48]根據[A-1]至[A-47]中任一項所述的多肽,其中第二抗原結合結構域進一步連接至所述抗原結合結構域。[A-49]根據[A-48]所述的多肽,其中所述第二抗原結合結構域具有與抗原結合結構域不同的抗原結合特異性。[A-50]根據[A-48]或[A-49]所述的多肽,其中所述第二抗原結合結構域包含第二單域抗體。[A-51]根據[A-50]所述的多肽,其中所述抗原結合結構域是單域抗體,其中所述第二抗原結合結構域是第二單域抗體,其中所述抗原結合結構域和所述第二抗原結合結構域可以從多肽中釋放出來,并且其中所述單域抗體和所述第二單域抗體在所述抗原結合結構域和所述第二抗原結合結構域被釋放的狀態下形成雙特異性抗原結合分子。[A-52]根據[A-1]至[A-51]中任一項所述的多肽,其中所述多肽還具有不同于所述抗原結合結構域的其它抗原結合結構域,并且其中所述其它抗原結合結構域的抗原結合活性也通過與所述多肽的攜帶部分連接而受到抑制。[A-53]根據[A-52]所述的多肽,其中所述其它抗原結合結構域和所述抗原結合結構域具有不同的抗原結合特異性。[A-54]藥物組合物,其包含根據[A-1]至[A-53]中任一項所述的多肽。[A-55]方法,其用于生產根據[A-1]至[A-53]中任一項所述的多肽。[A-56]多核苷酸,其編碼根據[A-1]至[A-53]中任一項所述的多肽。[A-57]載體,其包含根據[A-56]所述的多核苷酸。[A-58]宿主細胞,其包含根據[A-56]所述的多核苷酸或根據[A-57]所述的載體。[A-59]用于生產根據[A-1]至[A-53]中任一項所述的多肽的方法,其中所述方法包含培養根據[A-58]所述的宿主細胞。[A-60]根據[A-59]所述的用于生產肽的方法,其中所述方法包括從培養物上清液中分離多肽。[A-61]從多肽釋放抗原結合結構域的方法,其中所述方法包括用蛋白酶切割包含在包含抗原結合結構域的多肽中并且具有選自以下的至少一個序列的部分:跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第15個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第6至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第1至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第11個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第10個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第3至第14個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第10個氨基酸的序列;和SEQIDNO:5-18003中任一項所示的序列。[A-62]根據[A-61]所述的方法,其中所述多肽還包含攜帶部分,其中所述攜帶部分具有抑制結構域,所述抑制結構域用于抑制抗原結合結構域的抗原結合活性。[A-63]根據[A-62]所述的方法,其中在蛋白酶切割序列被蛋白酶切割的狀態下抑制結構域對抗原結合結構域的抗原結合活性的抑制弱于在蛋白酶切割序列未被切割的狀態下抑制結構域對抗原結合結構域的抗原結合活性的抑制。[A-64]根據[A-62]或[A-63]所述的方法,其中所述抗原結合結構域在血液中的半衰期比未切割的多肽的短。[A-65]根據[A-62]至[A-64]中任一項所述的方法,其中所述抗原結合結構域在血液中的半衰期比所述攜帶部分的短。[A-66]根據[A-62]至[A-65]中任一項所述的方法,其中所述抗原結合結構域的分子量小于所述攜帶部分的分子量。[A-67]根據[A-62]至[A-66]中任一項所述的方法,其中所述抗原結合結構域的分子量為60kDa或以下。[A-68]根據[A-62]至[A-67]中任一項所述的方法,其中所述攜帶部分具有FcRn結合活性,并且所述抗原結合結構域不具有FcRn結合活性或具有比所述攜帶部分弱的FcRn結合活性。[A-69]根據[A-62]至[A-68]中任一項所述的方法,其中所述抗原結合結構域在抗原結合結構域從多肽釋放的狀態下具有比它未從多肽中釋放出來的狀態下更高的抗原結合活性。[A-70]根據[A-62]至[A-69]中任一項所述的方法,其中所述抗原結合結構域的抗原結合活性通過抗原結合結構域與所述攜帶部分的抑制結構域的締合而受到抑制。[A-71]根據[A-70]所述的方法,其中所述抗原結合結構域和所述攜帶部分的抑制結構域之間的締合通過蛋白酶對蛋白酶切割序列的切割而被破壞。[A-72]根據[A-62]至[A-71]中任一項所述的方法,其中所述蛋白酶是蛋白裂解酶和/或尿激酶。[A-73]根據[A-62]至[A-71]中任一項所述的方法,其中所述蛋白酶是選自人MT-SP1、小鼠MT-SP1、人uPA和小鼠uPA的至少一種蛋白酶。[A-74]根據[A-62]至[A-73]中任一項所述的方法,其中第一柔性接頭進一步連接至蛋白酶切割序列的一端。[A-75]根據[A-74]所述的方法,其中所述第一柔性接頭是由甘氨酸-絲氨酸聚合物組成的柔性接頭。[A-76]根據[A-74]或[A-75]所述的方法,其中第二柔性接頭進一步連接至蛋白酶切割序列的另一端。[A-77]根據[A-76]所述的方法,其中所述第二柔性接頭是由甘氨酸-絲氨酸聚合物組成的柔性接頭。[A-78]根據[A-62]至[A-77]中任一項所述的方法,其中所述抗原結合結構域包含或是單域抗體,并且其中所述攜帶部分的抑制結構域抑制單域抗體的抗原結合活性。[A-79]根據[A-78]所述的方法,其中所述單域抗體是VHH、通過其單域具有抗原結合活性的VH或通過其單域具有抗原結合活性的VL。[A-80]根據[A-62]至[A-79]中任一項所述的方法,其中所述抗原結合結構域包含單域抗體,其中所述攜帶部分的抑制結構域是VHH、抗體VH或抗體VL,并且其中單域抗體的抗原結合活性被VHH、抗體VH或抗體VL抑制。[A-81]根據[A-62]至[A-80]中任一項所述的方法,其中所述抗原結合結構域包含單域抗體,其中所述攜帶部分的抑制結構域是VHH、抗體VH或抗體VL,并且其中所述單域抗體的抗原結合活性通過與VHH、抗體VH或抗體VL締合而受到抑制。[A-82]根據[A-78]至[A-81]中任一項所述的方法,其中所述單域抗體是VHH,或通過其單域具有抗原結合活性的VH,其中所述攜帶部分的抑制結構域是抗體VL,并且其中VHH或通過其單域具有抗原結合活性的VH的抗原結合活性通過其與抗體VL的締合而受到抑制。[A-83]根據[A-78]至[A-82]中任一項所述的方法,其中所述單域抗體是VHH,并且其中所述VHH在選自氨基酸位置37、44、45和47(均根據Kabat編號)的至少一個位置具有氨基酸取代。[A-84]根據[A-78]至[A-82]中任一項所述的方法,其中所述單域抗體是VHH,并且其中所述VHH包含選自氨基酸37V、44G、45L和47W(均根據Kabat編號)的至少一個氨基酸。[A-85]根據[A-78]至[A-82]中任一項所述的方法,其中所述單域抗體是VHH,并且其中所述VHH包含選自氨基酸取代F37V、Y37V、E44G、Q44G、R45L、H45L、G47W、F47W、L47W、T47W和S47W(均根據Kabat編號)的至少一個氨基酸取代。[A-86]根據[A-78]至[A-82]中任一項所述的方法,其中所述單域抗體是VHH,并且其中所述VHH在選自37/44,37/45,37/47,44/45,44/47,45/47,37/44/45,37/44/47,37/45/47,44/45/47,和37/44/45/47(均根據Kabat編號)的至少一組位置上具有氨基酸取代。[A-87]根據[A-78]至[A-82]中任一項所述的方法,其中所述單域抗體是VHH,并且其中所述VHH包含選自37V/44G,37V/45L,37V/47W,44G/45L,44G/47W,45L/47W,37V/44G/45L,37V/44G/47W,37V/45L/47W,44G/45L/47W和37V/44G/45L/47W(均根據Kabat編號)的至少一組氨基酸。[A-88]根據[A-78]至[A-82]中任一項所述的方法,其中所述單域抗體是VHH,并且其中所述VHH包含選自F37V/R45L,F37V/G47W,R45L/G47W和F37V/R45L/G47W(均根據Kabat編號)的至少一組氨基酸取代。[A-89]根據[A-78]至[A-81]中任一項所述的方法,其中所述單域抗體是通過其單域具有抗原結合活性的VL,其中所述攜帶部分的抑制結構域是抗體VH,并且其中通過其單域具有抗原結合活性的VL的抗原結合活性通過其與抗體VH的締合而受到抑制。[A-90]根據[A-62]至[A-89]中任一項所述的方法,其中所述攜帶部分具有FcRn結合區。[A-91]根據[A-62]至[A-90]中任一項所述的方法,其中所述攜帶部分包含抗體恒定區。[A-92]根據[A-91]所述的方法,其中所述攜帶部分的抗體恒定區通過或不通過接頭與抗原結合結構域融合。[A-93]根據[A-91]所述的方法,其中所述攜帶部分包含抗體重鏈恒定區,并且其中所述抗體重鏈恒定區通過或不通過接頭與抗原結合結構域融合。[A-94]根據[A-91]所述的方法,其中所述攜帶部分包含抗體輕鏈恒定區,并且其中所述抗體輕鏈恒定區通過或不通過接頭與抗原結合結構域融合。[A-95]根據[A-93]所述的方法,其中在多肽中,所述攜帶部分的抗體重鏈恒定區的N-末端通過或不通過接頭與抗原結合結構域的C-末端融合,并且其中所述蛋白酶切割序列位于抗原結合結構域的序列內或比抗體重鏈恒定區的第122位氨基酸(根據EU編號)更靠近抗原結合結構域的一側。[A-96]根據[A-94]所述的方法,其中在多肽中,所述攜帶部分的抗體輕鏈恒定區的N-末端通過或不通過接頭與抗原結合結構域的C-末端融合,并且其中所述蛋白酶切割序列位于抗原結合結構域的序列內或比抗體輕鏈恒定區的第113位氨基酸(根據Kabat編號)更靠近抗原結合結構域的一側。[A-97]根據[A-92]至[A-95]中任一項所述的方法,其中在多肽中,所述攜帶部分的抗體恒定區的N-末端通過或不通過接頭與抗原結合結構域的C-末端融合,其中所述抗原結合結構域是單域抗體或由VH產生的VHH,并且其中所述蛋白酶切割序列位于抗體恒定區的序列內或比抗原結合結構域的單域抗體的第109位氨基酸(根據Kabat編號)更靠近抗體恒定區的一側。[A-98]根據[A-92]所述的方法,其中在多肽中,所述攜帶部分的抗體恒定區的N-末端通過或不通過接頭與抗原結合結構域的C-末端融合,并且其中所述蛋白酶切割序列位于抗原結合結構域和抗體恒定區之間的邊界附近。[A-99]根據[A-93]所述的多肽,其中在多肽中,所述攜帶部分的抗體重鏈恒定區的N-末端通過或不通過接頭與抗原結合結構域的C-末端融合,并且其中所述蛋白酶切割序列位于抗原結合結構域和抗體重鏈恒定區之間的邊界附近。[A-100]根據[A-34]所述的方法,其中在多肽中,所述攜帶部分的抗體輕鏈恒定區的N-末端通過或不通過接頭與抗原結合結構域的C-末端融合,并且其中所述蛋白酶切割序列位于抗原結合結構域和抗體輕鏈恒定區之間的邊界附近。[A-101]根據[A-99]所述的方法,其中所述抗原結合結構域是單域抗體或由VH產生的VHH,并且其中所述蛋白酶切割序列位于抗原結合結構域的單域抗體的第109位氨基酸(根據Kabat編號)和抗體重鏈恒定區第122位氨基酸(根據EU編號)之間。[A-102]根據[A-100]所述的方法,其中所述抗原結合結構域是單域抗體或由VH產生的VHH,并且其中所述蛋白酶切割序列位于抗原結合結構域的單域抗體的第109位氨基酸(根據Kabat編號)和抗體輕鏈恒定區第113位氨基酸(根據Kabat編號)之間。[A-103]根據[A-99]所述的方法,其中所述抗原結合結構域是由VL產生的單域抗體,并且其中所述蛋白酶切割序列位于抗原結合結構域的單域抗體的第104位氨基酸(根據Kabat編號)和抗體重鏈恒定區第122位氨基酸(根據EU編號)之間。[A-104]根據[A-100]所述的方法,其中所述抗原結合結構域是由VL產生的單域抗體,并且其中所述蛋白酶切割序列位于抗原結合結構域的單域抗體的第109位氨基酸(根據Kabat編號)和抗體輕鏈恒定區第113位氨基酸(根據Kabat編號)之間。[A-105]根據[A-91]至[A-104]中任一項所述的方法,其中所述多肽的抗體恒定區是IgG抗體恒定區。[A-106]根據[A-62]至[A-105]中任一項所述的方法,其中所述多肽是IgG抗體樣分子。[A-107]根據[A-62]至[A-106]中任一項所述的方法,其中當使用生物層干涉測量法(BLI)(Octet)測定時,在未釋放抗原結合結構域的狀態下,未觀察到抗原結合結構域與抗原之間的結合。[A-108]根據[A-62]至[A-107]中任一項所述的方法,其中第二抗原結合結構域進一步連接至所述抗原結合結構域。[A-109]根據[A-108]所述的方法,其中所述第二抗原結合結構域具有與抗原結合結構域不同的抗原結合特異性。[A-110]根據[A-108]或[A-109]所述的方法,其中所述第二抗原結合結構域包含第二單域抗體。[A-111]根據[A-110]所述的方法,其中所述抗原結合結構域是單域抗體,其中所述第二抗原結合結構域是第二單域抗體,其中所述抗原結合結構域和所述第二抗原結合結構域可以從多肽中釋放出來,并且其中所述單域抗體和所述第二單域抗體在所述抗原結合結構域和所述第二抗原結合結構域被釋放的狀態下形成雙特異性抗原結合分子。[A-112]根據[A-62]至[A-111]中任一項所述的方法,其中所述多肽還具有不同于所述抗原結合結構域的其它抗原結合結構域,并且其中所述其它抗原結合結構域的抗原結合活性也通過與所述多肽的攜帶部分連接而受到抑制。[A-113]根據[A-112]所述的方法,其中所述其它抗原結合結構域和所述抗原結合結構域具有不同的抗原結合特異性。[B-1]根據[27]所述的多肽,其中所述多肽是能夠與配體結合的配體結合分子,其中所述配體結合分子在蛋白酶切割序列被切割的狀態下與配體的結合比在蛋白酶切割序列未被切割的狀態下配體結合分子與配體的結合弱。[B-2]根據[B-1]所述的配體結合分子,其中,所述配體在蛋白酶切割序列被切割的狀態下從所述配體結合分子釋放。[B-3]根據[B-1]至[B-2]中任一項所述的配體結合分子,其中,所述蛋白酶是蛋白裂解酶和/或尿激酶。[B-4]根據[B-1]至[B-3]中任一項所述的配體結合分子,其中所述蛋白酶是選自人MT-SP1、小鼠MT-SP1、人uPA、和小鼠uPA的至少一種蛋白酶。[B-5]根據[B-1]至[B-4]中任一項所述的配體結合分子,其中第一柔性接頭進一步連接至蛋白酶切割序列的一端。[B-6]根據[B-5]所述的配體結合分子,其中所述第一柔性接頭是由甘氨酸-絲氨酸聚合物組成的柔性接頭。[B-7]根據[B-5]或[B-6]所述的配體結合分子,其中第二柔性接頭進一步連接至蛋白酶切割序列的另一端。[B-8]根據[B-7]所述的配體結合分子,其中所述第二柔性接頭是由甘氨酸-絲氨酸聚合物組成的柔性接頭。[B-9]根據[B-1]至[B-8]中任一項所述的配體結合分子,其中所述配體結合分子包含抗體VH、抗體VL和抗體恒定區。[B-10]根據[B-9]所述的配體結合分子,其中所述蛋白酶切割序列,或蛋白酶切割序列和第一柔性接頭,或蛋白酶切割序列、第一柔性接頭和第二柔性接頭位于抗體恒定區內。[B-11]根據[B-10]所述的配體結合分子,其中蛋白酶切割序列,或蛋白酶切割序列和第一柔性接頭,或蛋白酶切割序列、第一柔性接頭和第二柔性接頭在跨越抗體重鏈恒定區的第118位氨基酸(根據EU編號)至抗體重鏈恒定區的第140位氨基酸(根據EU編號)的序列中的任意位置引入。[B-12]根據[B-10]所述的配體結合分子,其中蛋白酶切割序列,或蛋白酶切割序列和第一柔性接頭,或蛋白酶切割序列、第一柔性接頭和第二柔性接頭在跨越抗體輕鏈恒定區的第108位氨基酸(根據Kabat編號)至抗體輕鏈恒定區的第131位氨基酸(根據Kabat編號)的序列中的任意位置引入。[B-13]根據[B-9]所述的配體結合分子,其中蛋白酶切割序列,或蛋白酶切割序列和第一柔性接頭,或蛋白酶切割序列、第一柔性接頭和第二柔性接頭位于抗體VH或抗體VL內。[B-14]根據[B-13]所述的配體結合分子,其中蛋白酶切割序列,或蛋白酶切割序列和第一柔性接頭,或蛋白酶切割序列、第一柔性接頭和第二柔性接頭在選自由以下組成的組中的序列中的任意位置引入:抗體VH中的序列,其跨越:從第7位氨基酸(根據Kabat編號)到第16位氨基酸(根據Kabat編號);從第40位氨基酸(根據Kabat編號)到第47位氨基酸(根據Kabat編號);從第55位氨基酸(根據Kabat編號)到第69位氨基酸(根據Kabat編號);從第73位氨基酸(根據Kabat編號)到第79位氨基酸(根據Kabat編號);從第83位氨基酸(根據Kabat編號)到第89位氨基酸(根據Kabat編號);從第95位氨基酸(根據Kabat編號)到第99位氨基酸(根據Kabat編號);和從第101位氨基酸(根據Kabat編號)到第113位氨基酸(根據Kabat編號)。[B-15]根據[B-13]所述的配體結合分子,其中蛋白酶切割序列,或蛋白酶切割序列和第一柔性接頭,或蛋白酶切割序列、第一柔性接頭和第二柔性接頭在選自由以下組成的組中的序列中的任意位置引入:抗體VL中的序列,其跨越:從第7位氨基酸(根據Kabat編號)到第19位氨基酸(根據Kabat編號);從第39位氨基酸(根據Kabat編號)到第46位氨基酸(根據Kabat編號);從第49位氨基酸(根據Kabat編號)到第62位氨基酸(根據Kabat編號);和從第96位氨基酸(根據Kabat編號)到第107位氨基酸(根據Kabat編號)。[B-16]根據[B-9]所述的配體結合分子,其中蛋白酶切割序列,或蛋白酶切割序列和第一柔性接頭,或蛋白酶切割序列、第一柔性接頭和第二柔性接頭位于抗體恒定區和抗體VH之間的邊界附近和/或抗體恒定區和抗體VL之間的邊界附近。[B-17]根據[B-17]所述的配體結合分子,其中蛋白酶切割序列,或蛋白酶切割序列和第一柔性接頭,或蛋白酶切割序列、第一柔性接頭和第二柔性接頭在跨越抗體VH的第109位氨基酸(根據Kabat編號)至抗體重鏈恒定區的第122位氨基酸(根據EU編號)的序列中的任意位置引入。[B-18]根據[B-16]所述的配體結合分子,其中蛋白酶切割序列,或蛋白酶切割序列和第一柔性接頭,或蛋白酶切割序列、第一柔性接頭和第二柔性接頭在跨越抗體VL的第104位氨基酸(根據Kabat編號)至抗體輕鏈恒定區的第113位氨基酸(根據Kabat編號)的序列中的任意位置引入。[B-19]根據[B-9]至[B-18]中任一項所述的配體結合分子,其中,所述配體結合分子中的抗體VL與抗體VH締合,且其中所述締合通過蛋白酶切割蛋白酶切割序列而被破壞。[B-20]根據[B-1]至[B-19]中任一項所述的配體結合分子,其中所述配體是具有生物學活性的分子,并且其中所述配體的生物學活性通過配體結合分子與配體的結合而被抑制。[B-21]根據[B-1]至[B-20]中任一項所述的配體結合分子,其中,所述配體是細胞因子或趨化因子。[B-22]根據[B-1]至[B-20]中任一項所述的配體結合分子,其中所述配體是選自白介素、干擾素、造血因子、TNF超家族、趨化因子、細胞生長因子和TGF-β家族的配體。[B-23]根據[B-1]至[B-22]中任一項所述的配體結合分子,其中,所述配體結合分子是IgG抗體。[B-24]根據[B-1]至[B-23]中任一項所述的配體結合分子,其與配體結合。[B-25]根據[B-1]至[B-23]中任一項所述的配體結合分子,其與配體融合。[B-26]根據[B-25]所述的配體結合分子,在配體結合分子與配體融合的狀態下,其不進一步結合不同的配體。[B-27]根據[B-25]或[B-26]所述的配體結合分子,其中所述配體結合分子通過接頭與所述配體融合。[B-28]根據[B-27]所述的配體結合分子,其中所述接頭不包含蛋白酶切割序列。[B-29]復合物,其由配體和與所述配體結合的根據[B-1]至[B-23]中任一項所述的配體結合分子形成。[B-30]融合蛋白,其中配體與根據[B-1]至[B-23]中任一項所述的配體結合分子融合。[B-31]根據[B-30]所述的融合蛋白,其在配體結合分子與配體融合的狀態下不進一步與不同的配體結合。[B-32]根據[B-30]或[B-31]所述的融合蛋白,其中所述配體結合分子通過接頭與所述配體融合。[B-33]根據[B-32]所述的融合蛋白,其中所述接頭不包含蛋白酶切割序列。[B-34]根據[B-32]或[B-33]所述的融合蛋白,其中所述接頭是由甘氨酸-絲氨酸聚合物組成的接頭。[B-35]藥物組合物,其包含根據[B-1]至[B-28]中任一項所述的配體結合分子。[B-36]藥物組合物,其包含根據[B-1]至[B-24]中任一項所述的配體結合分子和配體。[B-37]藥物組合物,其包含根據[B-29]所述的復合物。[B-38]藥物組合物,其包含根據[B-30]至[B-34]中任一項所述的融合蛋白。[B-39]方法,其用于生產根據[B-1]至[B-28]中任一項所述的配體結合分子。[B-40]根據[B-39]所述的生產方法,其包括將蛋白酶切割序列引入能夠與配體結合的分子中。[B-41]用于生產根據[B-30]至[B-34]中任一項所述的融合蛋白的方法,其中所述方法包括使具有蛋白酶切割序列的配體結合分子與其配體融合。[B-42]多核苷酸,其編碼根據[B-1]至[B-28]中任一項所述的配體結合分子。[B-43]載體,其包含根據[B-42]所述的多核苷酸。[B-44]宿主細胞,其包含根據[B-42]所述的多核苷酸或根據[B-43]所述的載體。[B-45]用于生產根據[B-1]至[B-28]中任一項所述的配體結合分子的方法,其中所述方法包含培養根據[B-44]所述的宿主細胞。[B-46]根據[B-45]所述的用于生產配體結合分子的方法,其中所述方法包括從培養物上清液中分離多肽。[B-47]多核苷酸,其編碼根據[B-30]至[B-34]中任一項所述的融合蛋白。[B-48]載體,其包含根據[B-46]所述的多核苷酸。[B-49]宿主細胞,其包含根據[B-46]所述的多核苷酸或根據[B-48]所述的載體。[B-50]用于生產根據[B-30]至[B-34]中任一項所述的融合蛋白的方法,其中所述方法包含培養根據[B-49]所述的宿主細胞。[B-51]根據[B-50]所述的用于生產融合蛋白的方法,其中所述方法包括從培養物上清液中分離多肽。[B-52]釋放與配體結合分子結合的配體的方法,其中所述方法包括通過蛋白酶切割配體結合分子中包含的能夠與配體結合的部分,其中所述部分具有選自以下的至少一個序列:跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第15個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第6至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第1至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第11個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第10個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第3至第14個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第10個氨基酸的序列;和SEQIDNO:5-18003中任一項所示的序列。[B-53]從配體和配體結合分子的融合蛋白中釋放配體的方法,其中所述方法包括通過蛋白酶切割融合蛋白中的配體結合分子中包含的部分,其中所述部分具有選自以下的至少一個序列:跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第15個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第6至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第1至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第11個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第10個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第3至第14個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第10個氨基酸的序列;和SEQIDNO:5-18003中任一項所示的序列。[B-54]根據[B-53]所述的方法,其中所述配體結合分子通過接頭與所述配體融合。[B-55]根據[B-54]所述的方法,其中所述接頭不包含蛋白酶切割序列。[B-56]根據[B-54]或[B-55]所述的方法,其中所述接頭是由甘氨酸-絲氨酸聚合物組成的接頭。[B-57]根據[B-53]至[B-56]中任一項所述的方法,其中在配體結合分子與配體融合的狀態下,所述配體結合分子不進一步與不同的配體結合。[B-58]根據[B-52]至[B-57]中任一項所述的方法,其中所述配體結合分子在蛋白酶切割序列被切割的狀態下與配體的結合比在蛋白酶切割序列未被切割的狀態下配體結合分子與配體的結合弱。[B-59]根據[B-52]至[B-58]中任一項所述的方法,其中所述蛋白酶是蛋白裂解酶和/或尿激酶。[B-60]根據[B-52]至[B-59]中任一項所述的方法,其中所述蛋白酶是選自人MT-SP1、小鼠MT-SP1、人uPA和小鼠uPA的至少一種蛋白酶。[B-61]根據[B-52]至[B-60]中任一項所述的方法,其中第一柔性接頭進一步連接至蛋白酶切割序列的一端。[B-62]根據[B-61]所述的方法,其中所述第一柔性接頭是由甘氨酸-絲氨酸聚合物組成的柔性接頭。[B-63]根據[B-61]或[B-62]所述的方法,其中第二柔性接頭進一步連接至蛋白酶切割序列的另一端。[B-64]根據[B-63]所述的方法,其中所述第二柔性接頭是由甘氨酸-絲氨酸聚合物組成的柔性接頭。[B-65]根據[B-52]至[B-64]中任一項所述的方法,其中所述配體結合分子包含抗體VH、抗體VL和抗體恒定區。[B-66]根據[B-65]所述的方法,其中所述蛋白酶切割序列,或蛋白酶切割序列和第一柔性接頭,或蛋白酶切割序列、第一柔性接頭和第二柔性接頭位于抗體恒定區內。[B-67]根據[B-66]所述的方法,其中蛋白酶切割序列,或蛋白酶切割序列和第一柔性接頭,或蛋白酶切割序列、第一柔性接頭和第二柔性接頭在跨越抗體重鏈恒定區的第118位氨基酸(根據EU編號)至抗體重鏈恒定區的第140位氨基酸(根據EU編號)的序列中的任意位置引入。[B-68]根據[B-66]所述的方法,其中蛋白酶切割序列,或蛋白酶切割序列和第一柔性接頭,或蛋白酶切割序列、第一柔性接頭和第二柔性接頭在跨越抗體輕鏈恒定區的第108位氨基酸(根據Kabat編號)至抗體輕鏈恒定區的第131位氨基酸(根據Kabat編號)的序列中的任意位置引入。[B-69]根據[B-65]所述的方法,其中蛋白酶切割序列,或蛋白酶切割序列和第一柔性接頭,或蛋白酶切割序列、第一柔性接頭和第二柔性接頭位于抗體VH或抗體VL內。[B-70]根據[B-69]所述的方法,其中蛋白酶切割序列,或蛋白酶切割序列和第一柔性接頭,或蛋白酶切割序列、第一柔性接頭和第二柔性接頭在選自由以下組成的組中的序列中的任意位置引入:抗體VH中的序列,其跨越:從第7位氨基酸(根據Kabat編號)到第16位氨基酸(根據Kabat編號);從第40位氨基酸(根據Kabat編號)到第47位氨基酸(根據Kabat編號);從第55位氨基酸(根據Kabat編號)到第69位氨基酸(根據Kabat編號);從第73位氨基酸(根據Kabat編號)到第79位氨基酸(根據Kabat編號);從第83位氨基酸(根據Kabat編號)到第89位氨基酸(根據Kabat編號);從第95位氨基酸(根據Kabat編號)到第99位氨基酸(根據Kabat編號);和從第101位氨基酸(根據Kabat編號)到第113位氨基酸(根據Kabat編號)。[B-71]根據[B-69]所述的方法,其中蛋白酶切割序列,或蛋白酶切割序列和第一柔性接頭,或蛋白酶切割序列、第一柔性接頭和第二柔性接頭在選自由以下組成的組中的序列中的任意位置引入:抗體VL中的序列,其跨越:從第7位氨基酸(根據Kabat編號)到第19位氨基酸(根據Kabat編號);從第39位氨基酸(根據Kabat編號)到第46位氨基酸(根據Kabat編號);從第49位氨基酸(根據Kabat編號)到第62位氨基酸(根據Kabat編號);和從第96位氨基酸(根據Kabat編號)到第107位氨基酸(根據Kabat編號)。[B-72]根據[B-65]所述的方法,其中蛋白酶切割序列,或蛋白酶切割序列和第一柔性接頭,或蛋白酶切割序列、第一柔性接頭和第二柔性接頭位于抗體恒定區和抗體VH之間的邊界附近和/或抗體恒定區和抗體VL之間的邊界附近。[B-73]根據[B-73]所述的方法,其中蛋白酶切割序列,或蛋白酶切割序列和第一柔性接頭,或蛋白酶切割序列、第一柔性接頭和第二柔性接頭在跨越抗體VH的第109位氨基酸(根據Kabat編號)至抗體重鏈恒定區的第122位氨基酸(根據EU編號)的序列中的任意位置引入。[B-74]根據[B-72]所述的方法,其中蛋白酶切割序列,或蛋白酶切割序列和第一柔性接頭,或蛋白酶切割序列、第一柔性接頭和第二柔性接頭在跨越抗體VL的第104位氨基酸(根據Kabat編號)至抗體輕鏈恒定區的第113位氨基酸(根據Kabat編號)的序列中的任意位置引入。[B-75]根據[B-65]至[B-74]中任一項所述的方法,其中,所述配體結合分子中的抗體VL與抗體VH締合,且其中所述締合通過蛋白酶切割蛋白酶切割序列而被破壞。[B-76]根據[B-52]至[B-75]中任一項所述的方法,其中所述配體是具有生物學活性的分子,并且其中所述配體的生物學活性通過配體結合分子與配體的結合而被抑制。[B-77]根據[B-52]至[B-76]中任一項所述的方法,其中,所述配體是細胞因子或趨化因子。[B-78]根據[B-52]至[B-76]中任一項所述的方法,其中所述配體是選自白介素、干擾素、造血因子、TNF超家族、趨化因子、細胞生長因子和TGF-β家族的配體。[B-79]根據[B-52]至[B-78]中任一項所述的方法,其中,所述配體結合分子是IgG抗體。[C-1]根據[27]所述的多肽,其中所述多肽是能夠結合配體的配體結合分子,其中所述配體結合分子包含單域抗體,其中所述單域抗體能夠結合配體并被引入至少一個蛋白酶切割序列,并且其中與在蛋白酶切割序列未被切割的狀態下配體結合分子與配體的結合與配體的結合相比,在蛋白酶切割序列被切割的狀態下配體結合分子與配體的結合減弱。[C-2]根據[C-1]所述的配體結合分子,其中,所述配體在蛋白酶切割序列被切割的狀態下從所述配體結合分子釋放。[C-3]根據[C-1]或[C-2]所述的配體結合分子,其中,所述蛋白酶是蛋白裂解酶和/或尿激酶。[C-4]根據[C-1]至[C-3]中任一項所述的配體結合分子,其中所述蛋白酶是選自人MT-SP1、小鼠MT-SP1、人uPA、和小鼠uPA的至少一種蛋白酶。[C-5]根據[C-1]至[C-4]中任一項所述的配體結合分子,其中第一柔性接頭進一步連接至蛋白酶切割序列的一端。[C-6]根據[C-5]所述的配體結合分子,其中所述第一柔性接頭是由甘氨酸-絲氨酸聚合物組成的柔性接頭。[C-7]根據[C-5]或[C-6]所述的配體結合分子,其中第二柔性接頭進一步連接至蛋白酶切割序列的另一端。[C-8]根據[C-7]所述的配體結合分子,其中所述第二柔性接頭是由甘氨酸-絲氨酸聚合物組成的柔性接頭。[C-9]根據[C-1]至[C-8]中任一項所述的配體結合分子,其中單域抗體是VHH、單域VH抗體或單域VL抗體。[C-10]根據[C-9]所述的配體結合分子,其中單域抗體是VHH或單域VH抗體,并且其中切割位點,或蛋白酶切割序列,或蛋白酶切割序列和第一柔性接頭,或蛋白酶切割序列、第一柔性接頭和第二柔性接頭,被引入在一個或多個位置處,所述一個或多個位置包含在一個或多個序列中,所述一個或多個序列選自單域抗體的以下序列:跨越單域抗體的第7位氨基酸(根據Kabat編號)到第17位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第12位氨基酸(根據Kabat編號)到第17位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第31位氨基酸(根據Kabat編號)到第35b位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第40位氨基酸(根據Kabat編號)到第47位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第50位氨基酸(根據Kabat編號)到第65位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第55位氨基酸(根據Kabat編號)到第69位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第73位氨基酸(根據Kabat編號)到第79位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第83位氨基酸(根據Kabat編號)到第89位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第95位氨基酸(根據Kabat編號)到第99位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第95位氨基酸(根據Kabat編號)到第102位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;和跨越單域抗體的第101位氨基酸(根據Kabat編號)到第113位氨基酸(根據Kabat編號)的序列。[C-11]根據[C-9]所述的配體結合分子,其中單域抗體是單域VL抗體,并且其中切割位點,或蛋白酶切割序列,或蛋白酶切割序列和第一柔性接頭,或蛋白酶切割序列、第一柔性接頭和第二柔性接頭,被引入在一個或多個位置處,所述一個或多個位置包含在一個或多個序列中,所述一個或多個序列選自所述單域抗體的以下序列:跨越單域抗體的第7位氨基酸(根據Kabat編號)到第19位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第24位氨基酸(根據Kabat編號)到第34位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第39位氨基酸(根據Kabat編號)到第46位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第49位氨基酸(根據Kabat編號)到第62位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第50位氨基酸(根據Kabat編號)到第56位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第89位氨基酸(根據Kabat編號)到第97位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;和跨越單域抗體的第96位氨基酸(根據Kabat編號)到第107位氨基酸(根據Kabat編號)的序列。[C-12]根據[C-1]至[C-11]中任一項所述的配體結合分子,其中所述配體是具有生物學活性的分子,并且其中所述配體的生物學活性通過單域抗體與配體的結合而被抑制。[C-13]根據[C-1]至[C-12]中任一項所述的配體結合分子,其中所述配體是具有生物學活性的分子,并且其中所述單域抗體對所述配體具有中和活性。[C-14]根據[C-1]至[C-13]中任一項所述的配體結合分子,其中,所述配體結合分子僅包含包含切割位點或蛋白酶切割序列的單域抗體。[C-15]根據[C-1]至[C-14]中任一項所述的配體結合分子,其中所述配體結合分子還包含抗體Fc區。[C-16]根據[C-1]至[C-15]中任一項所述的配體結合分子,其中所述配體結合分子包含從N-末端到C-末端方向由單域抗體-抗體Fc區組成的一系列肽鏈。[C-17]根據[C-1]至[C-15]所述的配體結合分子,其中所述配體結合分子是二聚體,所述二聚體包含由單域抗體-抗體鉸鏈區-抗體Fc區組成的兩個系列的肽鏈。[C-18]根據[C-15]至[C-17]所述的配體結合分子,其中所述抗體Fc區是包含選自SEQIDNO:18004-18007所示氨基酸序列中的一個序列的Fc區,或通過修飾這些Fc區獲得的Fc區變體。[C-19]根據[C-1]至[C-18]中任一項所述的配體結合分子,其中,所述配體是細胞因子或趨化因子。[C-20]根據[C-1]至[C-19]中任一項所述的配體結合分子,其中所述配體是選自白介素、干擾素、造血因子、TNF超家族、趨化因子、細胞生長因子和TGF-β家族的配體。[C-21]根據[C-1]至[C-20]中任一項所述的配體結合分子,其與配體結合。[C-22]根據[C-1]至[C-20]中任一項所述的配體結合分子,其與配體融合。[C-23]根據[C-22]所述的配體結合分子,其中包含在配體結合分子中的單域抗體在配體結合分子與配體融合的狀態下不進一步結合至不同的配體。[C-24]根據[C-22]或[C-23]所述的配體結合分子,其中所述配體結合分子通過接頭與所述配體融合。[C-25]根據[C-24]所述的配體結合分子,其中所述接頭不包含蛋白酶切割序列。[C-26]復合物,其由配體和根據[C-1]至[C-20]中任一項所述的配體結合分子形成。[C-27]融合蛋白,其中配體與根據[C-1]至[C-20]中任一項所述的配體結合分子融合。[C-28]根據[C-27]所述的融合蛋白,其中在配體結合分子與配體融合的狀態下,單域抗體不進一步與不同的配體結合。[C-29]根據[C-27]或[C-28]所述的融合蛋白,其中所述配體結合分子通過接頭與所述配體融合。[C-30]根據[C-29]所述的融合蛋白,其中所述接頭不包含蛋白酶切割序列。[C-31]根據[C-29]或[C-30]所述的融合蛋白,其中配體、接頭和配體結合分子在從N-末端到C-端的方向上以該順序融合。[C-32]藥物組合物,其包含根據[C-1]至[C-22]中任一項所述的配體結合分子。[C-33]藥物組合物,其包含根據[C-1]至[C-21]中任一項所述的配體結合分子和配體。[C-34]藥物組合物,其包含根據[C-26]所述的復合物。[C-35]藥物組合物,其包含根據[C-27]至[C-31]中任一項所述的融合蛋白。[C-36]方法,其用于生產根據[C-1]至[C-20]中任一項所述的配體結合分子。[C-37]根據[C-36]所述的生產方法,其中,所述方法包括將蛋白酶切割序列引入在包含單域抗體的配體結合分子中的單域抗體中。[C-38]用于生產根據[C-27]至[C-31]中任一項所述的融合蛋白的方法,其中所述方法包括使配體結合分子與能夠與單域抗體結合的配體融合,所述配體結合分子含有引入了蛋白酶切割序列的單域抗體。[C-39]多核苷酸,其編碼根據[C-1]至[C-20]中任一項所述的配體結合分子。[C-40]載體,其包含根據[C-39]所述的多核苷酸。[C-41]宿主細胞,其包含根據[C-39]所述的多核苷酸或根據[C-40]所述的載體。[C-42]用于生產根據[C-1]至[C-20]中任一項所述的配體結合分子的方法,其中所述方法包含培養根據[C-41]所述的宿主細胞。[C-43]根據[C-42]所述的用于生產配體結合分子的方法,其中所述方法包括從培養物上清液中分離多肽。[C-44]多核苷酸,其編碼根據[C-27]至[C-31]中任一項所述的融合蛋白。[C-45]載體,其包含根據[C-43]所述的多核苷酸。[C-46]宿主細胞,其包含根據[C-43]所述的多核苷酸或根據[C-45]所述的載體。[C-47]用于生產根據[C-27]至[C-31]中任一項所述的融合蛋白的方法,其中所述方法包含培養根據[C-46]所述的宿主細胞。[C-48]根據[C-47]所述的用于生產配體結合分子的方法,其中所述方法包括從培養物上清液中分離多肽。[C-49]釋放與配體結合分子結合的配體的方法,其中所述方法包括通過蛋白酶切割配體結合分子中單域抗體包含的能夠與配體結合的部分,其中所述部分具有選自以下的至少一個序列:跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第15個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第6至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第1至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第11個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第10個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第3至第14個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第10個氨基酸的序列;和SEQIDNO:5-18003中任一項所示的序列。[C-50]從配體和配體結合分子的融合蛋白中釋放配體的方法,其中所述方法包括通過蛋白酶切割配體結合分子中單域抗體包含的能夠與配體結合的部分,其中所述部分具有選自以下的至少一個序列:跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第15個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第6至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第1至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第11個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第10個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第3至第14個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第10個氨基酸的序列;和SEQIDNO:5-18003中任一項所示的序列。[C-51]根據[C-50]所述的方法,其中所述配體結合分子通過接頭與所述配體融合。[C-52]根據[C-51]所述的方法,其中所述接頭不包含蛋白酶切割序列。[C-53]根據[C-51]或[C-52]所述的方法,其中所述接頭是由甘氨酸-絲氨酸聚合物組成的接頭。[C-54]根據[C-50]至[C-53]中任一項所述的方法,其中在配體結合分子與配體融合的狀態下,所述配體結合分子不進一步與不同的配體結合。[C-55]根據[C-49]至[C-54]中任一項所述的方法,其中與在蛋白酶切割序列未被切割的狀態下配體結合分子與配體的結合相比,所述配體結合分子在蛋白酶切割序列被切割的狀態下與配體的結合減弱。[C-56]根據[C-55]所述的方法,其中,所述配體在蛋白酶切割序列被切割的狀態下從所述配體結合分子釋放。[C-57]根據[C-55]或[C-56]所述的方法,其中,所述蛋白酶是蛋白裂解酶和/或尿激酶。[C-58]根據[C-55]至[C-57]中任一項所述的方法,其中所述蛋白酶是選自人MT-SP1、小鼠MT-SP1、人uPA和小鼠uPA的至少一種蛋白酶。[C-59]根據[C-55]至[C-58]中任一項所述的方法,其中第一柔性接頭進一步連接至蛋白酶切割序列的一端。[C-60]根據[C-59]所述的方法,其中所述第一柔性接頭是由甘氨酸-絲氨酸聚合物組成的柔性接頭。[C-61]根據[C-59]或[C-60]所述的方法,其中第二柔性接頭進一步連接至蛋白酶切割序列的另一端。[C-62]根據[C-61]所述的方法,其中所述第二柔性接頭是由甘氨酸-絲氨酸聚合物組成的柔性接頭。[C-63]根據[C-55]至[C-62]中任一項所述的方法,其中單域抗體是VHH、單域VH抗體或單域VL抗體。[C-64]根據[C-63]所述的方法,其中單域抗體是VHH或單域VH抗體,并且其中切割位點,或蛋白酶切割序列,或蛋白酶切割序列和第一柔性接頭,或蛋白酶切割序列、第一柔性接頭和第二柔性接頭,被引入在一個或多個位置處,所述一個或多個位置包含在一個或多個序列中,所述一個或多個序列選自單域抗體的以下序列:跨越單域抗體的第7位氨基酸(根據Kabat編號)到第17位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第12位氨基酸(根據Kabat編號)到第17位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第31位氨基酸(根據Kabat編號)到第35b位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第40位氨基酸(根據Kabat編號)到第47位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第50位氨基酸(根據Kabat編號)到第65位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第55位氨基酸(根據Kabat編號)到第69位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第73位氨基酸(根據Kabat編號)到第79位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第83位氨基酸(根據Kabat編號)到第89位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第95位氨基酸(根據Kabat編號)到第99位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第95位氨基酸(根據Kabat編號)到第102位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;和跨越單域抗體的第101位氨基酸(根據Kabat編號)到第113位氨基酸(根據Kabat編號)的序列。[C-65]根據[C-63]所述的方法,其中單域抗體是單域VL抗體,并且其中切割位點,或蛋白酶切割序列,或蛋白酶切割序列和第一柔性接頭,或蛋白酶切割序列、第一柔性接頭和第二柔性接頭,被引入在一個或多個位置處,所述一個或多個位置包含在一個或多個序列中,所述一個或多個序列選自單域抗體的以下序列:跨越單域抗體的第7位氨基酸(根據Kabat編號)到第19位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第24位氨基酸(根據Kabat編號)到第34位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第39位氨基酸(根據Kabat編號)到第46位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第49位氨基酸(根據Kabat編號)到第62位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第50位氨基酸(根據Kabat編號)到第56位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;跨越單域抗體的第89位氨基酸(根據Kabat編號)到第97位氨基酸(根據Kabat編號)的序列;和跨越單域抗體的第96位氨基酸(根據Kabat編號)到第107位氨基酸(根據Kabat編號)的序列。[C-66]根據[C-55]至[C-65]中任一項所述的方法,其中所述配體是具有生物學活性的分子,并且其中所述配體的生物學活性通過單域抗體與配體的結合而被抑制。[C-67]根據[C-55]至[C-66]中任一項所述的方法,其中所述配體是具有生物學活性的分子,并且其中所述單域抗體對所述配體具有中和活性。[C-68]根據[C-55]至[C-67]中任一項所述的方法,其中,所述配體結合分子僅包含包含切割位點或蛋白酶切割序列的單域抗體。[C-69]根據[C-55]至[C-68]中任一項所述的方法,其中所述配體結合分子還包含抗體Fc區。[C-70]根據[C-55]至[C-69]中任一項所述的方法,其中所述配體結合分子包含從N-末端到C-末端方向由單域抗體-抗體Fc區組成的一系列肽鏈。[C-71]根據[C-55]至[C-69]所述的方法,其中所述配體結合分子是二聚體,所述二聚體包含由單域抗體-抗體鉸鏈區-抗體Fc區組成的兩個系列的肽鏈。[C-72]根據[C-69]至[C-71]所述的方法,其中所述抗體Fc區是包含選自SEQIDNO:18004-18007所示氨基酸序列中的一個序列的Fc區,或通過修飾這些Fc區獲得的Fc區變體。[C-73]根據[C-55]至[C-72]中任一項所述的方法,其中,所述配體是細胞因子或趨化因子。[C-74]根據[C-55]至[C-73]中任一項所述的方法,其中所述配體是選自白介素、干擾素、造血因子、TNF超家族、趨化因子、細胞生長因子和TGF-β家族的配體。附圖說明[圖1]圖1說明了本公開的包含蛋白酶切割序列的多肽的實例。在該圖中,多肽含有抗原結合結構域和攜帶部分。(A)多肽半衰期長,在抗原結合結構域和攜帶部分連接的狀態下不與抗原結合。(B)當抗原結合結構域通過例如蛋白酶切割序列的切割而被釋放并與抗原結合時,所釋放的抗原結合結構域具有短的半衰期。[圖2]圖2說明了生產圖1所示多肽的方法的實施方案。在該實施方案中,目標多肽是IgG樣分子。(A)獲得與靶抗原結合的單域抗體。(B)單域抗體代替IgG抗體的VH與VL締合,從而抑制了單域抗體的抗原結合活性。(C)蛋白酶切割序列被引入到IgG抗體樣分子的前體中,該分子被引入單域抗體。[圖3]圖3說明了本公開的包含蛋白酶切割序列的多肽的實例。該圖中,多肽為IgG抗體樣分子,對應于IgG抗體兩個可變區的部分分別提供有抗原結合結構域。兩個抗原結合結構域可具有相似或不同的抗原結合特異性。[圖4]圖4說明了本公開的包含蛋白酶切割序列的多肽的實例。在該圖中,連接的抗原結合結構域和第二抗原結合結構域包含在多肽中。在該實例中,釋放的抗原結合結構域和第二抗原結合結構域形成雙特異性抗原結合分子。(A)說明了未釋放狀態的多肽??乖Y合結構域的抗原結合活性被抑制。(B)圖示了由抗原結合結構域和第二抗原結合結構域形成的雙特異性抗原結合分子的釋放。(C)例如針對T細胞表面抗原和腫瘤表面抗原的雙特異性抗原結合分子被圖示為釋放的雙特異性抗原結合分子的實例。[圖5]圖5說明了本公開的包含蛋白酶切割序列的多肽的實例。在該圖中,多肽是配體和抗配體抗體的融合蛋白。(A)蛋白酶切割序列包含在抗配體抗體中,并且配體在蛋白酶切割序列未被切割的狀態下與抗配體抗體結合。(B)在蛋白酶切割序列被切割的狀態下,配體和抗配體抗體的一部分從多肽中釋放,并且配體變得能夠與受體結合。[圖6]圖6說明了本公開的包含蛋白酶切割序列的多肽的實例。在該圖中,多肽是抗配體抗體。(A)蛋白酶切割序列包含在抗配體抗體中,并且抗配體抗體能夠在蛋白酶切割序列未被切割的狀態下與配體結合。(B)在蛋白酶切割序列被切割的狀態下,抗配體抗體的配體結合活性減弱,并且配體從抗配體抗體解離并變得能夠與受體結合。[圖7]圖7說明了本公開的包含蛋白酶切割序列的多肽的實例。在該圖中,多肽是包含蛋白酶切割序列的單域抗體。單域抗體在包含在單域抗體中的蛋白酶切割序列未被切割的狀態下能夠與配體結合,而在蛋白酶切割序列被切割的狀態下,單域抗體被切割并且不能與配體結合,配體被釋放。[圖8]圖8說明了本公開的包含蛋白酶切割序列的多肽的實例。在該圖中,多肽是由配體和包含蛋白酶切割序列的單域抗體形成的融合蛋白。融合蛋白中的單域抗體在單域抗體中包含的蛋白酶切割序列未被切割的狀態下能夠與融合蛋白中的配體結合,而在蛋白酶切割序列被切割的狀態下,單域抗體被切割并且不能與配體結合,并且包含配體的融合蛋白的一部分被釋放。[圖9]圖9說明了本公開的包含蛋白酶切割序列的多肽的實例。在該圖中,多肽是二聚體蛋白,其包含含蛋白酶切割序列的單域抗體-抗體鉸鏈區-抗體Fc區。[圖10]圖10說明了本公開的包含蛋白酶切割序列的多肽的實例。在該圖中,多肽是配體和二聚體蛋白的融合蛋白,所述二聚體蛋白包含含有蛋白酶切割序列的單域抗體-抗體鉸鏈區-抗體Fc區。[圖11]圖11示出了經蛋白酶處理和未經蛋白酶處理的配體結合分子的SDS-PAGE結果。雖然不包含蛋白酶切割序列的對照分子無論是用蛋白酶處理還是未處理都在相同位置顯示條帶(泳道12和13),但引入相應蛋白酶切割序列的配體結合分子顯示僅在蛋白酶處理后產生的新條帶,表明含有引入各自蛋白酶切割序列的單域抗體的配體結合分子被蛋白酶處理切割。[圖12]圖12示出了評估經蛋白酶處理的和未經蛋白酶處理的配體結合分子與IL-6R的結合的實時結合圖。每個圖的標題是被測樣品的名稱??v軸表示配體結合分子與IL-6R的相對結合,橫軸示出了時間(s)?;揖€示出未經蛋白酶處理的樣品數據,黑線示出經蛋白酶處理的樣品數據。[圖13]圖13示出了經蛋白酶處理和未經蛋白酶處理的融合蛋白的SDS-PAGE結果。雖然不包含蛋白酶切割序列的對照分子無論用蛋白酶處理還是未處理都在相同位置顯示條帶,但是包含含有引入了蛋白酶切割序列的單域抗體的配體結合分子的各個融合蛋白顯示了僅在蛋白酶處理后產生的新條帶,因此表明包含含有引入了每個蛋白酶切割序列的單域抗體的配體結合分子的融合蛋白被蛋白酶處理切割。[圖14]圖14示出了圖13的續。[圖15]圖15示出了圖14的續。[圖16]圖16示出了圖15的續。[圖17]圖17示出了評估含有經蛋白酶處理的或未經蛋白酶處理的融合蛋白的溶液中存在的游離IL-6R與IL6R90-bio的結合的實時圖。每個圖的標題是被測樣品的名稱??v軸表示IL-6R與含有生物素化抗IL-6R單域抗體的分子(IL6R90-bio)的相對結合,橫軸示出時間(s)?;揖€示出未經蛋白酶處理的樣品數據,黑線示出經蛋白酶處理的樣品數據。[圖18]圖18示出了圖17的繼續。[圖19]圖19示出了經蛋白酶處理和未經蛋白酶處理的融合蛋白的SDS-PAGE結果。[圖20]圖20示出了顯示包含經蛋白酶處理的或未經蛋白酶處理的融合蛋白的溶液中存在的游離人PD-1與含生物素化抗PD-1單域抗體的分子(PD1-bio)的結合的實時圖。每個圖的標題是被測樣品的名稱??v軸表示PD1與PD1-bio的相對結合,橫軸示出時間(s)?;揖€示出未經蛋白酶處理的樣品數據,黑線示出經蛋白酶處理的樣品數據。具體實施方式氨基酸在本說明書中,每個氨基酸由單字母代碼或三字母代碼或兩者表示,例如由Ala/A,Leu/L,Arg/R,Lys/K,Asn/N,Met/M,Asp/D,Phe/F,Cys/C,Pro/P,Gln/Q,Ser/S,Glu/E,Thr/T,Gly/G,Trp/W,His/H,Tyr/Y,Ile/I,或Val/V表示。天然氨基酸在本說明書中,“天然氨基酸”是指蛋白質中含有的20種氨基酸。具體而言,該術語是指Gly,Ala,Ser,Thr,Val,Leu,Ile,Phe,Tyr,Trp,His,Glu,Asp,Gln,Asn,Cys,Met,Lys,Arg和Pro。肽如本文所用,術語“肽”是指化合物,其中兩個或多個氨基酸分子在一個分子的氨基和另一個分子的羧基之間通過提取水分子連接。肽中包含的氨基酸數量沒有限制。因此,寡肽和多肽都包括在肽中。多肽本公開中使用的術語多肽通常是指長度為約10個氨基酸或更多的肽和蛋白質。當從N-末端到C-末端通過肽鍵連接的氨基酸鏈被認為是一系列肽鏈時,根據本公開的多肽可以是復合蛋白,其中多個系列的肽鏈由相互作用,例如SS鍵、疏水相互作用和離子鍵形成。此外,本公開的多肽通常是由人工設計的序列組成的多肽,但并不特別限于此,例如可以是合成多肽、重組多肽等。此外,上述多肽的片段也包括在本公開的多肽中。分離的多肽本公開的多肽可以指分離的多肽?!胺蛛x的”多肽是與其天然環境成分分離的多肽。在一些實施方案中,多肽純化至純度超過95%或99%,例如通過電泳(例如,SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或色譜法(例如,離子交換色譜法或反相HPLC)確定的。當多肽是抗體時,參見,例如,Flatman等人,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)的評價抗體純度的方法綜述。蛋白酶如本文所用,術語“蛋白酶”是指水解肽鍵的酶,例如內肽酶或外肽酶,通常是指內肽酶。蛋白酶的具體實例包括但不限于半胱氨酸蛋白酶(包括組織蛋白酶家族B、L、S等)、天冬氨酰蛋白酶(組織蛋白酶D、E、K、O等)、絲氨酸蛋白酶(包括蛋白裂解酶包括MT-SP1)、組織蛋白酶A和G、凝血酶、纖溶酶、尿激酶(uPA)、組織纖溶酶原激活物(tPA)、彈性蛋白酶、蛋白酶3、凝血酶、激肽釋放酶、類胰蛋白酶和類胰凝乳蛋白酶)、金屬蛋白酶(金屬蛋白酶(MMP1-28))包括膜結合形式(MMP14-17和MMP24-25)和分泌形式(MMP1-13、MMP18-23和MMP26-28)、解聯蛋白和金屬蛋白酶(ADAM)、帶有血小板反應蛋白基序的解聯蛋白和金屬蛋白酶(ADAMTS)、跨膜肽酶(跨膜肽酶α和跨膜肽酶β)、CD10(CALLA)、前列腺特異抗原(PSA)、legumain、TMPRSS3、TMPRSS4、人嗜中性粒細胞彈性蛋白酶(HNE)、β分泌酶(BACE)、成纖維細胞活化蛋白α(FAP)、粒酶B、胍基苯甲酸酶(GB)、hepsin、中性溶酶、NS3/4A、HCV-NS3/4、鈣蛋白酶、ADAMDEC1、腎素、組織蛋白酶C、組織蛋白酶V/L2、組織蛋白酶X/Z/P、cruzipain、otubain2、激肽釋放酶相關肽酶(KLK(KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13和KLK14))、骨形態發生蛋白1(BMP-1)、活化蛋白C、凝血相關蛋白酶(因子VIIa、因子IXa、因子Xa、因子XIa和因子XIIa)、HtrA1、乳鐵蛋白、marapsin、PACE4、DESC1、二肽基肽酶4(DPP-4)、TMPRSS2、組織蛋白酶F、組織蛋白酶H、組織蛋白酶L2、組織蛋白酶O、組織蛋白酶S、粒酶A、Gepsin鈣蛋白酶2、谷氨酸羧肽酶2、AMSH樣蛋白酶、AMSH、γ分泌酶、抗纖溶酶裂解酶(APCE)、decysin1、N-乙?;?連接的酸性二肽酶樣1(NAALADL1),和弗林蛋白酶。本公開的蛋白酶可以是與患病組織密切相關的蛋白酶。例如,它可以指以下任何一種蛋白酶:(1)在患病組織中的表達水平高于在正常組織中的表達水平的蛋白酶;(2)在患病組織中比在正常組織中具有更高活性的蛋白酶;(3)在患病組織細胞中的表達水平高于在正常細胞中的表達水平的蛋白酶;和(4)在患病組織的靶細胞中比在正常細胞中具有更高活性的蛋白酶?;疾〗M織的實例包括癌組織和炎癥組織。術語“癌組織”是指含有至少一個癌細胞的組織。因此,考慮到例如癌組織含有癌細胞和血管,意味著有助于形成含有癌細胞和內皮細胞的腫瘤塊的每種細胞類型。在本說明書中,腫瘤塊是指腫瘤組織的病灶。術語“腫瘤”通常用于表示良性腫瘤或惡性腫瘤。在本說明書中,“炎癥組織”的實例包括以下:類風濕性關節炎或骨關節炎的關節,支氣管哮喘或COPD中的肺(肺泡),炎癥性腸病、克羅恩病或潰瘍性結腸炎中的消化器官,肝、腎或肺纖維化中的纖維化組織,在器官移植中表現出排斥反應的組織,動脈硬化或心力衰竭中的血管或心臟(心肌),代謝綜合征中的內臟脂肪,特應性皮炎和其他皮炎中的皮膚組織,和椎間盤突出或慢性腰痛中的脊神經。尿激酶(uPA)尿激酶(uPA),也稱為尿激酶型纖溶酶原激活物,是一種胞外絲氨酸蛋白酶。術語“尿激酶”、“尿激酶型纖溶酶原激活物”和“uPA”在本文中可互換使用,并且包括可以源自任何優選生物體的任何uPA,其是天然存在的,其是內源性產生的,和/或是重組形式,只要它具有絲氨酸蛋白酶活性。例如,在本公開的一個實施方案中,uPA呈雙鏈活性形式(tc-uPA)。尿激酶進一步包括人uPA和源自不同物種的uPA,例如哺乳動物uPA,包括來自靈長類動物(例如黑猩猩、食蟹猴或恒河猴);嚙齒動物(例如小鼠或大鼠);兔子(例如兔子);和偶蹄動物(例如牛、羊、豬或駱駝)的uPA。術語“尿激酶型纖溶酶原激活物”和“uPA”還包括重組產生的uPA,包括“基因重組技術產生的”任何uPA,包括但不限于在哺乳動物細胞系統或細菌或酵母中表達的蛋白質。尿激酶(uPA)被認為與癌組織高度相關,尿激酶(uPA)可切割的肽序列在癌組織中的切割頻率高于正常組織。蛋白裂解酶(Matriptase)蛋白裂解酶是一種絲氨酸蛋白酶。本公開的蛋白裂解酶包括可源自任何優選生物體的任何蛋白裂解酶,其是天然存在的、內源性產生的和/或以重組形式存在的,只要其具有絲氨酸蛋白酶活性。蛋白裂解酶進一步包括人蛋白裂解酶和源自不同物種的蛋白裂解酶,例如哺乳動物蛋白裂解酶,包括來自靈長類動物(例如,黑猩猩、食蟹猴或恒河猴);嚙齒動物(例如小鼠或大鼠);兔子(例如兔子);或偶蹄動物(例如牛、羊、豬或駱駝)的蛋白裂解酶。蛋白裂解酶進一步包括重組產生的蛋白裂解酶,其包括“通過基因重組技術產生”的任何蛋白裂解酶,包括但不限于在哺乳動物細胞系統、或細菌或酵母中表達的蛋白質。蛋白裂解酶包括MT-SP1,并且MT-SP1包括任何MT-SP1,其可以源自任何優選的生物體,其是天然存在的、內源性產生的和/或是重組形式,只要它具有絲氨酸蛋白酶活性。MT-SP1包括人MT-SP1和來自不同物種的MT-SP1,例如哺乳動物MT-SP1,包括來自靈長類動物(例如黑猩猩、食蟹猴或恒河猴);嚙齒動物(例如小鼠或大鼠);兔子(例如兔子);或偶蹄動物(例如牛、羊、豬或駱駝)的MT-SP1。MT-SP1還包括重組產生的MT-SP1,包括“基因重組技術產生”的任何MT-SP1,包括但不限于哺乳動物細胞系統或細菌或酵母中表達的蛋白質。蛋白裂解酶(包括MT-SP1)被認為與癌組織高度相關,蛋白裂解酶(包括MT-SP1)可切割的肽序列在癌組織中的切割頻率高于正常組織。由于人MT-SP1和小鼠MT-SP1的序列相當相似,因此它們對相同底物的酶活性被認為是相似的。通過蛋白酶確認切割的方法MolCellProteomics.2014Jun;13(6):1585-97.doi:10.1074/mcp.M113.033308.Epub2014年4月4日中描述的方法是作為評估本申請說明書中記載的蛋白酶對蛋白酶底物或蛋白酶切割序列的切割的方法的實例。待評估的蛋白酶底物或蛋白酶切割序列固定在肽陣列上,用含有待評估蛋白酶的溶液處理肽陣列,切割比率可使用從芯片測得的熒光值如下計算:蛋白酶的切割比率(蛋白水解活性比:PAR)=僅用PBS處理時的熒光(RFU)/用含蛋白酶溶液處理時的熒光(RFU)可以適當地選擇評估使用的蛋白酶的種類和濃度、處理溫度和處理時間。例如可以使用含1000nM人uPA的PBS、含1000nM小鼠uPA的PBS、含500nM人MT-SP1的PBS或含500nM小鼠MT-SP1的PBS,37℃處理1小時。此外,可以使用血清(包括人血清、小鼠血清)代替含蛋白酶的溶液來處理肽陣列,并且可以使用從芯片測量的熒光值如下計算切割比率:血清的切割比率(蛋白水解活性比:PAR)=僅用PBS處理時的熒光(RFU)/用血清處理時的熒光(RFU)可以適當地選擇評估使用的血清的種類和濃度、處理溫度和處理時間。例如,稀釋至80%濃度的人血清可用作處理溶液,37℃過夜處理。如本文所用,短語“不被血清切割”可以指根據上述方法測量和計算的血清切割比為1.5或更小,或血清切割比低于SEQIDNO:4中所示肽的切割比,如根據上述方法測量和計算的。作為定性確認多肽中包含的蛋白酶切割序列是否被蛋白酶切割的方法,可以對含有包含蛋白酶切割序列的多肽的溶液進行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)來確定片段的分子量,從而允許確認。切割也可以通過比較經蛋白酶處理的和未經蛋白酶處理的多肽之間的分子量來確認。在本說明書中,術語“切割的”是指在蛋白酶改變蛋白酶切割序列和/或蛋白酶切割序列處的半胱氨酸-半胱氨酸二硫鍵還原后多肽被破壞的狀態。在本說明書中,術語“未切割的”是指在不存在蛋白酶切割序列的蛋白酶切割和/或不存在蛋白酶切割序列處的半胱氨酸-半胱氨酸二硫鍵的還原的情況下,多肽中蛋白酶切割序列兩側的部分連接的狀態。此外,蛋白酶處理后的切割片段可以通過電泳如SDS-PAGE分離并定量以評價蛋白酶切割序列和引入了蛋白酶切割序列的分子的切割比率。評估其中引入了蛋白酶切割序列的分子的切割比率的方法的非限制性實施方案包括以下方法。例如,當使用重組人u-纖溶酶原激活物/尿激酶(人uPA、huPA)(R&DSystems;1310-SE-010)或重組人蛋白裂解酶/ST14催化結構域(人MT-SP1、hMT-SP1)(R&DSystems;3946-SE-010)評估其中引入了蛋白酶切割序列的抗體變體的切割比率時,將100μg/mL的抗體變體在37℃時與PBS中的40nMhuPA或3nMhMT-SP1反應1小時,然后進行毛細管電泳免疫分析。毛細管電泳免疫測定可以使用Wes(ProteinSimple)進行,但本方法不限于此。作為毛細管電泳免疫測定的備選方法,可以進行SDS-PAGE等用于分離,然后用蛋白質印跡法檢測。本方法不限于這些方法。在切割之前和之后,可以使用抗人λ鏈HRP標記的抗體(abcam;ab9007)檢測輕鏈,但可以使用任何可以檢測切割片段的抗體。用Wes軟件(SW指南(CompassforSW);ProteinSimple)輸出蛋白酶處理后得到的各峰面積,可用下式確定抗體變體的切割比率(%):(切割的輕鏈峰面積)x100/(切割的輕鏈峰面積+未切割的輕鏈峰面積)如果在蛋白酶處理前后可檢測到蛋白質片段,則可以確定切割比率。不僅可以確定抗體變體的切割比率,還可以確定其中引入了蛋白酶切割序列的各種蛋白質分子的切割比率。已經引入蛋白酶切割序列的分子的體內切割比率可以通過將分子施用于動物并檢測血液樣品中的施用分子來確定。例如,將引入了蛋白酶切割序列的抗體變體施用于小鼠,并從它們的血液樣本中收集血漿。通過本領域技術人員已知的方法使用DynabeadsProteinA(Thermo;10001D)從血漿中純化抗體,然后進行毛細管電泳免疫測定以評估抗體變體的蛋白酶切割比率。毛細管電泳免疫測定可以使用Wes(ProteinSimple)進行,但本方法不限于此。作為毛細管電泳免疫測定的備選方法,可以進行SDS-PAGE等用于分離,然后用蛋白質印跡法檢測。本方法不限于這些方法。從小鼠收集的抗體變體的輕鏈可以使用抗人λ鏈HRP標記的抗體(abcam;ab9007)進行檢測,但可以使用可以檢測切割片段的任何抗體。一旦使用Wes軟件(SW指南;ProteinSimple)輸出毛細管電泳免疫測定獲得的每個峰的面積,剩余輕鏈的比例可以計算為[輕鏈的峰面積]/[重鏈的峰面積]以確定在小鼠體內未切割的全長輕鏈的比例。如果可檢測到從活生物體收集的蛋白質片段,則可以確定體內切割效率。不僅可以確定抗體變體的切割比率,還可以確定其中引入了蛋白酶切割序列的各種蛋白質分子的切割比率。通過上述方法計算切割比率,例如可以比較引入不同切割序列的抗體變體的體內切割比率,以及比較不同動物模型例如正常小鼠模型和腫瘤移植小鼠模型之間的單一抗體變體的切割比率。蛋白酶底物本公開的一方面涉及蛋白酶底物。在一個實施方案中,蛋白酶底物是指具有被蛋白酶作用水解的氨基酸序列的肽或多肽。在另一個實施方案中,蛋白酶底物是長度為約5-15個氨基酸的肽。本公開的蛋白酶底物可以以約0.001至1500×104M-1S-1或至少0.001,0.005,0.01,0.05,0.1,0.5,1,2.5,5,7.5,10,15,20,25,50,75,100,125,150,200,250,500,750,1000,1250或1500x104M-1S-1的速率被蛋白酶特異性地修飾(切割)。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶底物比包含SEQIDNO:1、2和3的任一項序列的蛋白酶底物具有更高的蛋白酶切割比率。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶底物比包含SEQIDNO:1、2和3的任一項序列的蛋白酶底物具有更高的人uPA切割比率。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶底物被人uPA的切割比率為1.5或更多、1.6或更多、1.8或更多、2或更多、2.2或更多、2.4或更多、2.6或更多、2.8或更多、3或更多、3.2或更多、3.4或更多、3.6或更多、3.8或更多、3.9或更多、或4或更多。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶底物比包含SEQIDNO:1、2和3的任一項序列的蛋白酶底物具有更高的被人MT-SP1的切割比率。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶底物的被人MT-SP1的切割比率為1.5或更多、1.6或更多、1.8或更多、2或更多、2.2或更多、2.4或更多、2.6或更多、2.8或更多、3或更多、3.2或更多、3.4或更多、3.6或更多、3.8或更多、3.9或更多、或4或更多。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶底物比包含SEQIDNO:1、2和3的任一項序列的蛋白酶底物具有更高的被小鼠uPA的切割比率。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶底物被小鼠uPA的切割比率為1或更多、1.1或更多、1.2或更多、1.3或更多、1.4或更多、1.5或更多、1.6或更多、1.7或更多、1.8或更多、1.9或更多、2或更多、2.5或更多、3或更多、3.5或更多、或4或更多。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶底物比包含SEQIDNO:1、2和3的任一項序列的蛋白酶底物具有更高的被小鼠MT-SP1的切割比率。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶底物被小鼠MT-SP1的切割比率為1.5或更多、1.6或更多、1.8或更多、2或更多、2.2或更多、2.4或更多、2.6或更多、2.8或更多、3或更多、3.2或更多、3.4或更多、3.6或更多、3.8或更多、3.9或更多、或4或更多。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶底物比包含SEQIDNO:1、2和3的任一項序列的蛋白酶底物具有更高的被人uPA的切割比率與被人血清的切割比率的比值。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶底物的被人uPA的切割比率與被人血清的切割比率的比值為0.9或更多、0.95或更多、1或更多、1.2或更多、1.4或更多、1.6或更多、1.8或更多、2或更多、2.2或更多、2.4或更多、2.6或更多、2.8或更多、3或更多、3.2或更多、3.4或更多、3.6或更多、3.8或更多、或4或更多。在這些實施方案中,當人血清的切割比率為1或更小時,將其轉換為1后,可用于計算人uPA的切割比率與人血清的切割比率的比值。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶底物比包含SEQIDNO:1、2和3的任一項序列的蛋白酶底物具有更高的被人MT-SP1的切割比率與被人血清的切割比率的比值。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶底物的被人MT-SP1的切割比率與被人血清的切割比率的比值為0.7或更多、0.8或更多、0.9或更多、0.95或更多、1或更多、1.2或更多、1.4或更多、1.6或更多、1.8或更多、2或更多、2.2或更多、2.4或更多、2.5或更多、或2.6或更多。在這些實施方案中,當人血清的切割比率為1或更小時,將其轉換為1后,可用于計算被人MT-SP1的切割比率與被人血清的切割比率的比值。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶底物比包含SEQIDNO:1、2和3的任一項序列的蛋白酶底物具有更高的被小鼠uPA的切割比率與被人血清的切割比率的比值。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶底物的被小鼠uPA的切割比率與被人血清切割比率的比值為0.6或更多、0.7或更多、0.8或更多、0.9或更多、0.95或更多、1或更多、1.1或更多、1.2或更多、1.3或更多、1.4或更多、1.5或更多、1.6或更多、1.7或更多、1.8或更多、1.9或更多、或2或更多。在這些實施方案中,當被人血清的切割比率為1或更小時,將其轉換為1后,可用于計算被小鼠uPA的切割比率與被人血清的切割比率的比值。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶底物比包含SEQIDNO:1、2和3的任一項序列的蛋白酶底物具有更高的被小鼠MT-SP1切割比率與被人血清切割比率的比值。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶底物的被小鼠MT-SP1的切割比率與被人血清的切割比率的比值為0.7或更多、0.8或更多、0.9或更多、0.95或更多、1或更多、1.2或更多、1.4或更多、1.6或更多、1.8或更多、2或更多、2.2或更多、2.4或更多、2.5或更多、或2.6或更多。在這些實施方案中,當人血清的切割比率為1或更小時,將其轉換為1后,可用于計算被小鼠MT-SP1的切割比率與被人血清的切割比率的比值。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶底物不被人血清切割。舉例來說,本公開的蛋白酶底物的被人血清切割比率為1.5或以下。再舉一個具體的例子,本公開的蛋白酶底物的被人血清切割比率低于SEQIDNO:4所示肽的被人血清的切割比率。作為進一步的具體實例,例如在以下任何序列中示出的肽可用作通過蛋白酶的作用水解的蛋白酶底物:跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第15個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第6至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第1至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第11個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第10個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第3至第14個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第10個氨基酸的序列;和SEQIDNO:5-18003中任一項所示的序列。作為另一個具體實例,顯示具有由從N-末端的順序為“選自下列A組的序列-選自下列B組的序列”組成的序列的肽也可用作通過蛋白酶的作用水解的蛋白酶底物:(A組)跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第1至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第2至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第3至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第5至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第6至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第7至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第8至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第1至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第2至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第4至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第5至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第1至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第2至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第3至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第4至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第6至第8個氨基酸的序列,和跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第7至第8個氨基酸的序列;(B組)跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第15個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第14個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第13個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第12個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第11個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第15個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第14個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第13個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第12個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第11個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第10個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第15個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第14個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第13個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第12個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第11個氨基酸的序列,和跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第10個氨基酸的序列。本公開的蛋白酶底物可以用作例如文庫,從中可以選擇具有適合目的的特性蛋白酶底物以參入多肽中。具體地,為了通過位于損傷中的蛋白酶選擇性地切割多肽,可以評估底物對該蛋白酶的敏感性。當體內施用多肽時,該分子可能在到達損傷之前與各種蛋白酶接觸。因此,該分子應優選對定位于損傷處的蛋白酶具有敏感性并且對其他蛋白酶也應具有盡可能高的抗性。為了根據目的選擇所需的蛋白酶底物,可以預先綜合分析每種蛋白酶底物對各種蛋白酶的敏感性,以發現其蛋白酶抗性。根據獲得的蛋白酶抗性譜,可以找到具有必要靈敏度和抗性的蛋白酶底物?;蛘?,已參入蛋白酶底物的多肽在到達損傷之前不僅經歷蛋白酶的酶促作用,而且經歷各種環境應激,例如pH變化、溫度和氧化/還原應激。根據蛋白酶底物對這些外部因素的抗性的比較信息,可以選擇具有所需性質的蛋白酶底物。蛋白酶切割序列一方面,本公開涉及蛋白酶切割序列。蛋白酶切割序列是當多肽在水溶液中被蛋白酶水解時被蛋白酶特異性識別的特定氨基酸序列。在本公開中,蛋白酶切割序列可被稱為可被蛋白酶切割的肽序列。本公開的蛋白酶切割序列可以以約0.001至1500×104M-1S-1或至少0.001,0.005,0.01,0.05,0.1,0.5,1,2.5,5,7.5,10,15,20,25,50,75,100,125,150,200,250,500,750,1000,1250,或1500x104M-1S-1的速率被蛋白酶特異性地修飾(切割)。例如,以下序列均可用作蛋白酶切割序列:跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第15個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第6至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第1至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第11個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第10個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第3至第14個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第10個氨基酸的序列;和SEQIDNO:5-18003中所示的序列。本公開還涉及這些序列作為蛋白酶切割序列的用途。例如,從N-末端開始依次由“選自下述A組的序列-選自下述B組的序列”構成的序列都可用作蛋白酶切割序列。本公開還涉及這些序列作為蛋白酶切割序列的用途:(A組)跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第1至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第2至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第3至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第5至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第6至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第7至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第8至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第1至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第2至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第4至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第5至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第1至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第2至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第3至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第4至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第6至第8個氨基酸的序列,和跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第7至第8個氨基酸的序列;(B組)跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第15個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第14個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第13個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第12個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第11個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第15個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第14個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第13個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第12個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第11個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第10個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第15個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第14個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第13個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第12個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第11個氨基酸的序列,和跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第10個氨基酸的序列。在某些實施方案中,蛋白酶切割序列與抗體連接或通過其他方式與其附接。例如,蛋白酶切割序列用于將一種或多種試劑與結合預定靶標的抗體連接,使得當蛋白酶切割序列暴露于蛋白酶,即蛋白裂解酶和/或uPA時,它被切割并且試劑從抗體中釋放出來。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶切割序列比包含SEQIDNO:1、2和3的任一項序列的蛋白酶底物具有更高的蛋白酶切割比率。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶切割序列比包含SEQIDNO:1、2和3的任一項序列的蛋白酶底物具有更高的被人uPA的切割比率。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶切割序列的被人uPA的切割比率為1.5或更多、1.6或更多、1.8或更多、2或更多、2.2或更多、2.4或更多、2.6或更多、2.8或更多、3或更多、3.2或更多、3.4或更多、3.6或更多、3.8或更多、3.9或更多、或4或更多。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶切割序列比包含SEQIDNO:1、2和3的任一項序列的蛋白酶底物具有更高的被人MT-SP1的切割比率。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶切割序列的被人MT-SP1的切割比率為1.5或更多、1.6或更多、1.8或更多、2或更多、2.2或更多、2.4或更多、2.6或更多、2.8或更多、3或更多、3.2或更多、3.4或更多、3.6或更多、3.8或更多、3.9或更多、或4或更多。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶切割序列比包含SEQIDNO:1、2和3的任一項序列的蛋白酶底物具有更高的被小鼠uPA的切割比率。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶切割序列的被小鼠uPA的切割比率,在某些實施方案中,本公開的蛋白酶底物的被小鼠uPA的切割比率為1或更多、1.1或更多、1.2或更多、1.3或更多、1.4或更多、1.5或更多、1.6或更多、1.7或更多、1.8或更多、1.9或更多、2或更多、2.5或更多、3或更多、3.5或更多、或4或更多。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶切割序列比包含SEQIDNO:1、2和3的任一項序列的蛋白酶底物具有更高的被小鼠MT-SP1的切割比率。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶切割序列的被小鼠MT-SP1的切割比率為1.5或更多、1.6或更多、1.8或更多、2或更多、2.2或更多、2.4或更多、2.6或更多、2.8或更多、3或更多、3.2或更多、3.4或更多、3.6或更多、3.8或更多、3.9或更多、或4或更多。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶切割序列比包含SEQIDNO:1、2和3的任一項序列的蛋白酶底物具有更高的被人uPA切割比率與被人血清切割比率的比值。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶切割序列的被人uPA的切割比率與被人血清的切割比率的比值為0.9或更多、0.95或更多、1或更多、1.2或更多、1.4或更多、1.6或更多、1.8或更多、2或更多、2.2或更多、2.4或更多、2.6或更多、2.8或更多、3或更多、3.2或更多、3.4或更多、3.6或更多、3.8或更多、或4或更多。在這些實施方案中,當被人血清的切割比率為1或更小時,將其轉換為1后,可用于計算被人uPA的切割比率與被人血清的切割比率的比值。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶切割序列比包含SEQIDNO:1、2和3的任一項序列的蛋白酶底物具有更高的被人MT-SP1切割比率與被人血清切割比率的比值。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶切割序列的被人MT-SP1切割比率與被人血清的切割比率的比值為0.7或更多、0.8或更多、0.9或更多、0.95或更多、1或更多、1.2或更多、1.4或更多、1.6或更多、1.8或更多、2或更多、2.2或更多、2.4或更多、2.5或更多、或2.6或更多。在這些實施方案中,當被人血清的切割比率為1或更小時,將其轉換為1后,可用于計算被人MT-SP1的切割比率與被人血清的切割比率的比值。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶切割序列比包含SEQIDNO:1、2和3的任一項序列的蛋白酶底物具有更高的被小鼠uPA切割比率與被人血清切割比率的比值。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶切割序列的被小鼠uPA的切割比率與被人血清切割比率的比值為0.6或更多、0.7或更多、0.8或更多、0.9或更多、0.95或更多、1或更多、1.1或更多、1.2或更多、1.3或更多、1.4或更多、1.5或更多、1.6或更多、1.7或更多、1.8或更多、1.9或更多、或2或更多。在這些實施方案中,當被人血清的切割比率為1或更小時,將其轉換為1后,可用于計算被小鼠uPA的切割比率與被人血清的切割比率的比值。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶切割序列比包含SEQIDNO:1、2和3的任一項序列的蛋白酶底物具有更高的被小鼠MT-SP1切割比率與被人血清切割比率的比值。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶切割序列的被小鼠MT-SP1的切割比率與被人血清的切割比率的比值為0.7或更多、0.8或更多、0.9或更多、0.95或更多、1或更多、1.2或更多、1.4或更多、1.6或更多、1.8或更多、2或更多、2.2或更多、2.4或更多、2.5或更多、或2.6或更多。在這些實施方案中,當被人血清的切割比率為1或更小時,將其轉換為1后,可用于計算被小鼠MT-SP1的切割比率與被人血清的切割比率的比值。在某些實施方案中,本公開的蛋白酶切割序列不被人血清切割。舉例來說,本公開的蛋白酶切割序列的被人血清切割比率為1.5或以下。再舉一個具體的例子,本公開的蛋白酶底物的被人血清切割比率低于SEQIDNO:4所示肽的被人血清切割比率。本公開的蛋白酶切割序列可例如在參入多肽后用作文庫,用于選擇具有適合于目的的特性的序列。具體而言,為了通過位于疾病病灶中的蛋白酶選擇性切割多肽,可以評估其對蛋白酶的敏感性。多肽被施用至生物體后,與各種蛋白酶接觸后可到達病灶。因此,希望多肽對定位于疾病病灶的蛋白酶敏感,同時盡可能對其他蛋白酶具有抗性。為了根據預期目的選擇所需的蛋白酶切割序列,可以對每個蛋白酶切割序列對多種蛋白酶的敏感性進行初步詳盡分析,從而了解該序列的蛋白酶抗性?;谌绱双@得的蛋白酶抗性譜,可以鑒定具有所需敏感性和抗性的蛋白酶切割序列?;蛘?,引入蛋白酶切割序列的多肽不僅在經歷蛋白酶的酶促作用之后,而且在經歷各種環境應激,例如pH變化、溫度以及氧化和還原應激之后,都會到達疾病的病灶。對于這些外部因素,也可以根據與各蛋白酶切割序列的抗性比較相關的信息,根據預期目的選擇具有所需特性的蛋白酶切割序列。在一些實施方案中,蛋白酶切割序列可以被至少蛋白裂解酶切割。在一些實施方案中,蛋白酶切割序列可以被至少MT-SP1切割。在一些實施方案中,蛋白酶切割序列可以被至少uPA切割。在一些實施方案中,蛋白酶切割序列可以被至少蛋白裂解酶和uPA切割。在一些實施方案中,蛋白酶切割序列可以被至少MT-SP1和uPA切割。在一些實施方案中,蛋白酶切割序列是蛋白裂解酶和/或uPA的底物,并且該底物對至少其他蛋白酶的切割具有抗性。在一些實施方案中,蛋白酶切割序列是蛋白裂解酶和/或uPA的底物,并且該底物對至少纖溶酶的切割具有抗性。在一些實施方案中,蛋白酶切割序列是蛋白裂解酶和/或uPA的底物,并且該底物對至少組織纖溶酶原激活物(tPA)的切割具有抗性。在一些實施方案中,蛋白酶切割序列是蛋白裂解酶和/或uPA的底物,并且該底物對至少人血清的切割具有抗性。氨基酸改變對于多肽的氨基酸序列中氨基酸的改變,可以適當采用本領域已知的方法例如定點誘變(Kunkeletal.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或重疊延伸PCR。也可以采用本領域已知的多種方法作為用天然氨基酸以外的氨基酸取代氨基酸的改變方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249;和Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2003)100(11),6353-6357)。例如,也優選使用含有tRNA的無細胞翻譯系統(CloverDirect(蛋白表達(ProteinExpress))),其中非天然氨基酸與作為終止密碼子的UAG密碼子(琥珀密碼子)互補的琥珀抑制tRNA結合。在本說明書中,用于表示氨基酸改變位點的術語“和/或”意在包括其中“和”和“或”適當組合的每一種組合。具體而言,例如,短語“第37、45和/或47位的氨基酸被取代”包括以下氨基酸改變的變體:(a)位置37,(b)位置45,(c)位置47,(d)位置37和45,(e)位置37和47,(f)位置45和47,和(g)位置37、45和47。在本說明書中,將改變前后的氨基酸的單字母代碼或三字母代碼寫在代表特定位置的數字之前和之后的表達可以適當地用于表示氨基酸改變。例如,用于取代抗體可變區中包含的氨基酸的改變F37V或Phe37Val代表在由Kabat編號定義的第37位Phe被Val取代。具體地,數字代表由Kabat編號定義的氨基酸位置;數字前寫的氨基酸的單字母代碼或三字母代碼表示取代前的氨基酸;數字后面的氨基酸的單字母代碼或三字母代碼表示取代后的氨基酸。同樣地,用于取代抗體恒定區中包含的Fc區中的氨基酸的改變P238A或Pro238Ala表示用Ala取代EU編號定義的238位的Pro。具體地,數字表示由EU編號定義的氨基酸位置;數字前寫的氨基酸的單字母代碼或三字母代碼表示取代前的氨基酸;數字后面的氨基酸的單字母代碼或三字母代碼表示取代后的氨基酸。將氨基酸序列A“插入”到氨基酸序列B中,是指將氨基酸序列B分為兩部分,沒有缺失,并將兩部分用氨基酸序列A連接起來(即產生“氨基酸序列B的前半部分-氨基酸序列A-氨基酸序列B的后半部分”這樣的氨基酸序列)。將氨基酸序列A“引入”氨基酸序列B是指將氨基酸序列B分成兩部分,并將這兩部分用氨基酸序列A連接起來。這不僅包括如上所述將氨基酸序列A“插入”到氨基酸序列B中,還包括在缺失氨基酸序列B的一個或多個氨基酸殘基,包括與氨基酸序列A相鄰的氨基酸殘基后,將兩部分用氨基酸序列A連接起來(即用氨基酸序列A替換氨基酸序列B的一部分)。另外,在本說明書中,術語“A位點與B位點之間的邊界附近”是指在多肽中A位點與B位點的連接位點前后,對A位點和/或B位點的二級結構影響不大的位點??贵w和抗體片段在本說明書中,術語“抗體”以最廣泛的含義使用并涵蓋各種抗體結構,包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段,只要該抗體表現出所需的抗原結合活性?!翱贵w片段”是指除完整抗體之外的分子,包括完整抗體的一部分并結合完整抗體所結合的抗原??贵w片段的實例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子(例如,scFv)和由抗體片段形成的多特異性抗體。術語“全長抗體”、“完整抗體”和“全抗體”在本說明書中可彼此互換使用,是指具有與天然抗體結構基本相似的結構或具有含有本說明書中定義的Fc區的重鏈的抗體。本說明書包括其中抗體包含蛋白酶切割序列的實施方案,無論是否包含蛋白酶切割序列,其都可以表述為“抗體”??勺儏^術語“可變區”或“可變結構域”是指參與抗體與其抗原結合的抗體重鏈或輕鏈的結構域。通常,抗體重鏈和輕鏈可變結構域(分別為VH和VL)具有相似的結構,并且每個結構域包含4個保守構架區(FR)和3個互補決定區(CDR)(參見,例如Kindtetal.,KubyImmunology,6thed.,W.H.FreemanandCo.,page91(2007))。一個VH或VL結構域應該足以賦予抗原結合特異性。CDR本說明書中使用的術語“互補決定區”或“CDR”在序列中是高變的,和/或形成結構決定的環(“高變環”),和/或指抗原接觸殘基(“抗原接觸”)或抗體可變結構域或單域抗體的每個區域。通常,抗體包含6個CDR:三個在VH(H1、H2和H3)中,三個在VL(L1、L2和L3)中。在本說明書中,示例性抗體CDR包括以下:(a)出現在氨基酸殘基26至32(L1),50至52(L2),91至96(L3),26至32(H1),53至55(H2)和96至101(H3)處的高變環(ChothiaandLesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987));(b)出現在氨基酸殘基24至34(L1),50至56(L2),89至97(L3),31至35b(H1),50至65(H2)和95至102(H3)處的CDR(Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991));(c)出現在氨基酸殘基27c至36(L1),46至55(L2),89至96(L3),30至35b(H1),47至58(H2)和93至101(H3)處的抗原接觸(MacCallumetal.,J.Mol.Biol.262:732-745(1996));和(d)(a)、(b)和/或(c)的組合,包含CDR氨基酸殘基46至56(L2),47至56(L2),48至56(L2),49至56(L2),26至35(H1),26至35b(H1),49至65(H2),93至102(H3)和94至102(H3)。通常,單域抗體包含三個CDR:CDR1、CDR2和CDR3。當單域抗體為VHH或單域VH抗體時,單域抗體CDR示例性地包含以下:(a)出現在氨基酸殘基26至32(CDR1),53至55(CDR2),和96至101(CDR3)處的高變環(ChothiaandLesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987));(b)出現在氨基酸殘基31至35b(CDR1),50至65(CDR2),和95至102(CDR3)處的CDR(Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991));(c)出現在氨基酸殘基30至35b(CDR1),47至58(CDR2),和93至101(CDR3)處的抗原接觸(MacCallumetal.,J.Mol.Biol.262:732-745(1996));和(d)(a)、(b)和/或(c)的組合,包含CDR氨基酸殘基26至35(CDR1)、26至35b(CDR1)、49至65(CDR2)、93至102(CDR3)或94至102(CDR3)。當單域抗體為單域VL抗體時,單域抗體CDR示例性地包含以下:(a)出現在氨基酸殘基26至32(CDR1),50至52(CDR2),和91至96(CDR3)處的高變環(ChothiaandLesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987));(b)出現在氨基酸殘基24至34(CDR1),50至56(CDR2),和89至97(CDR3)處的CDR(Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991));(c)出現在氨基酸殘基27c至36(CDR1),46至55(CDR2),和89至96(CDR3)處的抗原接觸(MacCallumetal.,J.Mol.Biol.262:732-745(1996));和(d)(a)、(b)和/或(c)的組合,包含CDR氨基酸殘基46至56(CDR2)、47至56(CDR2)、48至56(CDR2)或49至56(CDR2)。在本說明書中,可變結構域中的CDR殘基和其他殘基(例如,FR殘基)根據上述Kabat等編號,除非另有說明。FR術語“構架”或“FR”是指除互補決定區(CDR)殘基之外的可變結構域殘基或單域抗體殘基??勺兘Y構域或單域抗體中的FR通常由4個FR結構域組成:FR1、FR2、FR3和FR4。因此,CDR和FR的序列通常按以下順序出現在VH(或VL)中:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。在單域抗體中,CDR和FR的序列通常按以下順序出現:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4?!叭斯灿袠嫾堋笔谴硪幌盗腥嗣庖咔虻鞍譜L或VH構架序列中最常見的氨基酸殘基的構架。通常,所述人免疫球蛋白VL或VH序列的系列來自可變結構域序列的亞組。通常,序列亞組是Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,NIHPublication91-3242,BethesdaMD(1991),vols.1-3中的亞組。在一個實施方案中,對于VL,該亞組是上述Kabat等人的亞組κI。在一個實施方案中,對于VH,亞組是上述Kabat等人的亞組III。恒定區在本說明書中,術語“恒定區”或“恒定結構域”是指抗體中除可變區之外的部分。例如,IgG抗體是約150,000Da的異源四聚體糖蛋白,由通過二硫鍵連接的兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈構成。每條重鏈從N末端到C末端都有可變區(VH),也稱為可變重鏈結構域或重鏈可變結構域,接著是重鏈恒定區(CH),其包含CH1結構域、鉸鏈區、CH2結構域和CH3結構域。同樣,每條輕鏈從N末端到C末端都有可變區(VL),也稱為可變輕鏈結構域或輕鏈可變結構域,然后是恒定輕鏈(CL)結構域。根據其恒定結構域的氨基酸序列,天然抗體的輕鏈可歸因于稱為κ(κ)和λ(λ)的兩種類型之一。術語“包含/包含恒定區”可以包括整個恒定區或可以包括恒定區的一部分。除非本文另有特別說明,抗體可變區和抗體輕鏈和重鏈恒定區中氨基酸殘基的編號是根據Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD1991中描述的Kabat編號系統??贵w的“類別”是指抗體重鏈所攜帶的恒定結構域或恒定區的類型??贵w有5大類:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。這些類別中的一些可以進一步分為亞類(同種型),例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應于不同類別免疫球蛋白的重鏈恒定結構域分別稱為α、δ、ε、γ和μ。Fc區在本說明書中,術語“Fc區”用于定義免疫球蛋白重鏈的C-末端區域,包括至少一部分恒定區。該術語包括具有天然序列的Fc區和突變的Fc區。在一個實施方案中,人IgGl的重鏈Fc區從重鏈的Cys226或Pro230跨越到羧基末端。然而,Fc區的C-末端賴氨酸(Lys447)或甘氨酸-賴氨酸(Gly446-Lys447)可能存在或不存在。在本說明書中,Fc區或抗體重鏈恒定區中的氨基酸殘基根據Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD1991中描述的EU編號系統(也稱為EU索引)編號,除非另有說明。鉸鏈區術語“鉸鏈區”或“抗體鉸鏈區”可以指由抗體重鏈中由根據EU編號第216至第230個氨基酸組成的區域,或其一部分。單域抗體在本說明書中,“單域抗體”是能夠單獨通過該結構域表現出抗原結合活性的抗體。單域抗體的結構沒有限制,只要它可以單獨通過該結構域發揮抗原結合活性即可。以IgG抗體等為示例的普通抗體在通過VH和VL配對形成可變區的狀態下顯示抗原結合活性,而單域抗體不與其他結構域配對,并且已知域單域抗體的結構域結構本身可以發揮抗原結合活性。單域抗體通常分子量相對較低,以單體形式存在。在幾個實施方案中,單域抗體的形式類似于抗體重鏈可變區或抗體輕鏈可變區的形式。單域抗體的實例包括但不限于來自駱駝科動物的重鏈抗體的可變區(VHH)、先天性缺乏輕鏈的抗原結合分子(例如鯊魚VNAR)或包括全部或部分抗體VH結構域或全部或部分抗體VL結構域的抗體片段。作為包含全部或部分抗體VH/VL結構域的抗體片段的單域抗體的實例包括但不限于從人抗體VH或人抗體VL開始的人工生產的單域抗體(以下稱為單域VH抗體、單域VL抗體),如美國專利號6,248,516B1中所述,等等。單域抗體可以從能夠產生單域抗體的動物或通過免疫能夠產生單域抗體的動物獲得。能夠產生單域抗體的動物的實例包括但不限于駱駝科動物和攜帶能夠產生單域抗體的基因的轉基因動物。駱駝科(Camelidae)的動物包括駱駝、駝馬(lamas)、羊駝、單峰駱駝和大羊駝(guanacos)等。攜帶能夠產生單域抗體的基因的轉基因動物的實例包括但不限于:WO2015/143414和美國專利公開號US2011/0123527A1中描述的轉基因動物??梢詫膭游铽@得的單域抗體的構架序列轉化為人種系序列或與其相似的序列,以獲得人源化單域抗體。人源化單域抗體(例如,人源化VHH)也是本說明書的單域抗體的一個實施方案?;蛘?,可以通過ELISA、淘選等從包含單域抗體的多肽文庫中獲得單域抗體。包含單域抗體的多肽文庫的實例包括但不限于從各種動物或人類獲得的幼稚抗體文庫(例如,MethodsinMolecularBiology2012911(65-78)和BiochimicaetBiophysicaActa-ProteinsandProteomics20061764:8(1307-1319)),通過免疫各種動物獲得的抗體文庫(例如,JournalofAppliedMicrobiology2014117:2(528-536)),以及從各種動物或人類的抗體基因制備的合成抗體文庫(例如,JournalofBiomolecularScreening201621:1(35-43),JournalofBiologicalChemistry2016291:24(12641-12657)和AIDS201630:11(1691-1701))。在本公開中,存在單域抗體中包含蛋白酶切割序列的實施方案,但是無論是否包含蛋白酶切割序列都可以使用表述“單域抗體”。在若干實施方案中,本說明書的單域抗體通??啥x為包含以下的多肽:a)由四個構架區/序列組成的氨基酸序列,所述構架區/序列之間插入了三個互補決定區/序列(根據Kabat編號第11位的氨基酸殘基選自由L、M、S、V和W組成的組,優選為L),和/或b)由四個構架區/序列組成的氨基酸序列,所述構架區/序列之間插入了三個互補決定區/序列(根據Kabat編號第37位的氨基酸殘基選自由F、Y、H、I、L,和V組成的組,優選為F或Y),和/或c)由四個構架區/序列組成的氨基酸序列,所述構架區/序列之間插入了三個互補決定區/序列(根據Kabat編號第44位的氨基酸殘基選自由G、E、A、D、Q、R、S和L組成的組,優選為G、E或Q,更優選為G或E),和/或d)由四個構架區/序列組成的氨基酸序列,所述構架區/序列之間插入了三個互補決定區/序列(根據Kabat編號第45位的氨基酸殘基選自由L、R、C、I、L、P、Q和V組成的組,并且優選為L或R),和/或e)由四個構架區/序列組成的氨基酸序列,所述構架區/序列之間插入了三個互補決定區/序列(根據Kabat編號第47位的氨基酸殘基選自由W、L、F、A、G、I、M、R、S、V和Y組成的組,優選為W、L、F或R),和/或f)由四個構架區/序列組成的氨基酸序列,所述構架區/序列之間插入了三個互補決定區/序列(根據Kabat編號第83位的氨基酸殘基選自由R、K、N、E、G、I、M、Q和T組成的組,優選為K或R,更優選為K),和/或g)由四個構架區/序列組成的氨基酸序列,所述構架區/序列之間插入了三個互補決定區/序列(根據Kabat編號第84位的氨基酸殘基選自由P、A、L、R、S、T、D和V組成的組,優選為P),和/或h)由四個構架區/序列組成的氨基酸序列,所述構架區/序列之間插入了三個互補決定區/序列(根據Kabat編號第103位的氨基酸殘基選自由W、P、R和S組成的組,優選為W),和/或i)由四個構架區/序列組成的氨基酸序列,所述構架區/序列之間插入了三個互補決定區/序列(根據Kabat編號第104位的氨基酸殘基為G或D,優選為G),和/或j)由四個構架區/序列組成的氨基酸序列,所述構架區/序列之間插入了三個互補決定區/序列(Kabat編號第108位的氨基酸殘基選自由Q、L和R組成的組,優選為Q或L)。更具體地,但不排他地,單域抗體可以定義為包含由四個構架區/序列組成的氨基酸序列中的任一個的多肽,四個構架區/序列中插入有以下三個互補決定區/序列:k)氨基酸序列,其中根據Kabat編號的第43至46位氨基酸殘基為KERE或KQRE;l)氨基酸序列,其中根據Kabat編號的第44至47位的氨基酸殘基為GLEW;和,m)氨基酸序列,其中根據Kabat編號的第83至84位的氨基酸殘基為KP或EP。嵌合抗體術語“嵌合”抗體是指重鏈和/或輕鏈的一部分源自特定來源或物種,而重鏈和/或輕鏈的其余部分源自不同來源或物種的抗體。術語“嵌合單域抗體”是指單域抗體,其中單域抗體的一部分源自特定來源或物種,而單域抗體的其余部分源自不同來源或物種。人源化抗體“人源化”抗體是指包含來自非人CDR的氨基酸殘基和來自人FR的氨基酸殘基的嵌合抗體。在一些實施方案中,人源化抗體包括基本上所有的、至少一個且通常為兩個可變結構域,其中所有或基本上所有的CDR對應于非人抗體的那些CDR,并且所有或基本上所有的FR對應于人抗體的那些FR?!叭嗽椿瘑斡蚩贵w”是指包含來自非人CDR的氨基酸殘基和來自人FR的氨基酸殘基的嵌合單域抗體。在一些實施方案中,在人源化單域抗體中,所有或基本上所有的CDR對應于非人抗體的那些CDR,并且所有或基本上所有FR對應于人抗體的那些FR。在人源化抗體中,即使FR中的一些殘基不對應于人抗體的FR,也可以認為是基本上所有FR對應于人抗體的FR的實例。例如,當人源化VHH時(它是單域抗體的一個實施方案),需要將FR中的一些殘基變成與人抗體的殘基不對應的殘基(CVinckeetal.,TheJournalofBiologicalChemistry284,3273-3284.)。人源化抗體可任選地包括源自人抗體的抗體恒定區的至少一部分??贵w(例如,非人抗體)的“人源化形式”是經過人源化的抗體。締合在本說明書中,“締合”可以指例如兩個或更多個多肽區域彼此相互作用的狀態。一般而言,在目標多肽區域之間形成疏水鍵、氫鍵、離子鍵等以形成締合物。作為共同締合的一個實例,已知以天然抗體為代表的抗體通過其間的非共價鍵等保留重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的配對結構。取消締合可以指例如取消兩個或多個多肽區域彼此相互作用的全部或部分狀態。取消VH和VL之間的締合可以包括取消VH和VL之間的整體相互作用,或者取消VH和VL之間的部分相互作用。FcRn結合區本說明書中的“FcRn結合區”是指對FcRn具有結合活性的區域,可以具有任何結構,只要所使用的區域對FcRn具有結合活性。含有FcRn結合區的分子能夠被細胞吸收,然后通過FcRn的補救途徑帶回血漿。例如,IgG分子在血漿中的循環時間相對較長(緩慢消失),因為被稱為IgG分子的補救受體的FcRn起作用。通過胞飲作用進入內體的IgG分子在內體內酸性條件下與內體中表達的FcRn結合。未能與FcRn結合的IgG分子被移動到溶酶體并在其中降解,而與FcRn結合的IgG分子被轉移到細胞表面,然后在血漿中的中性條件下與FcRn解離,從而回到血漿中。FcRn結合區優選是直接與FcRn結合的區域。FcRn結合區的優選實例可包括抗體Fc區。然而,能夠結合具有FcRn結合能力的多肽如白蛋白或IgG的區域能夠通過白蛋白、IgG等間接結合FcRn。因此,根據本公開的FcRn結合區可以是與這種具有FcRn結合能力的多肽結合的區域。根據本公開的FcRn結合區對FcRn,特別是人FcRn的結合活性可以通過本領域技術人員已知的方法測量,如上文關于結合活性的章節所述。其條件可由本領域技術人員適當地確定。對人FcRn的結合活性可以用KD(解離常數)、表觀KD(表觀解離常數)、kd(解離速率)或表觀kd(表觀解離速率)等來評價。這些值可以通過本領域技術人員已知的方法測量。例如,可以使用Biacore(GEHealthcareJapanCorp.)、Scatchardplot、流式細胞儀等。FcRn結合區對FcRn的結合活性的測定條件沒有特別限定,可以由本領域技術人員適當地選擇。如WO2009/125825中所述,結合活性可以在涉及例如MES緩沖液和在37℃的條件下測量。此外,本公開的FcRn結合區對FcRn的結合活性可以通過本領域技術人員已知的方法測量并且可以使用例如Biacore(GEHealthcareJapanCorp.)測量。在測量FcRn結合區對FcRn的結合活性中,FcRn和FcRn結合區或包含FcRn結合區的攜帶部分可以作為分析物注入到芯片中,所述芯片上分別固定有含有FcRn結合區和FcRn的FcRn結合區或分子,然后進行評估。對于在測定條件中使用的pH,可以在4.0至6.5的任意pH下評價FcRn結合區對FcRn的結合親和力。優選地,使用接近體內早期內體pH的5.8至6.0的pH來確定FcRn結合區對人FcRn的結合親和力。對于在測定條件中使用的溫度,可以在10℃至50℃的任意溫度下評價FcRn結合區對FcRn的結合親和力。優選地,使用15℃至40℃的溫度確定FcRn結合區對人FcRn的結合親和力。更優選地,使用20℃至35℃的任何溫度,例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34和35℃中的任何一個溫度確定FcRn結合區對FcRn的結合親和力。25℃的溫度是本公開的實施方案的一個非限制性實例。FcRn結合區的一個實例包括但不限于IgG抗體Fc區。在使用IgG抗體Fc區的情況下,其類型沒有限制,例如,可以使用IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區。例如,可以使用包含選自由SEQIDNO:18004、18005、18006和18007表示的氨基酸序列的一個序列的Fc區??梢允褂锰烊籌gG抗體Fc區以及具有一個或多個氨基酸取代的Fc區變體,只要該Fc區具有FcRn結合活性。例如,可以使用如下Fc區變體,所述Fc區變體包含通過用另一種氨基酸取代選自EU編號位置237,238,239,248,250,252,254,255,256,257,258,265,270,286,289,297,298,303,305,307,308,309,311,312,314,315,317,325,332,334,360,376,380,382,384,385,386,387,389,424,428,433,434和436的至少一個氨基酸而衍生自IgG抗體Fc區的氨基酸序列。更具體地,在IgG抗體Fc區中,包含選自以下的至少一個氨基酸取代的Fc區變體,可用作FcRn結合區:用Met取代第237位的Gly的氨基酸取代,用Ala取代第238位的Pro的氨基酸取代,用Lys取代第239位的Ser的氨基酸取代,用Ile取代第248位的Lys的氨基酸取代,用Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp或Tyr取代第250位的Thr的氨基酸取代,用Phe、Trp或Tyr取代第252位的Met的氨基酸取代,用Thr取代第254位的Ser的氨基酸取代,用Glu取代第255位的Arg的氨基酸取代,用Asp、Glu或Gln取代第256位的Thr的氨基酸取代,用Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr或Val取代第257位的Pro的氨基酸取代,用His取代第258位的Glu的氨基酸取代,用Ala取代第265位的Asp的氨基酸取代,用Phe取代第270位的Asp的氨基酸取代,用Ala或Glu取代第286位的Asn的氨基酸取代,用His取代第289位的Thr的氨基酸取代,用Ala取代第297位的Asn的氨基酸取代,用Gly取代第298位的Ser的氨基酸取代,用Ala取代第303位的Val的氨基酸取代,用Ala取代第305位的Val的氨基酸取代,用Ala,Asp,Phe,Gly,His,Ile,Lys,Leu,Met,Asn,Pro,Gln,Arg,Ser,Val,Trp或Tyr取代第307位的Thr的氨基酸取代,用Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln或Thr取代第308位的Val的氨基酸取代,用Ala、Asp、Glu、Pro或Arg取代第309位的Leu或Val的氨基酸取代,用Ala、His或Ile取代第311位的Gln的氨基酸取代,用Ala或His取代第312位的Asp的氨基酸取代,用Lys或Arg取代第314位的Leu的氨基酸取代,用Ala或His取代第315位的Asn的氨基酸取代,用Ala取代第317位的Lys的氨基酸取代,用Gly取代第325位的Asn的氨基酸取代,用Val取代第332位的Ile的氨基酸取代,用Leu取代第334位的Lys的氨基酸取代,用His取代第360位的Lys的氨基酸取代,用Ala取代第376位的Asp的氨基酸取代,用Ala取代第380位的Glu的氨基酸取代,用Ala取代第382位的Glu的氨基酸取代,用Ala取代第384位的Asn或Ser的氨基酸取代,用Asp或His取代第385位的Gly的氨基酸取代,用Pro取代第386位的Gln的氨基酸取代,用Glu取代第387位的Pro的氨基酸取代,用Ala或Ser取代第389位的Asn的氨基酸取代,用Ala取代第424位的Ser的氨基酸取代,用Ala,Asp,Phe,Gly,His,Ile,Lys,Leu,Asn,Pro,Gln,Ser,Thr,Val,Trp或Tyr取代第428位的Met的氨基酸取代,用Lys取代第433位的His的氨基酸取代,用Ala、Phe、His、Ser、Trp或Tyr取代第434位的Asn的氨基酸取代,和用His取代第436位的Tyr或Phe的氨基酸取代(全部根據EU編號)。從另一個角度來看,在IgG抗體的Fc區中,包含選自以下的至少一個氨基酸的Fc區可用作FcRn結合區:Met作為第237位的氨基酸,Ala作為第238位的氨基酸,Lys作為第239位的氨基酸,Ile作為第248位的氨基酸,Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp或Tyr作為第250位的氨基酸,Phe、Trp或Tyr作為第252位的氨基酸,Thr作為第254位的氨基酸,Glu作為第255位的氨基酸,Asp、Glu或Gln作為第256位的氨基酸,Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr或Val作為第257位的氨基酸,His作為第258位的氨基酸,Ala作為第265位的氨基酸,Phe作為第270位的氨基酸,Ala或Glu作為第286位的氨基酸,His作為第289位的氨基酸,Ala作為第297位的氨基酸,Gly作為第298位的氨基酸,Ala作為第303位的氨基酸,Ala作為第305位的氨基酸,Ala,Asp,Phe,Gly,His,Ile,Lys,Leu,Met,Asn,Pro,Gln,Arg,Ser,Val,Trp或Tyr作為第307位的氨基酸,Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln或Thr作為第308位的氨基酸,Ala、Asp、Glu、Pro或Arg作為第309位的氨基酸,Ala、His或Ile作為第311位的氨基酸,Ala或His作為第312位的氨基酸,Lys或Arg作為第314位的氨基酸,Ala或His作為第315位的氨基酸,Ala作為第317位的氨基酸,Gly作為第325位的氨基酸,Val作為第332位的氨基酸,Leu作為第334位的氨基酸,His作為第360位的氨基酸,Ala作為第376位的氨基酸,Ala作為第380位的氨基酸,Ala作為第382位的氨基酸,Ala作為第384位的氨基酸,Asp或His作為第385位的氨基酸,Pro作為第386位的氨基酸,Glu作為第387位的氨基酸,Ala或Ser作為第389位的氨基酸,Ala作為第424位的氨基酸,Ala,Asp,Phe,Gly,His,Ile,Lys,Leu,Asn,Pro,Gln,Ser,Thr,Val,Trp,或Tyr作為第428位的氨基酸,Lys作為第433位的氨基酸,Ala、Phe、His、Ser、Trp或Tyr作為第434位的氨基酸,以及His作為第436位的氨基酸(全部根據EU編號)。親和力“親和力”是指分子(例如,抗體)的單個結合位點與其結合伴侶(例如,抗原)之間的非共價相互作用的總和的強度。除非另有說明,如本文所用,“結合親和力”是指反映結合對的成員(例如,抗體和抗原)之間的1:1相互作用的內在結合親和力。分子X對其伴侶Y的親和力通??梢杂媒怆x常數(Kd)表示。親和力可以通過本領域已知的常用方法測量,包括本文所述的那些。下面描述了用于測量結合親和力的具體說明性和示例性實施方案。單克隆抗體如本文所用,術語“單克隆抗體”是指從基本上同質的抗體群體中獲得的抗體,即,組成群體的個體抗體是相同的和/或結合相同的表位,除了可能的變體抗體,例如,含有天然發生突變或在單克隆抗體制備生產過程中出現,此類變體通常以少量存在。與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑相反,單克隆抗體制劑的每個單克隆抗體針對抗原上的單個決定簇。因此,修飾語“單克隆”表示從基本上同質的抗體群體中獲得的抗體的特征,并且不應解釋為需要通過任何特定方法產生抗體。例如,根據本公開使用的單克隆抗體可以通過多種技術制備,包括但不限于雜交瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的轉基因動物的方法,本文描述的用于制備單克隆抗體的此類方法和其他示例性方法??贵w生產方法產生具有所需結合活性的抗體的方法是本領域技術人員已知的。以下例示了與IL-6R結合的抗體(抗IL-6R抗體)的生產方法。與IL-6R以外的抗原結合的抗體也可以根據以下實施例適當地生產。在生產單域抗體時,雖然免疫動物等存在差異,但可以根據以下實施例適當地生產單域抗體??笽L-6R抗體可以通過使用本領域已知的方法以多克隆或單克隆抗體獲得。哺乳動物來源的單克隆抗體可以優選制備為抗IL-6R抗體。哺乳動物來源的單克隆抗體包括,例如,由雜交瘤產生的那些單克隆抗體和由通過基因工程方法用含有抗體基因的表達載體轉化的宿主細胞產生的那些單克隆抗體。本申請中描述的抗體包括“人源化抗體”和“嵌合抗體”。產生單克隆抗體的雜交瘤可以通過使用本領域已知的技術來制備,例如,如下所討論的。根據通常的免疫方法,用用作致敏抗原的IL-6R蛋白對哺乳動物進行免疫。如此獲得的免疫細胞通過通常的細胞融合方法與已知的親代細胞融合。接著,通過常規篩選方法篩選產生單克隆抗體的細胞以選擇產生抗IL-6R抗體的雜交瘤。具體而言,例如如下所討論的制備單克隆抗體。首先,可以表達IL-6R基因以獲得IL-6R蛋白,該IL-6R蛋白用作抗體獲得的致敏抗原。具體而言,將編碼IL-6R的基因序列插入到已知的表達載體中,然后用該表達載體轉化合適的宿主細胞。通過本領域已知的方法從宿主細胞或其培養物上清液中純化所需的人IL-6R蛋白。為了從培養物上清液中獲得可溶性IL-6R,例如,表達Mullberg等人(J.Immunol.(1994)152(10),4958-4968)描述的可溶性IL-6R?;蛘?,純化的天然IL-6R蛋白也可以用作致敏抗原。純化的IL-6R蛋白可用作致敏抗原,用于哺乳動物免疫。IL-6R的部分肽也可用作致敏抗原。部分肽可由人IL-6R的氨基酸序列通過化學合成獲得?;蛘?,部分肽可以通過將IL-6R基因的一部分摻入表達載體然后表達來獲得。此外,部分肽也可以通過用蛋白水解酶降解IL-6R蛋白來獲得。用作部分肽的IL-6R肽的區域和大小不受具體實施方案的特別限制。構成用作致敏抗原的肽的氨基酸數優選為至少5個或更多,例如6個或更多,或7個或更多。更具體地,8至50個,優選10至30個殘基的肽可用作致敏抗原。此外,包含與不同多肽融合的IL-6R蛋白的所需部分多肽或肽的融合蛋白可用作致敏抗原。例如,抗體Fc片段或肽標簽可優選用于生產用作致敏抗原的融合蛋白。用于表達融合蛋白的載體可以通過將編碼兩種或更多種類型的所需多肽片段的基因在框內融合,并將融合基因插入到如上所述的表達載體中來制備。制備融合蛋白的方法描述于MolecularCloning2nded.(Sambrook,J.etal.,MolecularCloning2nded.,9.47-9.58(1989),ColdSpringHarborLab.Press)。獲得用作致敏抗原的IL-6R的方法和使用它的免疫方法也具體描述于WO2003/000883、WO2004/022754、WO2006/006693等中。用致敏抗原免疫的哺乳動物不限于特定動物,并且優選考慮與用于細胞融合的親代細胞的相容性來選擇。通常,優選使用嚙齒動物(例如小鼠、大鼠和倉鼠)、兔、猴等。在獲得單域抗體時,優選使用駱駝科動物或攜帶能夠產生單域抗體的基因的轉基因動物。根據本領域已知的方法用致敏抗原免疫上述動物。例如,作為一般的方法,通過腹膜內或皮下施用向哺乳動物施用致敏抗原來進行免疫。具體地,將用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)、生理鹽水等以適當稀釋比稀釋的致敏抗原根據需要與常用佐劑例如弗氏完全佐劑混合并乳化。然后,將產生的致敏抗原以4至21天的間隔多次施用于哺乳動物。另外,在致敏抗原的免疫中可以使用合適的載體。特別地,在使用具有小分子量的部分肽作為致敏抗原的情況下,在某些情況下可能希望用與載體蛋白如白蛋白或匙孔血藍蛋白結合的致敏抗原肽進行免疫?;蛘?,也可以如下所述通過使用DNA免疫來制備產生所需抗體的雜交瘤。DNA免疫是一種免疫方法,它涉及通過在免疫動物體內表達致敏抗原來免疫刺激免疫的動物,所述免疫的動物已被施用載體DNA,所述載體DNA以能夠在免疫動物中表達編碼抗原蛋白的基因的形式構建??梢灶A期DNA免疫優于一般免疫方法,所述一般免疫方法中將蛋白質抗原施用于待免疫的動物,如下所述:-DNA免疫可以提供免疫刺激,同時保持膜蛋白(例如,IL-6R)的結構;和-DNA免疫不需要純化免疫抗原。為了通過DNA免疫獲得本公開的單克隆抗體,首先將表達IL-6R蛋白的DNA施用于待免疫動物。編碼IL-6R的DNA可以通過本領域已知的方法例如PCR合成。將獲得的DNA插入適當的表達載體中,然后將其施用于待免疫的動物。例如,可優選使用可商購的表達載體例如pcDNA3.1作為表達載體。作為將載體施用于活體的方法,可以使用通常使用的方法。例如,用基因槍將吸附有表達載體的金顆粒轉染到待免疫的動物個體的細胞中,從而進行DNA免疫。此外,識別IL-6R的抗體也可以通過使用WO2003/104453中描述的方法來制備。在如此免疫的哺乳動物的血清中證實了與IL-6R結合的抗體的效價升高。然后,從哺乳動物收集免疫細胞并進行細胞融合。特別地,脾細胞可用作優選的免疫細胞。哺乳動物骨髓瘤細胞用作與免疫細胞融合的細胞。骨髓瘤細胞優選具有合適的選擇標記用于篩選。選擇標記是指在特定培養條件下能夠存活(或不能存活)的性狀。例如,已知次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶缺乏癥(以下簡稱為HGPRT缺乏癥)或胸苷激酶缺乏癥(以下簡稱為TK缺乏癥)作為選擇標記。具有HGPRT或TK缺乏癥的細胞對次黃嘌呤氨基蝶呤胸苷(以下簡稱為HAT-敏感的)敏感。HAT敏感細胞在HAT選擇性培養基中被殺死,因為細胞無法合成DNA。相比之下,這些細胞與正常細胞融合時,即使在HAT選擇性培養基中也能生長,因為融合細胞可以通過使用正常細胞的補救途徑繼續DNA合成。具有HGPRT或TK缺乏癥的細胞可以分別在含有6-硫鳥嘌呤或8-氮鳥嘌呤(以下簡稱為8AG)或5'-溴脫氧尿苷的培養基中選擇。正常細胞通過將這些嘧啶類似物摻入其DNA中而被殺死。相比之下,缺乏這些酶的細胞可以在選擇性培養基中存活,因為細胞不能摻入嘧啶類似物。此外,稱為G418抗性的選擇標記通過新霉素抗性基因賦予對2-脫氧鏈霉胺抗生素(慶大霉素類似物)的抗性。適用于細胞融合的多種骨髓瘤細胞是本領域已知的。例如,P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123(4),1548-1550),P3x63Ag8U.1(CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunology(1978)81,1-7),NS-1(C.Eur.J.Immunol.(1976)6(7),511-519),MPC-11(Cell(1976)8(3),405-415),SP2/0(Nature(1978)276(5685),269-270),FO(J.Immunol.Methods(1980)35(1-2),1-21),S194/5.XX0.BU.1(J.Exp.Med.(1978)148(1),313-323)和R210(Nature(1979)277(5692),131-133)可以優選用作這樣的骨髓瘤細胞?;旧?,免疫細胞與骨髓瘤細胞的細胞融合是根據本領域已知的方法進行的,例如Kohler和Milstein等人(MethodsEnzymol.(1981)73,3-46)的方法。更具體地,細胞融合可以在例如通常的營養培養基中在細胞融合促進劑的存在下進行。例如,聚乙二醇(PEG)或日本血凝病毒(HVJ)用作融合啟動子。此外,如果需要,可以向其中加入輔助劑如二甲基亞砜,以提高融合效率,然后使用。免疫細胞與所用的骨髓瘤細胞之間的比值可任意設定。例如,免疫細胞的量優選設定為骨髓瘤細胞的量的1至10倍。例如,適用于骨髓瘤細胞系生長的RPMI1640培養基或MEM培養基以及用于這種細胞培養的常用培養基用作細胞融合中的培養基。優選地,可以進一步向培養基中加入補充有血清(例如胎牛血清(FCS)的溶液。對于細胞融合,將預定量的免疫細胞和骨髓瘤細胞在培養基中充分混合,然后向其中加入預熱至約37℃的PEG溶液(例如,PEG的平均分子量為約1000至6000),通常濃度為30%到60%(w/v)。輕輕混合混合溶液,從而形成所需的融合細胞(雜交瘤)。隨后,依次加入上述合適的培養基,離心除去上清液??梢灾貜驮摬僮饕匀コ龑﹄s交瘤生長不利的細胞融合劑等。如此獲得的雜交瘤可以在常用的選擇培養基,例如HAT培養基(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養基)中培養,用于選擇。使用HAT培養基的培養可以持續足夠的時間(通常,足夠的時間為數天至數周)以殺死所需雜交瘤以外的細胞(非融合細胞)。隨后,可以通過通常的有限稀釋方法篩選產生所需抗體的雜交瘤并進行單細胞克隆。由此獲得的雜交瘤可以通過使用選擇性培養基根據細胞融合中使用的骨髓瘤細胞所具有的選擇標記來選擇。例如,可以通過在HAT培養基(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養基)中培養來選擇具有HGPRT或TK缺乏癥的細胞。具體而言,在細胞融合中使用HAT敏感的骨髓瘤細胞的情況下,與正常細胞成功融合的細胞可以在HAT培養基中選擇性地生長。使用HAT培養基的培養繼續足夠長的時間以殺死所需雜交瘤以外的細胞(非融合細胞)。具體而言,培養通??蛇M行數天至數周以選擇所需的雜交瘤。隨后,可以通過通常的有限稀釋方法篩選產生所需抗體的雜交瘤并進行單細胞克隆。所需抗體的篩選和單細胞克隆可以優選通過基于已知抗原-抗體反應的篩選方法進行。例如,與IL-6R結合的單克隆抗體可以與細胞表面表達的IL-6R結合。例如,可以通過FACS(熒光激活細胞分選)篩選這樣的單克隆抗體。FACS是一種能夠通過使用激光束分析與熒光抗體接觸的細胞并測量從個體細胞發出的熒光來測量抗體與細胞表面的結合的系統。為了通過FACS篩選產生本公開的單克隆抗體的雜交瘤,首先制備表達IL-6R的細胞。優選用于篩選的細胞是被迫表達IL-6R的哺乳動物細胞。用作宿主細胞的未轉化哺乳動物細胞可用作對照,以選擇性檢測抗體對細胞表面的IL-6R的結合活性。具體而言,通過選擇產生與被迫表達IL-6R的細胞結合但不與宿主細胞結合的抗體的雜交瘤,可以獲得產生IL-6R單克隆抗體的雜交瘤?;蛘?,可以基于ELISA原理評價抗體對固定的表達IL-6R的細胞的結合活性。表達IL-6R的細胞被固定在例如ELISA板的每個孔上。雜交瘤培養物上清液與孔中的固定細胞接觸以檢測與固定細胞結合的抗體。當單克隆抗體來源于小鼠時,可以使用抗小鼠免疫球蛋白抗體檢測與細胞結合的抗體??梢酝ㄟ^有限稀釋法等克隆通過篩選選出的產生具有抗原結合能力的所需抗體的雜交瘤。如此制備的產生單克隆抗體的雜交瘤可以在常用培養基中傳代培養。此外,雜交瘤可以在液氮中長期保存。雜交瘤按照常規方法培養,可以從其培養物上清液中獲得所需的單克隆抗體?;蛘?,可以將雜交瘤施用于與其相容的哺乳動物并使其生長,并且可以從哺乳動物的腹水中獲得單克隆抗體。前一種方法適用于獲得高純度抗體。也可以優選使用由從抗體產生細胞例如雜交瘤克隆的抗體基因編碼的抗體。將克隆的抗體基因整合到合適的載體中,然后將其轉染到宿主中,從而表達由該基因編碼的抗體。例如,Vandamme等人(Eur.J.Biochem.(1990)192(3),767-775)已經建立了用于分離抗體基因、將基因整合到載體以及轉化宿主細胞的方法。生產重組抗體的方法也是已知的,如下所述。例如,從產生抗IL-6R抗體的雜交瘤細胞中獲得編碼抗IL-6R抗體可變區(V區)的cDNA。為此,通常首先從雜交瘤中提取總RNA。例如,可以使用以下方法作為從細胞中提取mRNA的方法:-胍超速離心法(Biochemistry(1979)18(24),5294-5299),和-AGPC方法(Anal.Biochem.(1987)162(1),156-159)。提取的mRNA可以使用mRNA純化試劑盒(GEHealthcareBio-SciencesCorp.制造)等進行純化?;蛘?,從細胞中直接提取總mRNA的試劑盒也可商購獲得,例如QuickPrepmRNA純化試劑盒(由GEHealthcareBio-SciencesCorp.制造)??梢允褂眠@樣的試劑盒從雜交瘤中獲得mRNA。從獲得的mRNA,可以使用逆轉錄酶合成編碼抗體V區的cDNA??梢允褂美鏏MV逆轉錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒(由SeikagakuCorp.制造)合成cDNA?;蛘?,使用SMARTRACEcDNA擴增試劑盒(由ClontechLaboratories,Inc.制造)和PCR的5'-RACE方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85(23),8998-9002;和NucleicAcidsRes.(1989)17(8),2919-2932)可以適當地用于cDNA合成和擴增。在這樣的cDNA合成過程中,可以在cDNA的兩端進一步引入后述的合適的限制性酶切位點。從獲得的PCR產物中純化目標cDNA片段,然后與載體DNA連接。將如此制備的重組載體轉染到大腸桿菌等中。菌落選擇后,可以從形成菌落的大腸桿菌中制備所需的重組載體。然后,通過本領域已知的方法,例如雙脫氧核苷酸鏈終止法,確認重組載體是否具有目標cDNA的核苷酸序列。使用引物擴增可變區基因的5'-RACE方法可以方便地用于獲得編碼可變區的基因。首先,使用從雜交瘤細胞中提取的RNA作為模板,通過cDNA合成獲得5'-RACEcDNA文庫。5'-RACEcDNA文庫的合成中適當使用可商購的試劑盒例如SMARTRACEcDNA擴增試劑盒。使用獲得的5'-RACEcDNA文庫作為模板,通過PCR擴增抗體基因??梢愿鶕阎目贵w基因序列設計用于擴增小鼠抗體基因的引物。這些引物的核苷酸序列因免疫球蛋白亞類而不同。因此,希望使用可商購的試劑盒例如IsoStrip小鼠單克隆抗體同種型試劑盒(RocheDiagnosticsK.K.)預先確定亞類。具體地,例如,出于獲得編碼小鼠IgG的基因的目的,可以使用能夠擴增編碼γ1、γ2a、γ2b和γ3重鏈和κ和λ輕鏈的基因的引物。為了擴增IgG可變區基因,通常使用與接近可變區的恒定區對應的部分退火的引物作為3'引物。另一方面,5'RACEcDNA文庫制備試劑盒附帶的引物用作5'引物。如此通過擴增獲得的PCR產物可用于重構由重鏈和輕鏈組合組成的免疫球蛋白??梢允褂弥貥嫷拿庖咔虻鞍讓L-6R的結合活性作為指標來篩選所需的抗體。更優選地,抗體與IL-6R的結合是特異的,例如出于獲得針對IL-6R的抗體的目的。例如,可以通過以下步驟篩選與IL-6R結合的抗體:(1)使表達IL-6R的細胞與含有由雜交瘤獲得的cDNA編碼的V區的抗體接觸;(2)檢測抗體與表達IL-6R的細胞的結合;和(3)選擇與表達IL-6R的細胞結合的抗體。檢測抗體(包括單域抗體)與表達IL-6R的細胞的結合的方法是本領域已知的。具體而言,抗體與表達IL-6R的細胞的結合可以通過上述方法例如FACS進行檢測。表達IL-6R的細胞的固定制劑可以適當地用于評價抗體的結合活性。使用噬菌體載體的淘選方法也優選用作使用結合活性作為指標篩選抗體的方法。同樣在篩選單域抗體的情況下,可以根據以下實施例適當地進行篩選。當從表達多克隆抗體的細胞群中獲得作為重鏈和輕鏈亞類文庫的抗體基因時,使用噬菌體載體的篩選方法是有利的。編碼重鏈和輕鏈可變區的基因可以通過合適的接頭序列連接以形成單鏈Fv(scFv)??梢詫⒕幋ascFv的基因插入噬菌體載體,獲得表面表達scFv的噬菌體。使噬菌體與所需抗原接觸后,可以回收與抗原結合的噬菌體以回收編碼具有目標結合活性的scFv的DNA??梢愿鶕枰貜驮摬僮饕愿患哂兴杞Y合活性的scFv。獲得編碼目標抗IL-6R抗體V區的cDNA后,用識別插入在cDNA兩端的限制性位點的限制酶消化該cDNA。限制酶優選識別并消化在構成抗體基因的核苷酸序列中出現頻率低的核苷酸序列。優選地,插入提供粘性末端的限制酶位點以將一個拷貝的消化片段以正確的方向插入到載體中??梢詫⑷绱讼木幋a抗IL-6R抗體V區的cDNA插入合適的表達載體中以獲得抗體表達載體。在這種情況下,編碼抗體恒定區(C區)的基因和編碼V區的基因在框內融合以獲得嵌合抗體。在這種情況下,“嵌合抗體”意味著恒定區和可變區的起源不同。因此,異源(例如,小鼠-人)嵌合抗體以及人-人同源嵌合抗體也包括在根據本公開的嵌合抗體中??梢詫區基因插入到預先具有恒定區基因的表達載體中,以構建嵌合抗體表達載體。具體地,例如,可以將消化V區基因的限制酶的識別序列適當地置于攜帶編碼所需抗體恒定區(C區)的DNA的表達載體的5'側。兩者都用相同組合的限制酶消化并在框內融合以構建嵌合抗體表達載體。為了生產抗IL-6R單克隆抗體,將抗體基因整合到表達載體中,使得抗體基因在表達控制區的控制下表達??贵w表達的表達控制區包括例如增強子和啟動子。此外,可以將適當的信號序列添加到氨基末端,使得表達的抗體在細胞外分泌。例如,具有氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQIDNO:18008)的肽可以用作信號序列,并且可以添加其他合適的信號序列。表達的多肽在上述序列的羧基末端部分被切割。切割的多肽可以作為成熟多肽在細胞外分泌。隨后,可以用該表達載體轉化合適的宿主細胞以獲得表達編碼抗IL-6R抗體的DNA的重組細胞。多核苷酸(核酸)如本文可互換使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何長度的核苷酸的聚合物,并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸或堿基和/或它們的類似物,或可以通過DNA或RNA聚合酶或通過合成反應摻入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含修飾的核苷酸,例如甲基化的核苷酸及其類似物。核苷酸序列可能被非核苷酸成分中斷。多核苷酸可包含合成后進行的修飾,例如與標記綴合。其他類型的修飾包括例如“帽(caps)”、用類似物取代一個或多個天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾例如具有不帶電荷的鍵的那些(例如,甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和帶電荷的鍵(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等),含有懸垂部分的那些,例如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-賴氨酸等),帶有嵌入劑的那些(例如,吖啶,補骨脂素等),含有螯合劑的那些(例如,金屬,放射性金屬,硼,氧化金屬等),含有烷基化劑的那些,帶有修飾的鍵的那些(例如,α異頭核酸等),以及未修飾形式的多核苷酸。此外,糖中通常存在的任何羥基可以被例如膦酸酯基團、磷酸酯基團替代,被標準保護基團保護,或被激活以制備與額外核苷酸的額外連接,或可以綴合到固體或半固相支持體。5'和3'末端OH可以被磷酸化或被胺或1至20個碳原子的有機封端基團部分取代。其他羥基也可以衍生為標準保護基團。多核苷酸還可以包含本領域公知的核糖或脫氧核糖的類似形式,包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基-、2'-氟-或2'-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-異頭糖、差向異構糖如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無環類似物和堿性核苷類似物如甲基核苷。一個或多個磷酸二酯鍵可以被備選的連接基團替代。這些備選的連接基團包括但不限于其中磷酸酯被P(O)S(“硫代酸酯”)、P(S)S(“二硫代酸酯”)、(O)NR2(“酰胺酸酯”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲縮醛(formacetal)”)替代的實施方案,其中每個R或R'獨立地為H或取代或未取代的烷基(1-20C),任選包含醚(-O-)鍵、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有鍵都需要相同。前述描述適用于本文提及的所有多核苷酸,包括RNA和DNA。載體如本文所用,術語“載體”是指能夠增殖與其連接的另一種核酸的核酸分子。該術語包括作為自我復制核酸結構的載體,以及摻入宿主細胞基因組中的載體,所述宿主細胞中已被引入所述載體。某些載體能夠指導與它們可操作地連接的核酸的表達。此類載體在本文中稱為“表達載體”。宿主細胞等術語“宿主細胞”、“宿主細胞系”和“宿主細胞培養物”可互換使用,是指已引入外源核酸的細胞,包括此類細胞的后代。宿主細胞包括“轉化體”和“轉化細胞”,其包括初級轉化細胞和由其衍生的后代,不考慮傳代次數。后代在核酸含量上可能與親本細胞不完全相同,而是可能包含突變。在最初轉化的細胞中篩選或選擇的具有相同功能或生物學活性的突變后代包括在本文中。包含蛋白酶切割序列的多肽本公開的一方面涉及包含蛋白酶切割序列的多肽。本公開的另一方面涉及包含選自以下的至少一個序列的多肽:跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第15個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第6至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第1至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第11個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第10個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第3至第14個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第10個氨基酸的序列;和SEQIDNO:5-18003中任一項所示的序列。本公開的另一方面涉及多肽,所述多肽包含從N末端起按此順序由“選自下列A組的序列-選自下列B組的序列”組成的序列中的任一種:(A組)跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第1至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第2至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第3至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第5至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第6至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第7至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第8至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第1至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第2至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第4至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第5至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第1至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第2至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第3至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第4至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第6至第8個氨基酸的序列,和跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第7至第8個氨基酸的序列;(B組)跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第15個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第14個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第13個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第12個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第11個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第15個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第14個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第13個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第12個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第11個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第10個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第15個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第14個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第13個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第12個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第11個氨基酸的序列,和跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第10個氨基酸的序列。在本公開多肽的某些實施方案中,所述多肽中含有選自下面所列序列中的至少一個序列,并且所述多肽中的所述序列可以被蛋白酶切割,即所述序列在多肽中作為蛋白酶切割序列起作用:跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第15個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第6至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第1至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第11個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第10個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第3至第14個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第10個氨基酸的序列;和SEQIDNO:5-18003中任一項所示的序列。此外,在本公開的多肽的某些實施方案中,從N-末端起按此順序由“選自下列A組的序列-選自下列B組的序列”組成的任何序列包含在多肽中,多肽中的所述序列可以被蛋白酶切割,即所述序列在多肽中起到蛋白酶切割序列的作用:(A組)跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第1至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第2至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第3至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第5至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第6至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第7至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第8至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第1至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第2至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第4至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第5至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第1至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第2至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第3至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第4至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第6至第8個氨基酸的序列,和跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第7至第8個氨基酸的序列;(B組)跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第15個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第14個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第13個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第12個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第11個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第15個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第14個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第13個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第12個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第11個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第10個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第15個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第14個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第13個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第12個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第11個氨基酸的序列,和跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第10個氨基酸的序列。在本公開的多肽的一個實施方案中,柔性接頭進一步連接到蛋白酶切割序列的一端或兩端。蛋白酶切割序列一端的柔性接頭可稱為“第一柔性接頭”,另一端的柔性接頭可稱為“第二柔性接頭”。在特定實施方案中,蛋白酶切割序列和柔性接頭具有下式中的任一個:(蛋白酶切割序列),(第一柔性接頭)-(蛋白酶切割序列),(蛋白酶切割序列)-(第二柔性接頭),和(第一柔性接頭)-(蛋白酶切割序列)-(第二柔性接頭)。根據本實施方案的柔性接頭優選為肽接頭。第一柔性接頭和第二柔性接頭各自獨立且任意地存在并且是相同或不同的含有至少一個柔性氨基酸(Gly等)的柔性接頭。柔性接頭包含例如足以使蛋白酶切割序列獲得所需的蛋白酶可及性的殘基數(任意選自Arg,Ile,Gln,Glu,Cys,Tyr,Trp,Thr,Val,His,Phe,Pro,Met,Lys,Gly,Ser,Asp,Asn,Ala等,特別是Gly、Ser、Asp、Asn和Ala,更特別是Gly和Ser,特別是Gly等的氨基酸)。適用于在蛋白酶切割序列的兩端使用的柔性接頭通常是改善蛋白酶接近蛋白酶切割序列并提高蛋白酶切割效率的柔性接頭??梢匀菀椎剡x擇合適的柔性接頭并且其可以優選地選自不同的長度,例如1個氨基酸(Gly等)至20個氨基酸、2個氨基酸至15個氨基酸、或3個氨基酸至12個氨基酸,包括4個氨基酸至10個氨基酸,5個氨基酸至9個氨基酸,6個氨基酸至8個氨基酸,或7個氨基酸至8個氨基酸。在本公開的一些實施方案中,柔性接頭是1至7個氨基酸的肽接頭。柔性接頭的實例包括但不限于甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-絲氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS:SEQIDNO:18018)n和(GGGS:SEQIDNO:18009)n,其中n是至少為1的整數),甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-絲氨酸聚合物和常規技術中眾所周知的其他柔性接頭。其中,甘氨酸和甘氨酸-絲氨酸聚合物受到關注,因為這些氨基酸相對非結構化,可以很容易地作為組分之間的中性系鏈發揮功能。由甘氨酸-絲氨酸聚合物組成的柔性接頭的實例可包括但不限于,SerGly·Ser(GS)Ser·Gly(SG)Gly·Gly·Ser(GGS)Gly·Ser·Gly(GSG)Ser·Gly·Gly(SGG)Gly·Ser·Ser(GSS)Ser·Ser·Gly(SSG)Ser·Gly·Ser(SGS)Gly·Gly·Gly·Ser(GGGS,SEQIDNO:18009)Gly·Gly·Ser·Gly(GGSG,SEQIDNO:18010)Gly·Ser·Gly·Gly(GSGG,SEQIDNO:18011)Ser·Gly·Gly·Gly(SGGG,SEQIDNO:18012)Gly·Ser·Ser·Gly(GSSG,SEQIDNO:18013)Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(GGGGS,SEQIDNO:18014)Gly·Gly·Gly·Ser·Gly(GGGSG,SEQIDNO:18015)Gly·Gly·Ser·Gly·Gly(GGSGG,SEQIDNO:18016)Gly·Ser·Gly·Gly·Gly(GSGGG,SEQIDNO:18017)Gly·Ser·Gly·Gly·Ser(GSGGS,SEQIDNO:18018)Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SGGGG,SEQIDNO:18019)Gly·Ser·Ser·Gly·Gly(GSSGG,SEQIDNO:18020)Gly·Ser·Gly·Ser·Gly(GSGSG,SEQIDNO:18021)Ser·Gly·Gly·Ser·Gly(SGGSG,SEQIDNO:18022)Gly·Ser·Ser·Ser·Gly(GSSSG,SEQIDNO:18023)Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(GGGGGS,SEQIDNO:18024)Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SGGGGG,SEQIDNO:18025)Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(GGGGGGS,SEQIDNO:18026)Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SGGGGGG,SEQIDNO:18027)(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(GGGGS,SEQIDNO:18014))n(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SGGGG,SEQIDNO:18019))n其中n是1或更大的整數。然而,本領域技術人員可以根據目的適當地選擇肽接頭的長度和序列。包含本公開的蛋白酶切割序列的多肽可以具有任何組成,只要它包含選自以下的至少一個序列:跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第15個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第6至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第1至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第11個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第10個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第3至第14個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第10個氨基酸的序列;和SEQIDNO:5-18003中任一項所示的序列。此外,包含本公開的蛋白酶切割序列的多肽可以具有任何組成,只要它包含從N-末端按此順序由“選自以下所列A組的序列-選自以下所列B組的序列”組成的任何序列:(A組)跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第1至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第2至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第3至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第5至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第6至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第7至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第8至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第1至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第2至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第4至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第5至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第1至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第2至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第3至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第4至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第6至第8個氨基酸的序列,和跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第7至第8個氨基酸的序列;(B組)跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第15個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第14個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第13個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第12個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第11個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第15個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第14個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第13個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第12個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第11個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第10個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第15個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第14個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第13個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第12個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第11個氨基酸的序列,和跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第10個氨基酸的序列。包含本公開的蛋白酶切割序列的多肽可以是可激活的抗體。例如,可激活的抗體包括以下:(i)與靶標特異性結合的抗體;(ii)當蛋白酶切割序列以未切割狀態存在時抑制抗體與靶標結合的掩蔽部分;和(iii)與抗體偶聯的可切割部分,其中可切割部分是選自本公開的蛋白酶切割序列的至少一個序列。包含抗原結合結構域和攜帶部分的多肽在本公開多肽的一個實施方案中,所述多肽包括抗原結合結構域和攜帶部分,所述攜帶部分具有抑制結構域,用于抑制抗原結合結構域的抗原結合活性。本公開還涉及用于從多肽釋放抗原結合結構域的方法,包括通過蛋白酶切割包含本文所述的抗原結合結構域和攜帶部分的多肽中的蛋白酶切割序列。在本說明書中,“抗原結合結構域”僅限于與目標抗原結合??乖Y合結構域可以是具有任何結構的結構域,只要所使用的結構域與目標抗原結合即可。這種結構域的例子包括但不限于抗體重鏈可變區(VH)、抗體輕鏈可變區(VL)、單域抗體(sdAb)、包含在體內細胞膜蛋白avimer中的大約35個氨基酸的稱為A結構域的模塊(WO2004/044011和WO2005/040229),作為蛋白結合結構域來源于在細胞膜上表達的糖蛋白纖連蛋白的含有10Fn3結構域的adnectin(WO2002/032925),含有構成由蛋白A的58個氨基酸組成的三螺旋束的IgG結合結構域支架的Affibody(WO1995/001937),DARPins(設計的錨蛋白重復蛋白),其是錨蛋白重復(AR)的分子表面暴露區域,每個區域具有33個氨基酸殘基結構,其折疊成轉角、兩個反平行螺旋和環的亞基(WO2002/020565),anticalin,其具有四個環的區域,所述環連接著在脂質運載蛋白分子例如中性粒細胞明膠酶相關運載蛋白(NGAL)中高度保守的桶狀結構一端向中心軸彎曲的8條反平行鏈(WO2003/029462),以及在無頜脊椎動物如七鰓鰻或盲鰻的獲得性免疫系統中看到的無免疫球蛋白結構的可變淋巴細胞受體(VLR)的由重復的富含亮氨酸重復(LRR)模塊組成的馬蹄形折疊的內部平行片狀結構中的凹陷區域(WO2008/016854)。本公開的抗原結合結構域的優選實例包括可以通過僅由抗原結合結構域構成的分子發揮抗原結合功能的抗原結合結構域和可以在從與其相連的額外肽釋放后自身發揮抗原結合功能的抗原結合結構域。這種抗原結合結構域的實例包括但不限于單域抗體、scFv、Fv、Fab、Fab'和F(ab')2。本公開的抗原結合結構域的一個優選實例包括具有60kDa或更小的分子量的抗原結合結構域。這種抗原結合結構域的實例包括但不限于單域抗體、scFv、Fab和Fab'。分子量為60kDa或更小的抗原結合結構域在作為單體存在于血液中時通常很可能被腎臟清除(參見JBiolChem.1988Oct15;263(29):15064-70)。從另一觀點來看,本公開的抗原結合結構域的一個優選實例包括在血液中的半衰期為12小時或更短的抗原結合結構域。這種抗原結合結構域的實例包括但不限于單域抗體、scFv、Fab和Fab'。本公開的抗原結合結構域的一個優選實例包括單域抗體(sdAb)。在本說明書中,“抗原”僅限于包含與抗原結合結構域結合的表位??乖膬炦x實例包括但不限于動物或人來源的肽、多肽和蛋白質??乖膬炦x實例包括但不限于在靶細胞(例如癌細胞和炎癥細胞)表面表達的分子、在含有靶細胞的組織中的其他細胞表面表達的分子、在對靶細胞和含有靶細胞的組織具有免疫作用的細胞表面表達的分子,以及在含有靶細胞的組織基質中存在的大分子??乖膶嵗砂ㄒ韵路肿樱?7-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-異-PGF2a、8-氧-dG、A1腺苷受體、A33、ACE、ACE-2、激活蛋白、激活蛋白A、激活蛋白AB、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白RIA、激活蛋白RIAALK-2、激活蛋白RIBALK-4、激活蛋白RIIA、激活蛋白RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α-1-抗胰蛋白酶、α-V/β-1拮抗劑、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、青蒿琥酯(artemin)、抗-Id、ASPARTIC、心房鈉尿肽、av/b3整聯蛋白、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴細胞刺激劑(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2BMP-2a、BMP-3骨生成蛋白、BMP-4BMP-2b、BMP-5、BMP-6Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a,OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、鈴蟾肽、骨源性神經營養因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、補體因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、降鈣素、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌癥相關抗原、組織蛋白酶A、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C/DPPI、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E、組織蛋白酶H、組織蛋白酶L、組織蛋白酶O、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V、組織蛋白酶X/Z/P、CBL,CCI,CCK2,CCL,CCL1,CCL11,CCL12,CCL13,CCL14,CCL15,CCL16,CCL17,CCL18,CCL19,CCL2,CCL20,CCL21,CCL22,CCL23,CCL24,CCL25,CCL26,CCL27,CCL28,CCL3,CCL4,CCL5,CCL6,CCL7,CCL8,CCL9/10,CCR,CCR1,CCR10,CCR10,CCR2,CCR3,CCR4,CCR5,CCR6,CCR7,CCR8,CCR9,CD1,CD2,CD3,CD3E,CD4,CD5,CD6,CD7,CD8,CD10,CD11a,CD11b,CD11c,CD13,CD14,CD15,CD16,CD18,CD19,CD20,CD21,CD22,CD23,CD25,CD27L,CD28,CD29,CD30,CD30L,CD32,CD33(p67蛋白)、CD34,CD38,CD40,CD40L,CD44,CD45,CD46,CD49a,CD52,CD54,CD55,CD56,CD61,CD64,CD66e,CD74,CD80(B7-1),CD89,CD95,CD123,CD137,CD138,CD140a,CD146,CD147,CD148,CD152,CD164,CEACAM5,CFTR,cGMP,CINC,肉毒桿菌毒素、產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)毒素、CKb8-1,CLC,CMV,CMVUL,CNTF,CNTN-1,COX,C-Ret,CRG-2,CT-1,CTACK,CTGF,CTLA-4,PD-1,PD-L1,LAG3,TIM3,半乳凝集素-9、CX3CL1,CX3CR1,CXCL,CXCL1,CXCL2,CXCL3,CXCL4,CXCL5,CXCL6,CXCL7,CXCL8,CXCL9,CXCL10,CXCL11,CXCL12,CXCL13,CXCL14,CXCL15,CXCL16,CXCR,CXCR1,CXCR2,CXCR3,CXCR4,CXCR5,CXCR6,細胞角蛋白腫瘤相關抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、衰變加速因子、des(1-3)-IGF-I(腦IGF-1)、Dhh、地高辛、DNAM-1、DNA酶、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、內皮素受體、腦啡肽酶、eNOS、Eot、嗜酸細胞活化趨化因子1、EpCAM、肝配蛋白B2/EphB4、ePO、ERCC、E-選擇蛋白、ET-1、因子IIa、因子VII、因子VIIIc、因子IX、成纖維細胞激活蛋白(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、鐵蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纖維蛋白、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、促卵泡激素、fractalkine、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14,CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12,CDMP-3)、GDF-8(肌生成抑制素)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、gITR、胰高血糖素、Glut4、糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、生長激素釋放因子、半抗原(NP帽或NIP帽)、HB-EGF、HCC、HCMVgB包膜糖蛋白、HCMVgH包膜糖蛋白、HCMVUL、造血生長因子(HGF)、HepBgp120、乙酰肝素酶、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、單純皰疹病毒(HSV)gB糖蛋白、HSVgD糖蛋白、HGFA、高分子量黑色素瘤相關抗原(HMW-MAA)、HIVgp120、HIVIIIBgp120V3環、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFGPEM、HRG、Hrk、人心臟肌球蛋白、人巨細胞病毒(HCMV)、人生長激素(HGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受體、IgE、IGF、IGF結合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-21、IL-23、IL-27、干擾素(INF)-α、INF-β、INF-γ、抑制素、iNOS、胰島素鏈A、胰島素鏈B、胰島素樣生長因子1、整聯蛋白α2、整聯蛋白α3、整聯蛋白α4、整聯蛋白α4/β1、整聯蛋白α4/β7、整聯蛋白α5(αV)、整聯蛋白α5/β1、整聯蛋白α5/β3、整聯蛋白α6、整聯蛋白β1、整聯蛋白β2、干擾素γ、IP-10、I-TAC、JE、激肽釋放酶2、激肽釋放酶5、激肽釋放酶6、激肽釋放酶11、激肽釋放酶12、激肽釋放酶14、激肽釋放酶15、激肽釋放酶L1、激肽釋放酶L2、激肽釋放酶L3、激肽釋放酶L4、KC、KDR、角質形成細胞生長因子(KGF)、層粘連蛋白5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潛在的TGF-1、潛在的TGF-1bp1、LBP、LDGF、LECT2、lefty、路易斯-Y抗原、路易斯-Y相關抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-選擇蛋白、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、促黃體素、淋巴毒素β受體、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、金屬蛋白酶、MGDF受體、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、黏蛋白(Muc1)、MUC18、米勒管抑制物質(mullerian-inhibitingsubstance)、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-C黏附素、NCA90、NCAM、NCAM、中性溶酶、神經營養蛋白-3、-4或-6、神經秩蛋白(neurturin)、神經生長因子(NGF)、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、甲狀旁腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-鈣黏著蛋白、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤堿性磷酸酶(PLAP)、PlGF、PLP、PP14、胰島素原、松弛素原、蛋白C、PS、PSA、PSCA、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、松弛素A鏈、松弛素B鏈、腎素、呼吸合胞病毒(RSV)F、RSVFgp、Ret、類風濕因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(腫瘤相關糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T細胞受體(例如T細胞受體α/β)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睪丸PLAP樣堿性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、泛特異性TGF-β、TGF-βRI(ALK-5)、TGF-βRII、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、凝血酶、胸腺Ck-1、促甲狀腺激素、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-α/β、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAILR1Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAILR2DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAILR3DcR1,LIT,TRID)、TNFRSF10D(TRAILR4DcR2,TRUNDD)、TNFRSF11A(RANKODFR,TRANCER)、TNFRSF11B(OPGOCIF,TR1)、TNFRSF12(TWEAKRFN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFFR)、TNFRSF14(HVEMATAR,HveA,LIGHTR,TR2)、TNFRSF16(NGFRp75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITRAITR)、TNFRSF19(TROYTAJ,TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNFRICD120a,p55-60)、TNFRSF1B(TNFRIICD120b,p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbRTNFRIII,TNFCR)、TNFRSF4(OX40ACT35,TXGP1R)、TNFRSF5(CD40p50)、TNFRSF6(FasApo-1,APT1,CD95)、TNFRSF6B(DcR3M68,TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BBCD137,ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAILR2TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAILR1TNFRH1)、TNFRSF25(DR3Apo-3,LARD,TR-3,TRAMP,WSL-1)、TNFSF10(TRAILApo-2配體,TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配體ODF、OPG配體)、TNFSF12(TWEAKApo-3配體,DR3配體),TNFSF13(APRILTALL2)、TNFSF13B(BAFFBLYS,TALL1,THANK,TNFSF20)、TNFSF14(LIGHTHVEM配體,LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配體AITR配體,TL6)、TNFSF1A(TNF-a連接蛋白,DIF,TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-bLTa,TNFSF1)、TNFSF3(LTbTNFC,p33)、TNFSF4(OX40配體gp34,TXGP1)、TNFSF5(CD40配體CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配體Apo-1配體、APT1配體)、TNFSF7(CD27配體CD70)、TNFSF8(CD30配體CD153)、TNFSF9(4-1BB配體CD137配體)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAILR、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、轉鐵蛋白受體、TRF、Trk、TROP-2、TLR(toll樣受體)1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TSG、TSLP、腫瘤相關抗原Ca125、路易斯-Y相關碳水化合物的腫瘤相關抗原表達、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-鈣黏著蛋白、VE-鈣黏著蛋白-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整聯蛋白、馮維勒布蘭德因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、A、CD81、CD97、CD98、DDR1、DKK1、EREG、Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化的LDL、PCSK9、激肽釋放酶原、RON、TMEM16F、SOD1、嗜鉻粒蛋白A、嗜鉻粒蛋白B、tau、VAP1、高分子量激肽原、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1、C1q、C1r、C1s、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、因子B、因子D、因子H、備解素、硬化蛋白、纖維蛋白原、纖維蛋白、凝血酶原、凝血酶、組織因子、因子V、因子Va、因子VII、因子VIIa、因子VIiI、因子VIIIa、因子IX、因子IXa、因子X、因子Xa、因子XI、因子XIa、因子XII、因子XIIa、因子XIII、因子XIIIa、TFPI、抗凝血酶III、EPCR、血栓調節蛋白、TAPI、tPA、纖維蛋白溶酶原、纖溶酶、PAI-1、PAI-2、GPC3、黏結蛋白聚糖-1、黏結蛋白聚糖-2、黏結蛋白聚糖-3、黏結蛋白聚糖-4、LPA、S1P和激素或生長因子的受體。盡管上面列出的抗原的實例還包括受體,但甚至以可溶形式存在于體液中的這些受體也可以用作本發明的抗原結合結構域所結合的抗原。上面列出的抗原的實例包括在細胞膜上表達的膜分子和從細胞分泌到細胞外的可溶性分子。當本公開的抗原結合結構域與細胞分泌的可溶性分子結合時,抗原結合結構域優選具有中和活性。對含有可溶性分子的溶液沒有限制,該可溶性分子可以存在于體液中,即每一種血管液體或每一種填充在活體的組織或細胞之間的液體。在非限制性方面,本公開的抗原結合結構域所結合的可溶性分子可以存在于細胞外液中。細胞外液是指脊椎動物中血漿、細胞間液、淋巴液、緊密結締組織、腦脊液、脊髓液、抽吸物、滑液或骨和軟骨中的此類成分、肺泡液(支氣管肺泡灌洗液)、腹水、胸腔積液、心包積液、囊液、眼房水(水狀液)或此類跨細胞液(由于細胞的主動運輸或分泌活動而產生的腺腔中的各種液體,以及腸腔和其他體腔中的液體)的總稱。在本說明書中,術語“攜帶部分”是指多肽中除抗原結合結構域之外的部分。本公開的攜帶部分通常為由氨基酸構成的肽或多肽。在具體實施方案中,多肽中的攜帶部分通過蛋白酶切割序列與抗原結合結構域連接。本公開的攜帶部分可以是一系列通過酰胺鍵連接的肽或多肽,也可以是由多個肽或多肽通過共價鍵如二硫鍵或非共價鍵例如氫鍵或疏水相互作用形成的復合物。本公開的攜帶部分具有抑制抗原結合結構域的抗原結合活性的抑制結構域。在本說明書中,術語“抑制結構域”僅限于抑制抗原結合結構域的抗原結合活性。抑制結構域可以是具有任何結構的結構域,只要所使用的結構域可以抑制抗原結合結構域的抗原結合活性。這種抑制結構域的實例包括但不限于抗體重鏈可變區(VH)、抗體輕鏈可變區(VL)、前B細胞受體和單域抗體。抑制結構域可以構成整個攜帶部分或可以構成攜帶部分的一部分。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,在蛋白酶切割序列被蛋白酶切割的狀態下抑制結構域對抗原結合結構域的抗原結合活性的抑制弱于在蛋白酶切割序列未被切割的狀態下抑制結構域對抗原結合結構域的抗原結合活性的抑制。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,抗原結合結構域比未切割的多肽具有更短的血液半衰期。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,抗原結合結構域比攜帶部分具有更短的血液半衰期。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,抗原結合結構域比攜帶部分具有更低的分子量。在某些實施方案中,抗原結合結構域的分子量為60kDa或更小。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,攜帶部分具有FcRn結合活性,而抗原結合結構域不具有FcRn結合活性或比攜帶部分具有較弱的FcRn結合活性。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,包含抗原結合結構域和攜帶部分的多肽比單獨存在的抗原結合結構域具有更長的血液中的半衰期。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,攜帶部分被設計為為了多肽的半衰期更長,具有更長的血液中的半衰期。在這樣的實施方案中,延長攜帶部分在血液中的半衰期的方法的實例包括但不限于大分子量的攜帶部分、攜帶部分具有的FcRn結合活性、攜帶部分具有的白蛋白結合活性,以及攜帶部分的聚乙二醇化。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,攜帶部分比抗原結合結構域在血液中的半衰期更長(換言之,抗原結合結構域比攜帶部分具有更短的在血液中的半衰期)。在本公開中,單獨的抗原結合結構域和多肽的半衰期,或抗原結合結構域和攜帶部分在血液中的半衰期優選與人類中其在血液中的半衰期進行比較。如果血液中的半衰期在人類難以測量,則可以根據其在小鼠(例如,正常小鼠、表達人類抗原的轉基因小鼠和表達人FcRn的轉基因小鼠)或猴子(例如食蟹猴)血液中的半衰期來預測在人類血液中的半衰期。在一個實施方案中,延長攜帶部分在血液中的半衰期的方法包括大分子量的攜帶部分。在一個實施方案中,使攜帶部分在血液中的半衰期長于抗原結合結構域的方法包括使攜帶部分的分子量高于抗原結合結構域的分子量。在一個實施方案中,延長攜帶部分在血液中的半衰期的方法包括賦予攜帶部分FcRn結合活性。通過在攜帶部分中建立FcRn結合區的方法,攜帶部分通??梢跃哂蠪cRn結合活性。攜帶部分具有的FcRn結合活性并不意味著抗原結合結構域沒有FcRn結合活性。在攜帶部分比抗原結合結構域具有更長的血液半衰期的實施方案中,抗原結合結構域當然可以不具有FcRn結合活性,或者抗原結合結構域可以具有FcRn結合活性,只要FcRn結合活性弱于攜帶部分的FcRn結合活性。在一個實施方案中,延長攜帶部分的血液中的半衰期的方法涉及使攜帶部分與白蛋白結合。由于白蛋白不經過腎臟排泄并具有FcRn結合能力,其在血液中的半衰期長達17天至19天(JClinInvest.1953Aug;32(8):746-768)。因此,據報道,與白蛋白結合的蛋白質變得龐大并能夠間接與FcRn結合,因此在血液中的半衰期增加(Antibodies2015,4(3),141-156)。在一個實施方案中,用于延長攜帶部分在血液中的半衰期的備選方法涉及使攜帶部分聚乙二醇化。蛋白質的聚乙二醇化被認為會使蛋白質變大,還可以抑制血液中蛋白酶引起的降解,從而延長蛋白質在血液中的半衰期(JPharmSci.2008Oct;97(10):4167-83)。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,攜帶部分包含抗體Fc區。在具體實施方案中,攜帶部分包含人IgG抗體的CH2結構域和CH3結構域。在具體實施方案中,攜帶部分包含從人IgG1抗體重鏈Cys226或Pro230延伸至重鏈羧基末端的部分。然而,Fc區的C-末端賴氨酸(Lys447)或甘氨酸-賴氨酸(Gly446-Lys447)可能存在也可能不存在。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,攜帶部分包含抗體恒定區。在更優選的實施方案中,攜帶部分包含IgG抗體恒定區。在進一步優選的實施方案中,攜帶部分包含人IgG抗體恒定區。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,攜帶部分包含:結構上與抗體重鏈恒定區基本相似的區域;和在結構上與抗體輕鏈基本相似的區域,所述區域通過共價鍵如二硫鍵或非共價鍵如氫鍵或疏水相互作用連接到該區域。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,抗原結合結構域可以從多肽中釋放出來,并在抗原結合結構域從多肽中釋放出來的狀態下比其不從多肽中釋放出來的狀態下的抗原結合結構域具有更高的抗原結合活性。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,由于蛋白酶切割蛋白酶切割序列,抗原結合結構域變得可從多肽釋放。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,從多肽釋放的抗原結合結構域比釋放前具有更高的抗原結合活性。換言之,抗原結合結構域的抗原結合活性在抗原結合結構域未從多肽釋放的狀態下被抑制結構域抑制??乖Y合結構域的抗原結合活性是否被抑制結構域抑制通過方法例如FACS(熒光激活細胞分選)、ELISA(酶聯免疫吸附測定)、ECL(電致化學發光)、SPR(表面等離振子共振)方法(Biacore)、BLI(生物層干涉)(Octet)方法確認。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,從多肽釋放的抗原結合結構域的抗原結合活性的值為等于或大于未從多肽釋放的抗原結合結構域的結合活性的兩倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍或3000倍。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,當抗原結合結構域的抗原結合活性通過從上述方法中選擇的一種方法來測量時,未觀察到釋放前抗原結合結構域與抗原的結合。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,蛋白酶切割序列被切割,使得抗原結合結構域變得能夠從多肽釋放。因此,在這些方面,可以比較多肽切割之前和之后的抗原結合活性。具體地,使用切割的多肽測量的抗原結合活性是等于或大于使用未切割多肽測量的抗原結合活性的2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍或3000倍的值。在一些更具體的實施方案中,當通過選自上述方法中的一種方法測量抗原結合活性時,未觀察到未切割多肽的抗原結合結構域與抗原的結合。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,蛋白酶切割序列被蛋白酶切割。因此,在這些方面,可以比較多肽的蛋白酶處理之前和之后的抗原結合活性。具體地,使用蛋白酶處理后的多肽測定的抗原結合活性為等于或大于使用未經蛋白酶處理的多肽測得的抗原結合活性的2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍或3000倍的值。在一些更具體的實施方案中,當通過選自上述方法中的一種方法測量抗原結合活性時,未觀察到未經蛋白酶處理的多肽的抗原結合結構域與抗原的結合。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,抗原結合結構域的抗原結合活性通過抗原結合結構域與攜帶部分的抑制結構域的締合而受到抑制。在某些實施方案中,當本公開內容的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,抗原結合結構域和攜帶部分的抑制結構域之間的締合通過蛋白酶對蛋白酶裂解序列的切割而消除。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,抗原結合結構域包含或是單域抗體,并且攜帶部分的抑制域抑制單域抗體的抗原結合活性。單域抗體可以是VHH,或通過其單域具有抗原結合活性的VH,或通過其單域具有抗原結合活性的VL。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,攜帶部分的抑制結構域與抗原結合結構域締合。抑制結構域可以構成攜帶部分的一部分或可以構成攜帶部分的全部。從另一個角度來看,抑制結構域也可以定義為攜帶部分中與抗原結合結構域締合的部分。在更具體的實施方案中,作為單域抗體的抗原結合結構域和作為VL、VH或VHH的抑制結構域形成抗體VH和抗體VL之間發現的締合。在進一步具體的實施方案中,作為單域抗體的抗原結合結構域和作為VL、VH或VHH的抑制結構域形成抗體VH和抗體VL之間所發現的締合,在處于如此形成的締合狀態下,抑制結構域在構象上抑制抗原結合結構域與抗原的結合或在構象上改變抗原結合結構域的抗原結合位點,使得單域抗體的抗原結合活性被VL、VH或VHH抑制。在使用VHH作為單域抗體的實施方案中,當VHH的主要抗原結合位點CDR3或其鄰近位點存在于與抑制結構域締合的界面時,認為VHH與抗原的結合受到抑制結構域的構象抑制。例如,可以通過切割切割位點來消除抗原結合結構域與抑制結構域的締合。締合的消除可以與例如兩個或更多個多肽區域彼此相互作用的狀態的消除互換使用。兩個或多個多肽區域之間的相互作用可以完全消除,或者兩個或多個多肽區域之間的相互作用可以部分消除。在本說明書中,“界面”通常是指兩個區域相互關聯或相互作用的表面。形成界面的氨基酸殘基通常是指進行締合的每個多肽區域中包含的一個或多個氨基酸殘基,更優選地是指締合時彼此接近并參與相互作用的氨基酸殘基。具體地,相互作用包括非共價鍵,例如氫鍵、靜電相互作用或締合時彼此接近的氨基酸殘基之間的鹽橋形成。在本說明書中,“形成界面的氨基酸殘基”具體指構成界面的多肽區域中所含的氨基酸殘基。作為一個實例,構成界面的多肽區域是指負責抗體、配體、受體、底物等中分子內或分子間選擇性結合的多肽區域??贵w中此類多肽區域的具體實例可以包括重鏈可變區和輕鏈可變區。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,實例包括抗原結合結構域和抑制結構域。形成界面的氨基酸殘基的實例包括但不限于在締合時彼此接近的氨基酸殘基。例如,通過分析多肽的構象和檢查多肽締合時形成界面的多肽區域的氨基酸序列,可以發現締合時彼此接近的氨基酸殘基。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,抗原結合結構域中參與締合的氨基酸殘基,或抑制結構域中參與締合的氨基酸殘基可以被改變/修飾以促進抗原結合結構域與抑制結構域的締合。在進一步具體實施方案中,在抗原結合結構域中形成與抑制結構域的界面的氨基酸殘基,或在抑制結構域中與抗原結合結構域形成界面的氨基酸殘基可以被改變。在優選的實施方案中,形成界面的氨基酸殘基可以通過將突變引入界面氨基酸殘基的方法來改變,使得形成界面的兩個或更多個氨基酸殘基具有不同的電荷。導致不同電荷的氨基酸殘基的改變包括帶正電荷的氨基酸殘基改變為帶負電荷的氨基酸殘基或不帶電荷的氨基酸殘基、帶負電荷的氨基酸殘基改變為帶正電荷的氨基酸殘基或不帶電荷的氨基酸殘基,以及不帶電荷的氨基酸殘基改變為帶正電荷或帶負電荷的氨基酸殘基。這樣的氨基酸改變是出于促進締合的目的而進行的,只要能夠達到促進締合的目的,就不受氨基酸改變的位置或氨基酸的種類的限制。改變的實例包括但不限于取代。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,作為抗原結合結構域的VHH與作為抑制結構域的VL締合。在VHH中與VL締合的氨基酸殘基可以指例如形成VHH和VL之間的界面的氨基酸殘基。VHH中與VL締合的氨基酸殘基的實例包括但不限于第37、44、45和47位的氨基酸殘基(J.Mol.Biol.(2005)350,112-125)。VHH的活性通過促進VHH和VL之間的締合而受到抑制。同樣,VL中與VHH締合的氨基酸殘基可以指例如形成VHH和VL之間界面的氨基酸殘基??梢愿淖冊赩HH中與VL締合的氨基酸殘基,以促進VHH和VL之間的締合。這種氨基酸取代的實例包括但不限于F37V、Y37V、E44G、Q44G、R45L、H45L、G47W、F47W、L47W、T47W或/和S47W。代替改變VHH中的每個殘基,也可以使用最初具有氨基酸殘基37V、44G、45L或/和47W的VHH。代替VHH氨基酸,VL中參與與VHH締合的氨基酸殘基可以被改變,也可以將氨基酸改變引入VHH和VL兩者,只要是出于實現促進VHH和VL之間的締合的目的。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,抗原結合結構域和抑制結構域可以通過使用VHH作為抗原結合結構域并使用VH或VHH作為抑制結構域彼此締合??梢澡b定和改變在作為抗原結合結構域的VHH中與作為抑制結構域的VH或VHH締合中涉及的氨基酸殘基,以促進抗原結合結構域VHH與抑制結構域VH或VHH的締合。此外,可以鑒定和改變作為抑制結構域的VH或VHH中,與作為抗原結合結構域的VHH締合中涉及的氨基酸殘基。在使用VHH以外的單域抗體作為抗原結合結構域的情況下,也可以與上述類似地鑒定和改變抗原結合結構域或抑制結構域中參與締合的氨基酸殘基。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,攜帶部分和抗原結合結構域通過接頭融合。在更具體的實施方案中,攜帶部分和抗原結合結構域通過含有蛋白酶切割序列的接頭融合。在備選的具體實施方案中,攜帶部分和抗原結合結構域通過接頭融合,由此形成的融合蛋白含有蛋白酶切割序列。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,攜帶部分和抗原結合結構域在沒有接頭的情況下融合。在更具體的實施方案中,在攜帶部分的N端氨基酸與抗原結合結構域的C端氨基酸之間形成氨基鍵以形成融合蛋白。形成的融合蛋白包含蛋白酶切割序列。在特定的實施方案中,攜帶部分的一到數個N端氨基酸或/和抗原結合結構域的一到數個C端氨基酸被改變,并且攜帶部分的N端和抗原結合結構域的C端融合以在融合位置附近形成蛋白酶切割序列。更具體地,當使用LSGRSDNH(SEQIDNO:18031)作為蛋白酶切割序列時,可以通過例如將抗原結合結構域的四個C端氨基酸轉化為LSGR序列并將攜帶部分的四個N端氨基酸轉化為SDNH序列來形成蛋白酶切割序列。當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,蛋白酶切割序列可以置于多肽中的任何位置,只要抗原結合結構域被蛋白酶切割釋放并且在釋放后不失去其抗原結合活性。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,攜帶部分包含抗體恒定區,抗體恒定區的N端并且抗原結合結構域的C端通過接頭或不通過接頭融合。在特定的實施方案中,蛋白酶切割序列位于攜帶部分中包含的抗體恒定區內。在這種情況下,蛋白酶切割序列可以位于抗體恒定區內,從而通過蛋白酶切割釋放抗原結合結構域。在具體的實施方案中,蛋白酶切割序列位于攜帶部分中包含的抗體重鏈恒定區內,更具體地,位于抗體重鏈恒定區內更靠近抗原結合結構域的一側,超過第140位的氨基酸(EU編號),或在抗體重鏈恒定區中靠近抗原結合結構域的一側,超過122位的氨基酸(EU編號)。在備選的具體實施方案中,蛋白酶切割序列位于攜帶部分中包含的抗體輕鏈恒定區內,更具體地位于抗體輕鏈恒定區內靠近抗原結合域的一側,超過130位的氨基酸(Kabat編號),或在抗體輕鏈恒定區中靠近抗原結合結構域的一側,超過113位氨基酸(Kabat編號)。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,抗原結合結構域是單域抗體,并且單域抗體的C端和攜帶部分的N端通過接頭或不通過接頭融合。在特定的實施方案中,蛋白酶切割序列位于單域抗體內。在更具體的實施方案中,單域抗體為由VH或VHH制備的單域抗體,蛋白酶切割序列位于單域抗體中靠近攜帶部分的一側,超過35b位的氨基酸(Kabat編號),或在單域抗體中靠近攜帶部分的一側,超過95位的氨基酸(Kabat編號),或在單域抗體中靠近攜帶部分的一側,超過109位的氨基酸(Kabat編號)。在備選的具體實施方案中,單域抗體是由VL制備的單域抗體,蛋白酶切割序列位于單域抗體中靠近攜帶部分的一側,超過32位的氨基酸(Kabat編號),或在單域抗體中靠近攜帶部分的一側,超過91位的氨基酸(Kabat編號),或在單域抗體中靠近攜帶部分的一側,超過104位的氨基酸(Kabat編號)。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,攜帶部分包含抗體恒定區,抗原結合結構域為單域抗體,并且抗體恒定區和單域抗體通過接頭或不通過接頭融合。在更具體的實施方案中,抗體恒定區的N端和單域抗體的C端通過接頭或不通過接頭融合。在備選的具體實施方案中,抗體恒定區的C端和單域抗體的N端通過接頭或不通過接頭融合。在特定的實施方案中,蛋白酶切割序列位于攜帶部分中包含的抗體恒定區內。在更具體的實施方案中,蛋白酶切割序列位于抗體重鏈恒定區中更靠近單域抗體的一側,超過第140位的氨基酸(EU編號),或在抗體重鏈恒定區中更靠近單域抗體的一側,超過122位的氨基酸(EU編號)。在備選的具體實施方案中,蛋白酶切割序列位于抗體輕鏈恒定區中更靠近抗原結合結構域的一側,超過130位的氨基酸(Kabat編號),或在抗體輕鏈恒定區中更靠近抗原結合結構域的一側,超過113位的氨基酸(Kabat編號)。在特定的實施方案中,蛋白酶切割序列位于單域抗體內。在更具體的實施方式中,單域抗體是由VH或VHH制備的單域抗體,蛋白酶切割序列位于單域抗體中更靠近抗體恒定區的一側,超過35b位的氨基酸(Kabat編號),或在單域抗體中更靠近抗體恒定區一側,超過95位的氨基酸(Kabat編號),或在單域抗體中更靠近抗體恒定區的一側,超過109位的氨基酸(Kabat編號)。在備選的實施方案中,單域抗體是由VL制備的單域抗體,蛋白酶切割序列位于單域抗體中更靠近抗體恒定區的一側,超過32位的氨基酸(Kabat編號),或在單域抗體中更靠近抗體恒定區一側,超過91位的氨基酸(Kabat編號),或在單域抗體中更靠近抗體恒定區的一側,超過104位的氨基酸(Kabat編號)。在特定的實施方案中,蛋白酶切割序列位于抗原結合結構域和攜帶部分之間的邊界附近。短語“抗原結合結構域和攜帶部分之間的邊界附近”是指位于抗原結合結構域和攜帶部分之間連接位點上游或下游的部分,并且不會很大地影響抗原結合結構域的二級結構。在更具體的實施方式中,抗原結合結構域與攜帶部分中包含的抗體恒定區連接,蛋白酶切割序列位于抗原結合結構域與抗體恒定區之間的邊界附近。短語“抗原結合結構域和抗體恒定區之間的邊界附近”可以指靠近抗原結合結構域和抗體重鏈恒定區之間的邊界,或靠近抗原結合結構域和抗體輕鏈恒定區之間的邊界。當抗原結合結構域是由VH或由VHH制備的單域抗體,并且與抗體重鏈恒定區連接時,短語“抗原結合結構域與抗體恒定區之間的邊界附近”可以指在單域抗體的101位的氨基酸(Kabat編號)與抗體重鏈恒定區的140位的氨基酸(EU編號)之間或可以指單域抗體的109位的氨基酸(Kabat編號)和抗體重鏈恒定區的122位氨基酸(EU編號)之間。當抗原結合結構域是由VH或由VHH制備的單域抗體并且與抗體輕鏈恒定區連接時,短語“抗原結合結構域與抗體輕鏈恒定區之間的邊界附近”可以指在單域抗體的101位的氨基酸(Kabat編號)與抗體輕鏈恒定區的130位的氨基酸(Kabat編號)之間或可以指單域抗體的109位(Kabat編號)的氨基酸和抗體輕鏈恒定區的113位氨基酸(Kabat編號)之間。當抗原結合結構域是由VL制備的單域抗體時,短語“抗原結合結構域和抗體恒定區之間的邊界附近”是指單域抗體的96位的氨基酸(Kabat編號)和抗體恒定區的規定位置之間,或單域抗體的104位的氨基酸(Kabat編號)和抗體恒定區的規定位置之間。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,該多肽是IgG抗體樣分子。此類實施方案的實例包括但不限于:其中攜帶部分包含IgG抗體恒定區、用作抗原結合結構域的單域抗體代替IgG抗體的VH,以及抗原結合活性被VL抑制的實施方案;其中攜帶部分包含IgG抗體恒定區,作為抗原結合結構域的單域抗體代替了IgG抗體的VL,并且抗原結合活性被VH抑制的實施方案;以及其中攜帶部分包含IgG抗體恒定區,用作抗原結合結構域的單域抗體代替IgG抗體的VH和VL之一,并且額外的單域抗體抑制抗原結合結構域的抗原結合活性代替了IgG抗體的其它結構域的實施方案。本說明書中使用的術語“IgG抗體樣分子”用于定義具有在結構上與IgG抗體中的恒定結構域或恒定區基本相似的部分,以及在結構上與IgG抗體中可變結構域或可變區基本相似的部分,并且與IgG抗體具有基本相似的構象的分子。在IgG抗體樣分子中,與抗體CH1相似的結構域和與CL相似的結構域可以互換使用;即,只要結構域之間存在類似于IgG抗體的CH1和CL之間相互作用的相互作用,與抗體鉸鏈區相似部分連接的結構域可以是抗體CH1結構域或抗體CL結構域。然而,在本說明書中,“IgG抗體樣分子”可以在保留與IgG抗體類似的結構的同時發揮或不發揮抗原結合活性。當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,該多肽可包含一個或多個抗原結合結構域。一個或多個抑制結構域可以抑制多個抗原結合結構域的抗原結合活性。多個抗原結合結構域可以各自與抑制結構域締合。多個抗原結合結構域可以各自與攜帶部分融合。多個抗原結合結構域可以各自能夠從多肽中釋放。用于釋放多個抗原結合結構域的蛋白酶切割序列可以是與抗原結合結構域的數量相對應的多個蛋白酶切割序列。當多肽為IgG抗體樣分子時,可以在對應于IgG抗體的兩個可變區的部分分別建立抗原結合結構域,如圖3所示。本領域技術人員參考本公開應該理解這樣的實施方案。摻入兩個臂的抗原結合結構域可以具有相同的抗原結合特異性或可以在抗原結合特異性方面不同。本領域技術人員參考本公開應該理解這樣的實施方案。顯然,這些實施方案包括在本公開的范圍內。在某些實施方案中,當本公開的多肽包含抗原結合結構域和攜帶部分時,抗原結合結構域進一步連接至第二抗原結合結構域。第二抗原結合結構域的實例包括但不限于單域抗體,抗體片段,包含在體內細胞膜蛋白avimer中的大約35個氨基酸的稱為A結構域的模塊(WO2004/044011和WO2005/040229),作為蛋白結合結構域來源于在細胞膜上表達的糖蛋白纖連蛋白的含有10Fn3結構域的adnectin(WO2002/032925),含有構成由蛋白A的58個氨基酸組成的三螺旋束的IgG結合結構域支架的Affibody(WO1995/001937),DARPins(設計的錨蛋白重復蛋白),其是錨蛋白重復(AR)的分子表面暴露區域,每個區域具有33個氨基酸殘基結構,其折疊成轉角、兩個反平行螺旋和環的亞基(WO2002/020565),anticalin,其具有四個環區域,連接著在桶狀結構一端向中心軸彎曲的8條反平行鏈,所述桶狀結構在脂質運載蛋白分子例如中性粒細胞明膠酶相關運載蛋白(NGAL)中高度保守(WO2003/029462),以及在無頜脊椎動物如七鰓鰻或盲鰻的獲得性免疫系統中看到的無免疫球蛋白結構的可變淋巴細胞受體(VLR)的由重復的富含亮氨酸重復(LRR)模塊組成的馬蹄形折疊的內部平行片狀結構中的凹陷區域(WO2008/016854)。在優選的實施方案中,第二抗原結合結構域具有與抗原結合結構域不同的抗原結合特異性。在優選的實施方案中,連接的抗原結合結構域和第二抗原結合結構域的分子量為60kDa或更小。在一些更具體的實施方案中,抗原結合結構域和第二抗原結合結構域是抗原結合特異性不同的單域抗體,連接的抗原結合結構域和第二抗原結合結構域能夠從多肽中釋放出來,釋放后抗原結合結構域和第二抗原結合結構域形成雙特異性抗原結合分子。這種雙特異性抗原結合分子的實例包括但不限于具有特異性結合靶細胞表面抗原的抗原結合結構域和特異性結合免疫細胞表面抗原的第二抗原結合結構域的雙特異性抗原結合分子,具有結合同一抗原的不同亞基的抗原結合結構域和第二抗原結合結構域的雙特異性抗原結合分子,以及具有與同一抗原中的不同表位結合的抗原結合結構域和第二抗原結合結構域的雙特異性抗原結合分子。這種雙特異性抗原結合分子可以將免疫細胞募集到靶細胞附近,因此被認為可用于治療由靶細胞引起的疾病。第二抗原結合結構域的抗原結合活性可以被或可以不被攜帶部分抑制。第二抗原結合結構域可以與或不與攜帶部分的部分結構相締合。特別地,當抗原結合結構域和第二抗原結合結構域的抗原結合特異性不同時,未釋放狀態的抗原結合結構域不能發揮抗原結合活性,例如,如圖4所示,即使第二抗原結合結構域的抗原結合活性不會受到抑制,即使第二抗原結合結構域不與攜帶部分的部分結構締合。這種包含與第二抗原結合結構域連接的抗原結合結構域的雙特異性抗原結合分子不能發揮與兩種類型的抗原雙特異性結合的功能。圖4示出了一種示例性形式,其中抗原結合結構域進一步連接到第二抗原結合結構域。在本說明書中,術語“特異性”是指一種特性,通過該特性,特異性結合分子之一基本上不與除其一個或多個結合伴侶分子以外的分子結合。當抗原結合結構域對包含在特定抗原中的表位具有特異性時,也使用該術語。當抗原結合結構域對抗原中包含的多個表位中的特定表位具有特異性時,也使用該術語。在本文中,術語“基本上不結合”是根據關于結合活性的章節中描述的方法確定的,并且是指特異性結合分子對結合伴侶以外的分子的結合活性為其對結合伴侶分子的結合活性的80%或更少,通常50%或更少,優選30%或更少,特別優選15%或更少。SEQIDNO:5-18003中任一項所示的序列,或包含在那些序列中的可用作蛋白酶切割序列的部分序列(跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4個至第15個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第6至第13個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第1至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第12個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第11個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第10個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第3至第14個氨基酸的序列;跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第12個氨基酸的序列;和跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第10個氨基酸的序列)可以用作圖1所示多肽中的蛋白酶切割位點。而且,從N-末端開始順序為“選自下述A組的序列-選自下述B組的序列”組成的序列可以用作圖1所示的多肽中的蛋白酶切割位點:(A組)跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第1至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第2至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第3至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第4至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第5至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第6至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第7至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第8至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第1至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第2至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第3至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第4至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第5至第6個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第1至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第2至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第3至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第4至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第5至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第6至第8個氨基酸的序列,和跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第7至第8個氨基酸的序列;(B組)跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第15個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第14個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第13個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第12個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:5-17201的序列的N端第10至第11個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第15個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第14個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第13個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第12個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第11個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第10個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第9個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17202-17993的序列的N端第7至第8個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第15個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第14個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第13個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第12個氨基酸的序列,跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第11個氨基酸的序列,和跨越選自SEQIDNO:17994-18003的序列的N端第9至第10個氨基酸的序列。圖1所示的分子在是抗原結合結構域和攜帶部分連接的狀態的多肽時,其具有長半衰期。在該狀態下,抗原結合結構域的抗原結合活性被抑制,分子不與抗原結合(A)??乖Y合結構域釋放后,抗原結合活性恢復,半衰期變短(B)。盡管圖1所示的多肽有許多變化,但當使用IgG抗體樣分子時,可以按照圖2所示的生產方法生產。最初,獲得與靶抗原結合的單域抗體(例如,VH或VHH)(A)。具有種系序列的IgG抗體的VH和VL中的任何一個被所獲得的單域抗體替換,然后與VH和VL中的另一個締合以形成IgG抗體樣分子(B)。將蛋白酶切割序列引入IgG抗體樣分子(C)。引入位置例如可以是引入的單域抗體(VH或VHH)與恒定區(CH1或CL)之間的邊界附近。單域抗體在作為單域存在時具有抗原結合活性;然而,當它與例如VL/VH/VHH形成可變區時,它會失去抗原結合活性??紤]到VL/VH是具有種系序列的天然人抗體序列,免疫原性風險低,誘導識別VL/VH的抗藥物抗體的可能性極低。此外,當使用VHH與單域抗體一起形成可變區時,VHH的人源化可以降低免疫原性風險,并且可以降低誘導識別人源化VHH的抗藥物抗體的可能性。單域抗體通過蛋白酶切割插入IgG抗體樣分子中的蛋白酶切割序列而釋放。如此釋放的單域抗體具有抗原結合活性。IgG抗體樣分子在被蛋白酶切割前具有與一般IgG分子相似的結構,因此在血液中具有長的滯留性,而蛋白酶切割釋放的單域抗體不具有任何Fc區,其分子量大約13kDa,因此通過腎臟排泄迅速清除。事實上,雖然全長IgG的半衰期約為2-3周(Blood.,Mar31,2016,127(13):1633-41),但單域抗體的半衰期約為2小時(Antibodies,2015,4(3):141-156)。因此,被蛋白酶激活的抗原結合分子在血液中的半衰期較短,與正常組織中的抗原結合的可能性較小。當單域抗體是VL時,可以通過例如在VL和CL之間的邊界附近引入蛋白酶切割序列來獲得相同的概念。本公開還涉及當多肽包含具有抑制結構域的攜帶部分和抗原結合結構域時生產多肽的方法。一種生產包含具有抑制結構域的攜帶部分和抗原結合結構域的本公開多肽的方法是包括以下步驟的方法:獲得具有抗原結合活性的抗原結合結構域;將抗原結合結構域與攜帶部分連接,使得抗原結合結構域的抗原結合活性被抑制結構域抑制,以形成多肽前體;進一步將蛋白酶切割序列插入多肽前體或將多肽前體的一部分改變為蛋白酶切割序列。引入蛋白酶切割序列的方法可以是插入蛋白酶切割序列和改變多肽前體的一部分中的任何一種,只要蛋白酶切割序列可以被引入多肽前體中?;蛘?,可以通過兩種方法的組合將蛋白酶切割序列引入多肽前體中。這樣的實施方案對于本領域技術人員參考本說明書應該是顯而易見的,并且包括在本公開的范圍內。包含具有抑制結構域的攜帶部分和抗原結合結構域的本公開多肽的另一種生產方法是包括以下步驟的方法:獲得具有抗原結合活性的抗原結合結構域;通過蛋白酶切割序列將抗原結合結構域與攜帶部分連接,使得抗原結合結構域的抗原結合活性被抑制結構域抑制,以形成多肽。當抗原結合結構域通過蛋白酶切割序列與攜帶部分連接時,蛋白酶切割序列可以夾在抗原結合結構域和攜帶部分之間,或抗原結合結構域的一部分或/和攜帶部分的一部分可以被改變并用作蛋白酶切割序列的一部分。在使用單域抗體作為抗原結合結構域的實施方案中,包含具有抑制結構域的攜帶部分和抗原結合結構域的多肽的生產方法如下所述。在本公開的一個實施方案中,包含具有抑制結構域的攜帶部分和抗原結合結構域的多肽的生產方法是包括以下步驟的生產方法:(a)獲得與靶抗原結合的單域抗體;(b)將步驟(a)中獲得的單域抗體與攜帶部分連接,使得單域抗體的抗原結合活性被攜帶部分的抑制結構域抑制,形成多肽前體;和(c)將蛋白酶切割序列引入多肽前體中。在本公開的一個實施方案中,包含具有抑制結構域的攜帶部分和抗原結合結構域的多肽的生產方法是包括以下步驟的生產方法:(a)獲得與靶抗原結合的單域抗體;(b)將步驟(a)中獲得的單域抗體與攜帶部分連接,使得單域抗體的抗原結合活性被攜帶部分的抑制結構域抑制,以形成多肽前體;和(c)在單域抗體和攜帶部分之間的邊界附近引入蛋白酶切割序列。在本公開的一個實施方案中,包含具有抑制結構域的攜帶部分和抗原結合結構域的多肽的生產方法是包括以下步驟的生產方法:(a)獲得與靶抗原結合的單域抗體;和(b)將步驟(a)中獲得的單域抗體通過蛋白酶切割序列與攜帶部分連接,使得單域抗體的抗原結合活性被攜帶部分的抑制結構域抑制,以形成多肽。在特定實施方案中,包含具有抑制結構域的攜帶部分和抗原結合結構域的多肽的生產方法是還包括以下步驟的生產方法:(d)確認摻入多肽或多肽前體中的單域抗體對靶抗原的結合活性減弱或喪失。在本公開中,短語“結合活性減弱”是指與連接前相比,對靶抗原的結合活性降低,并且該降低的程度沒有限制。在特定實施方案中,包含具有抑制結構域的攜帶部分和抗原結合結構域的多肽的生產方法是還包括以下步驟的生產方法:(e)通過蛋白酶切割蛋白酶切割序列釋放單域抗體并確認釋放的單域抗體與抗原結合。在本公開的一個實施方案中,為包含具有抑制結構域的攜帶部分和抗原結合結構域的IgG抗體樣分子的多肽的生產方法是包括以下步驟的生產方法:(a)獲得與靶抗原結合的單域抗體;(b)使步驟(a)中獲得的單域抗體與VL締合作為IgG抗體的VH的替代物,或使單域抗體與VH締合作為IgG抗體的VL的替代物,從而抑制單域抗體的抗原結合活性,以形成包含單域抗體的IgG抗體樣分子前體;和(c)將蛋白酶切割序列引入含有單域抗體的IgG抗體樣分子前體中。在本公開的一個實施方案中,為包含具有抑制結構域的攜帶部分和抗原結合結構域的IgG抗體樣分子的多肽的生產方法是包括以下步驟的生產方法:(a)獲得與靶抗原結合的單域抗體;(b)使步驟(a)中獲得的單域抗體與VL締合作為IgG抗體的VH的替代物,或使單域抗體與VH締合作為IgG抗體的VL替代物,從而抑制單域抗體的抗原結合活性,以形成包含單域抗體的IgG抗體樣分子前體;和(c)在IgG抗體樣分子前體中的單域抗體和抗體恒定區之間的邊界附近引入蛋白酶切割序列。在本公開的一個實施方案中,為包含具有抑制結構域的攜帶部分和抗原結合結構域的IgG抗體樣分子的多肽的生產方法是包括以下步驟的生產方法:(a)獲得與靶抗原結合的單域抗體;和(b)通過蛋白酶切割序列將步驟(a)中獲得的單域抗體作為IgG抗體VH或VL的替代物與IgG抗體重鏈恒定區或輕鏈恒定區連接,使得單域抗體的抗原結合活性被抑制,形成含有單域抗體的IgG抗體樣分子。在特定實施方案中,為包含具有抑制結構域的攜帶部分和抗原結合結構域的IgG抗體樣分子的多肽的生產方法是進一步包括以下步驟的生產方法:(d)確認引入IgG抗體樣分子或IgG抗體樣分子前體的單域抗體對靶抗原的結合活性減弱或喪失。在本公開中,短語“結合活性減弱”是指與締合或連接前相比,對靶抗原的結合活性降低,該降低的程度沒有限制。在特定實施方案中,為包含具有抑制結構域的攜帶部分和抗原結合結構域的IgG抗體樣分子的多肽的生產方法是進一步包括以下步驟的生產方法:(e)通過蛋白酶切割序列的蛋白酶切割釋放單域抗體并確認釋放的單域抗體與靶抗原結合。在使用VH、VL或VHH作為抑制結構域的情況下,通過攜帶部分的抑制結構域抑制單域抗體的抗原結合活性的方法包括使單域抗體與VH、VL或VHH締合??梢酝ㄟ^允許已知的VH、VL或VHH與單域抗體締合并比較締合之前和之后單域抗體的抗原結合活性來篩選抑制所提供的單域抗體的抗原結合活性的VH、VL或VHH。在通過特定VH、VL或VHH抑制單域抗體的抗原結合活性的另一種方法中,可以取代單域抗體中與VH、VL或VHH締合中參與的氨基酸殘基以促進締合,或者通過使用最初具有這樣的氨基酸殘基(可以促進締合的氨基酸)的單域抗體,也可以提供在締合之前和之后具有期望水平的抗原結合活性差異的單域抗體/抑制結構域對。在本公開的一個實施方案中,包含具有抑制結構域的攜帶部分和抗原結合結構域的IgG抗體樣分子多肽的生產方法是包括以下步驟的生產方法:(a)取代參與與抗體VH締合中的單域抗體中的氨基酸殘基,或取代參與與抗體VL締合的單域抗體中的氨基酸殘基,以制備變體單域抗體,所述變體單域抗體保留單域抗體對靶抗原的結合活性;(b)使步驟(a)中制備的變體單域抗體與抗體VH締合,或使變體單域抗體與抗體VL締合,使得變體單域抗體的抗原結合活性被抑制,以形成含有變體單域抗體的IgG抗體樣分子前體;和(c)將蛋白酶切割序列引入含有變體單域抗體的IgG抗體樣分子前體中。在本公開的一個實施方案中,為包含具有抑制結構域的攜帶部分和抗原結合結構域的IgG抗體樣分子的多肽的生產方法是包括以下步驟的生產方法:(a)取代參與與抗體VH締合的單域抗體中的氨基酸殘基,或取代參與與抗體VL締合的單域抗體中的氨基酸殘基,以制備變體單域抗體,所述變體單域抗體保留單域抗體對靶抗原的結合活性;(b)允許步驟(a)中制備的變體單域抗體與抗體VH締合,或允許變體單域抗體與抗體VL締合,使得變體單域抗體的抗原結合活性被抑制,以形成含有變體單域抗體的IgG抗體樣分子前體;和(c)在變體單域抗體和IgG抗體樣分子前體中的恒定區之間的邊界附近引入蛋白酶切割序列。在本公開的一個實施方案中,為包含具有抑制結構域的攜帶部分和抗原結合結構域的IgG抗體樣分子的多肽的生產方法是包括以下步驟的生產方法:(a)取代參與與抗體VH締合的單域抗體中的氨基酸殘基,或取代參與與抗體VL締合的單域抗體中的氨基酸殘基,以制備變體單域抗體,所述變體單域抗體保留單域抗體對靶抗原的結合活性;和(b)通過蛋白酶切割序列將步驟(a)中制備的變體單域抗體與IgG抗體重鏈恒定區連接,或通過蛋白酶切割序列將變體單域抗體與IgG抗體輕鏈恒定區連接,使得變體單域抗體的抗原結合活性被抑制,以形成包含變體單域抗體的IgG抗體樣分子。在特定實施方案中,包含具有抑制結構域的攜帶部分和抗原結合結構域的IgG抗體樣分子的多肽的生產方法是進一步包括以下步驟的生產方法:(d)確認IgG抗體樣分子或IgG抗體樣分子前體中含有的變體單域抗體對靶抗原的結合活性減弱或喪失。在本公開中,短語“結合活性減弱”是指與締合或連接前相比,對靶抗原的結合活性降低,該降低的程度沒有限制。在特定實施方案中,包含具有抑制結構域的攜帶部分和抗原結合結構域的IgG抗體樣分子的多肽的生產方法是進一步包括以下步驟的生產方法:(e)通過蛋白酶切割序列的蛋白酶切割釋放變體單域抗體并確認釋放的變體單域抗體與靶抗原結合。配體結合分子在本公開多肽的一個實施方案中,所述多肽為能夠結合配體的配體結合分子,其中所述配體結合分子在蛋白酶切割序列被切割的狀態下與配體的結合比在蛋白酶切割序列未被切割的狀態下,配體結合分子與配體的結合弱。本公開還涉及用于釋放與配體結合分子結合的配體的方法,該方法包括通過蛋白酶切割本文所述的配體結合分子中包含的蛋白酶切割序列。本公開還涉及用于從本文所述的配體和配體結合分子的融合蛋白中釋放配體的方法,該方法包括通過蛋白酶切割配體結合分子中包含的蛋白酶切割序列。本說明書中的術語“配體結合分子”是指能夠與配體結合的分子,特別是能夠與未切割狀態的配體結合的分子。在本文中,“結合”通常是指通過主要基于非共價鍵如靜電力、范德華力或氫鍵的相互作用而結合。本公開的配體結合分子的配體結合形式的優選實例包括但不限于抗原-抗體反應,通過該反應,抗原結合區、抗原結合分子、抗體、抗體片段等與抗原結合。短語“能夠結合配體”是指即使配體結合分子和配體是分開的分子,配體結合分子也能夠結合配體,并且不是指配體結合分子和配體通過共價鍵連接。例如,配體和配體結合分子通過接頭共價結合的事實不稱為“能夠結合配體”。此外,短語“配體結合減弱”是指上述結合能力(結合容量)減弱。例如,當配體和配體結合分子通過接頭共價結合時,接頭的切割并不意味著配體結合的減弱。在本公開中,配體結合分子可以通過接頭等與配體連接,只要配體結合分子能夠與配體結合。本公開的配體結合分子僅受其與未切割狀態的配體的結合所限制,并且可以是具有任何結構的分子,只要其能夠與未切割狀態的目標配體結合。這種配體結合分子的實例包括但不限于抗體重鏈可變區(VH)、抗體輕鏈可變區(VL)、單域抗體(sdAb)、包含在體內存在的細胞膜蛋白avimer中的大約35個氨基酸的稱為A結構域的模塊(WO2004/044011和WO2005/040229),含有10Fn3結構域的adnectin,所述10Fn3結構域是與在細胞膜上表達的糖蛋白纖連蛋白中的蛋白結合的結構域(WO2002/032925),含有構成由蛋白A的58個氨基酸組成的三螺旋束的IgG結合結構域支架的Affibody(WO1995/001937),DARPins(設計的錨蛋白重復蛋白),其是錨蛋白重復(AR)的分子表面暴露區域,所述錨蛋白重復具有其中包含33個氨基酸殘基、轉角、兩個反平行螺旋和環的亞基重復堆疊的結構(WO2002/020565),具有四個環區域的anticalin,所述四個環區域支撐桶狀結構一側,所述桶狀結構由向中心軸彎曲的8條反平行鏈形成,在脂質運載蛋白分子例如中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)中高度保守(WO2003/029462),以及在無頜脊椎動物如七鰓鰻或盲鰻的獲得性免疫系統中看到的無免疫球蛋白結構的可變淋巴細胞受體(VLR)的由富亮氨酸重復(LRR)模塊的重復的堆疊組成的馬蹄形結構的內部平行片狀結構中的凹陷區域(WO2008/016854)。當本公開的多肽為配體結合分子時,蛋白酶切割序列可置于多肽中的任何位置,只要配體結合分子與配體的結合因序列切割而減弱。多肽中包含的蛋白酶切割序列的數量可以是一個或多個。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,與未切割狀態相比,配體結合分子在切割狀態下更弱地結合配體(即,配體結合減弱)。在配體結合分子的配體結合基于抗原-抗體反應的實施方案中,可以基于配體結合分子的配體結合活性評價配體結合的減弱。配體結合分子與配體的結合活性可以通過眾所周知的方法,例如FACS、ELISA形式、使用放大發光鄰近均相測定(ALPHA)篩選或表面等離振子共振(SPR)現象的BIACORE方法或生物層干涉測量(BLI)(Octet)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010)來評估。ALPHA篩選是基于以下原理根據ALPHA技術進行的,該技術使用兩種珠子、供體和受體。只有當與供體珠結合的分子和與受體珠結合的分子相互作用并且當兩個珠子彼此靠近時,才會檢測到發光信號。供體珠中的激光激發光敏劑將環境氧轉化為激發態的單線態氧。單線態氧分子在供體珠周圍擴散,當它們到達附近的受體珠時,它們會在珠子中引發化學發光反應,從而導致光發射。當與供體珠結合的分子和與受體珠結合的分子不相互作用時,不會發生化學發光反應,因為供體珠產生的單線態氧沒有到達受體珠。例如,生物素標記的配體結合分子與供體珠結合,谷胱甘肽S轉移酶(GST)標記的配體與受體珠結合。在不存在競爭性未標記配體結合分子的情況下,配體結合分子與配體相互作用以產生520至620nm的信號。未標記的配體結合分子與標記的配體結合分子競爭與配體的相互作用??梢粤炕偁帉е碌臒晒饨档鸵远看_定相對結合親和力。使用磺基-NHS-生物素等對配體結合分子例如抗體進行生物素化是本領域已知的。包括,例如,將編碼框中配體的多核苷酸與編碼GST的多核苷酸融合以形成融合基因,在攜帶允許表達融合基因的載體的細胞等中表達GST融合配體,使用谷胱甘肽柱純化GST融合配體的方法,可以適當地采用作為用GST標記配體的方法。優選地使用例如適用于基于非線性回歸分析的單點競爭模型的軟件GRAPHPADPRISM(GraphPadSoftware,Inc.,SanDiego)分析獲得的信號。將待觀察相互作用的物質的一個(配體)固定在傳感器芯片的金薄膜上。從傳感器芯片的背面照射光使得在金薄膜和玻璃之間的界面發生全反射。結果,在一部分反射光中形成了反射強度(SPR信號)下降的位點。將待觀察相互作用的另一種物質(分析物)倒在傳感器芯片的表面上,當分析物與配體結合時,固定的配體分子的質量增加并導致傳感器芯片表面上的溶劑的折射率變化。折射率的這種變化會改變SPR信號的位置(相反,發生解離時信號的位置會返回)。Biacore系統在縱坐標上繪制上述位移量,即傳感器芯片表面上的質量變化,并顯示時間依賴性的質量變化作為測定數據(傳感圖)。動力學(結合速率常數(ka)和解離速率常數(kd))由傳感圖的曲線確定,而解離常數(KD)由兩個常數之間的比率確定。在BIACORE方法中也優選使用抑制測定或平衡分析。Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010中描述了抑制測定的實例,以及在MethodsEnzymol.2000;323:325-40中描述了平衡分析的實例。短語“配體結合分子與配體結合的功能減弱”是指基于上述測量方法,每個測試配體結合分子結合的配體的量是對照配體結合分子結合的配體的量的,例如,50%或更少,優選45%或更少,40%或更少、35%或更少、30%或更少、20%或更少、或15%或更少,特別優選10%或更少、9%或更少、8%或更少、7%或更少、6%或更少、5%或更少、4%或更少、3%或更少、2%或更少、或1%或更少??梢赃m當地使用期望的指數作為結合活性指數,并且可以使用解離常數(KD)。在使用解離常數(KD)作為評價結合活性的指數的情況下,測試配體結合分子對配體的解離常數(KD)大于對照配體結合分子對配體的解離常數(KD)是指測試配體結合分子對配體的結合活性比對照配體結合分子弱。短語“與配體結合的功能減弱”是指測試配體結合分子對配體的解離常數(KD)為對照配體結合分子對配體的解離常數(KD)的例如2倍或更多,優選5倍或更多,或10倍或更多,特別優選100倍或更多。對照配體結合分子的實例包括未切割形式的配體結合分子。在本說明書中,術語“配體”是具有生物學活性的分子。具有生物學活性的分子通常通過與細胞表面的受體相互作用而發揮作用,從而以其他方式進行生物刺激、抑制或調節。這些功能通常被認為參與攜帶受體的細胞的細胞內信號通路。在本說明書中,配體包括通過與生物分子相互作用而發揮生物學活性的所需分子。例如,配體不僅指與受體相互作用的分子,還包括通過與該分子相互作用而發揮生物學活性的分子,例如與該分子相互作用的受體或其結合片段。例如,已知為受體的蛋白質的配體結合位點,以及包含與另一分子相互作用的受體位點的蛋白質,包括在根據本公開的配體中。具體地,可溶性受體、受體的可溶性片段、跨膜受體的胞外結構域和含有它們的多肽等都包括在根據本公開的配體中。本公開的配體通??梢酝ㄟ^與一種或多種結合伴侶結合來發揮所需的生物學活性。配體的結合伴侶可以是細胞外、細胞內或跨膜蛋白。在一個實施方案中,配體的結合伴侶是胞外蛋白,例如可溶性受體。在另一個實施方案中,配體的結合伴侶是膜結合受體。本公開的配體可以以10μM,1μM,100nM,50nM,10nM,5nM,1nM,500pM,400pM,350pM,300pM,250pM,200pM,150pM,100pM,50pM,25pM,10pM,5pM,1pM,0.5pM或0.1pM或更少的解離常數(KD)與結合伴侶特異性結合。具有生物學活性的分子的實例包括但不限于細胞因子、趨化因子、多肽激素、生長因子、凋亡誘導因子、PAMP、DAMP、核酸及其片段。在具體實施方案中,白介素、干擾素、造血因子、TNF超家族成員、趨化因子、細胞生長因子、TGF-β家族成員、myokine、adipokine或神經營養因子可以用作配體。在更具體的實施方案中,CXCL10,IL-2,IL-7,IL-12,IL-15,IL-18,IL-21,IFN-α,IFN-β,IFN-g,MIG,I-TAC,RANTES,MIP-1a,MIP-1b,IL-1R1(白介素1受體,I型)、IL-1R2(白介素1受體,II型)、IL-1RAcP(白介素1受體輔助蛋白)或IL-1Ra(蛋白質登陸號NP_776214,mRNA登陸號NM_173842.2)可以用作配體。趨化因子是7至16kDa的同質血清蛋白家族,最初的特征在于它們能夠誘導白細胞遷移。大多數趨化因子具有四種特征半胱氨酸(Cys),根據前兩個半胱氨酸展示的基序,分為CXC或α、CC或β、C或γ和CX3C或δ趨化因子類別。第一個和第三個半胱氨酸之間以及第二個和第四個半胱氨酸之間形成兩個二硫鍵。一般來說,二硫鍵被認為是必要的。Clark-Lewis及其合作者報道說,二硫鍵對于至少CXCL10的趨化因子活性至關重要(Clark-Lewisetal.,J.Biol.Chem.269:16075-16081,1994)。具有四個半胱氨酸的唯一一個例外是lymphotactin,它只有兩個半胱氨酸殘基。因此,lymphotactin僅通過一個二硫鍵勉強維持其功能結構。根據第一個半胱氨酸之前是否存在ELR基序(Glu-Leu-Arg),CXC或α亞家族進一步分為兩組:ELR-CXC趨化因子和非ELR-CXC趨化因子(參見例如,Clark-Lewis,同上;和Belperioetal.,\"CXCChemokinesinAngiogenesis\",J.Leukoc.Biol.68:1-8,2000)。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,配體是細胞因子。細胞因子是一種參與免疫調節和炎癥過程的分泌細胞信號蛋白家族。這些細胞因子由神經系統的神經膠質細胞和免疫系統的許多細胞分泌。細胞因子可分為蛋白質、肽和糖蛋白,包括龐大而多樣的調節因子家族。細胞因子可通過與其細胞表面受體結合,誘導細胞內信號轉導,從而引起酶活性的調節,一些基因及其轉錄因子的上調或下調,或反饋抑制等。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,本公開的細胞因子包括免疫調節因子,例如白介素(IL)和干擾素(IFN)。合適的細胞因子可以包含源自以下類型中的一種或多種的蛋白質:四個α-螺旋束家族(其包括IL-2亞家族、IFN亞家族和IL-10亞家族);IL-1家族(其包括IL-1和IL-8);和IL-17家族。細胞因子還可以包括分類為增強細胞免疫應答的1型細胞因子(例如,IFN-γ和TGF-β),或有利于抗體反應的2型細胞因子(例如,IL-4、IL-10和IL-13)的那些細胞因子。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,配體是趨化因子。趨化因子通常充當將免疫效應細胞動員到趨化因子表達位點的趨化劑。這被認為有利于將特定趨化因子基因與例如細胞因子基因一起表達,以將其他免疫系統成分動員到治療部位。此類趨化因子包括CXCL10、RANTES、MCAF、MIP1-α和MIP1-β。本領域技術人員應該知道,某些細胞因子也具有趨化作用,并且承認此類細胞因子可以通過術語“趨化因子”進行分類。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子、細胞因子變體、趨化因子變體等(例如,AnnuRevImmunol.2015;33:139-67)或包含它們的融合蛋白時(例如,StemCellsTranslMed.2015Jan;4(1):66-73)可用作配體。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,配體選自CXCL10、PD-1、IL-12、IL-6R、IL-1R1、IL-1R2、IL-1RAcP和IL-1Ra。CXCL10、PD-1、IL-12、IL-6R、IL-1R1、IL-1R2、IL-1RAcP和IL-1Ra可能分別具有與天然存在的CXCL10、PD-1、IL-12、IL-6R、IL-1R1、IL-1R2、IL-1RAcP和IL-1Ra相同的序列,或者可以是與天然存在的CXCL10、PD-1、IL-12、IL-6R、IL-1R1、IL-1R2、IL-1RAcP和IL-1Ra序列不同,但保留了相應天然配體的生理活性的配體變體。為了獲得配體變體,出于各種目的,可以人為地向配體序列添加改變。優選地,向其中添加抵抗蛋白酶切割的改變(蛋白酶抗性改變)以獲得配體變體。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,在配體結合分子中,配體通過切割位點的切割從配體結合分子釋放。在此上下文中,當配體通過接頭與配體結合分子的一部分結合并且接頭不具有蛋白酶切割序列時,配體在與配體結合分子的一部分通過接頭連接時被釋放(參見例如圖5)。即使配體與上述配體結合分子的一部分一起釋放,只要配體從大部分配體結合分子中釋放出來,就可以得出結論:配體從配體結合分子中釋放出來。通過切割位點的切割來檢測配體從配體結合分子釋放的方法包括使用例如識別配體的用于配體檢測的抗體來檢測配體的方法。當配體結合分子是抗體片段時,用于配體檢測的抗體優選結合與配體結合分子相同的表位。使用用于配體檢測的抗體檢測的配體可以通過眾所周知的方法例如FACS、ELISA形式、使用放大發光鄰近均相測定(ALPHA)篩選或表面等離振子共振(SPR)現象的BIACORE方法或生物層干涉測量(BLI)(Octet)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010)來確認。在使用例如Octet檢測配體釋放的情況下,識別配體的用于配體檢測的抗體被生物素化并與生物傳感器接觸。然后,可以測量樣品中與配體的結合以檢測配體的釋放。具體地,在蛋白酶處理之前或蛋白酶處理之后,使用用于配體檢測的抗體,在含有配體和配體結合分子的樣品中測量配體的量??梢栽诘鞍酌柑幚砬昂蟊容^樣品中檢測到的配體的量以檢測配體的釋放?;蛘?,在含有蛋白酶、配體結合分子和配體的樣品和含有配體結合分子和配體、不含有蛋白酶的樣品中,使用用于配體檢測的抗體測量配體的量??梢员容^在有或沒有蛋白酶的樣品中檢測到的配體的量來檢測配體的釋放。更具體地,可以通過本申請實施例中描述的方法檢測配體的釋放。當配體結合分子與配體融合形成融合蛋白時,在蛋白酶處理前或蛋白酶處理后含有融合蛋白的樣品中,使用用于配體檢測的抗體測量配體的量??梢员容^在蛋白酶處理前后的樣品中檢測到的配體的量以檢測配體的釋放?;蛘?,在含有蛋白酶和融合蛋白的樣品和含有融合蛋白但不含蛋白酶的樣品中,使用用于配體檢測的抗體測量配體的量??梢员容^在有或沒有蛋白酶的樣品中檢測到的配體的量來檢測配體的釋放。更具體地,可以通過本申請實施例中描述的方法檢測配體的釋放。在配體的生理活性在與配體結合分子結合時被抑制的實施方案中,檢測配體從配體結合分子釋放的方法包括測量樣品中配體的生理活性以檢測配體釋放。具體地,可以在蛋白酶處理之前或蛋白酶處理之后在含有配體和配體結合分子的樣品中測量配體的生理活性,然后進行比較以檢測配體的釋放?;蛘?,可以在含有蛋白酶、配體結合分子和配體的樣品和含有配體結合分子和配體、不含有蛋白酶的樣品中測量和比較配體的生理活性以檢測配體的釋放。當配體結合分子與配體融合形成融合蛋白時,可以在蛋白酶處理之前或蛋白酶處理之后在含有融合蛋白的樣品中測量和比較配體的生理活性,以檢測配體的釋放?;蛘?,可以在含有蛋白酶和融合蛋白的樣品和含有融合蛋白但不含蛋白酶的樣品中測量和比較配體的生理活性以檢測配體的釋放。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,配體結合分子包含Fc區。在使用IgG抗體Fc區的情況下,其類型沒有限制,例如,可以使用IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區。例如,可以使用包含選自由SEQIDNO:18004、18005、18006和18007表示的氨基酸序列的一個序列的Fc區,或通過對Fc區添加改變而制備的Fc區突變體。在本公開的一些實施方案中,配體結合分子包含抗體恒定區。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,配體結合分子是抗體。在使用抗體作為配體結合分子的情況下,通過可變區實現與配體的結合。在一些進一步的具體實施方案中,配體結合分子是IgG抗體。在使用IgG抗體作為配體結合分子的情況下,其種類沒有限制,可以使用IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。在使用IgG抗體作為配體結合分子的情況下,與配體的結合也是通過可變區實現的。IgG抗體的兩個可變區之一或兩者均可實現與配體的結合。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,配體結合分子中具有配體結合活性的結構域被配體結合分子中蛋白酶切割序列的切割分開,并且與配體的結合減弱。在使用IgG抗體作為配體結合分子的情況下,示例性實施方案包括將蛋白酶切割序列置于抗體可變區中并由于缺乏形成完整抗體可變區的能力而減弱與處于切割狀態的配體的結合。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,配體的生物學活性通過與未切割的配體結合分子結合而受到抑制。配體的生物學活性被抑制的實施方案的實例包括但不限于其中配體與未切割的配體結合分子的結合實質上或顯著地干擾配體與其結合伴侶的結合或與配體與其結合伴侶的結合競爭。在使用具有配體中和活性的抗體或其片段作為配體結合分子的情況下,與配體結合的配體結合分子能夠通過發揮其中和活性來抑制配體的生物學活性。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,優選地,未切割的配體結合分子可以通過與配體結合而充分中和配體的生物學活性。即,與未切割的配體結合分子結合的配體的生物學活性優選低于未與未切割的配體結合分子結合的配體的生物學活性。與未切割的配體結合分子結合的配體的生物學活性可以是未與未切割的配體結合分子結合的配體的生物學活性的,例如,90%或更少,優選80%或更少,70%或更少,60%或更少,50%或更少,40%或更少,或30%或更少,特別優選20%或更少,10%或更少,9%或更少,8%或更少,7%或更少,6%或更少,5%或更少,4%或更少,3%或更少、2%或更少、或1%或更少,但不限于此。通過充分中和配體的生物學活性,可以預期配體結合分子的施用防止配體在到達患病組織之前發揮其生物學活性?;蛘?,本公開提供用于中和配體的生物學活性的方法。本公開的方法包括將本公開的配體結合分子與生物學活性應該被中和的配體接觸,并收集兩個分子結合的產物的步驟。收集到的結合產物中配體結合分子的切割可以恢復配體的中和的生物學活性。因此,根據本公開的用于中和配體生物學活性的方法可以進一步包括通過切割由配體和配體結合分子組成的結合產物中的配體結合分子來恢復配體生物學活性(換句話說,取消配體結合分子的中和活性)的步驟。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,切割的配體結合分子對配體的結合活性優選低于體內天然配體結合伴侶(例如,配體的天然受體)對配體的結合活性。切割的配體結合分子對配體的結合活性表現出,與體內天然結合伴侶結合的配體的量(每單位結合伴侶)的例如,90%或更少,優選80%或更少,70%或更少,60%或更少,50%或更少,40%或更少,或30%或更少,特別優選20%或更少、10%或更少、9%或更少、8%或更少、7%或更少、6%或更少、5%或更少、4%或更少、3%或更少、2%或更少、或1%或更少,但不限于此。期望的指標可以適當地用作結合活性的指標。例如,可以使用解離常數(KD)。在使用解離常數(KD)作為評價結合活性的指標的情況下,切割的配體結合分子對配體的解離常數(KD)大于體內天然結合伴侶對配體的解離常數(KD)意味著切割的配體結合分子對配體的結合活性比體內天然結合伴侶的結合活性弱。切割的配體結合分子對配體的解離常數(KD)是體內天然結合伴侶對配體的解離常數(KD)的例如1.1倍或更多,優選1.5倍或更多、2倍或更多、5倍或更多或10倍或更多,特別優選100倍或更多。對配體僅具有低結合活性或在切割后對配體幾乎不具有結合活性的配體結合分子保證配體通過配體結合分子的切割被釋放,并且可以預期防止再次與另一個配體分子結合。希望配體在配體結合分子切割后恢復被抑制的生物學活性。切割的配體結合分子與配體的結合的減弱理想地導致配體結合分子抑制配體生物學活性的功能減弱。本領域技術人員可以通過已知方法,例如檢測配體與其結合伴侶的結合的方法來確認配體的生物學活性。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,未切割的配體結合分子通過抗原-抗體結合與配體形成復合物。在更具體的實施方案中,配體結合分子和配體的復合物通過配體結合分子和配體之間的非共價鍵,例如抗原-抗體結合而形成。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,未切割的配體結合分子與配體融合以形成融合蛋白。融合蛋白中的配體結合分子部分與配體部分進一步通過抗原-抗體結合彼此相互作用。配體結合分子和配體可以通過接頭或不通過接頭融合。即使當融合蛋白中的配體結合分子和配體通過或不通過接頭融合時,配體結合分子部分和配體部分之間仍然存在非共價鍵。換言之,即使在配體結合分子與配體融合的實施方案中,配體結合分子部分與配體部分之間的非共價鍵與配體結合分子不與配體融合的實施方案中的類似。非共價鍵由于配體結合分子的切割而減弱。簡而言之,配體結合分子的配體結合減弱。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,配體結合分子和配體通過接頭融合。例如,可以通過基因工程引入的任意肽接頭,或作為合成化合物接頭公開的接頭(參見例如,ProteinEngineering,9(3),299-305,1996)可以用作在配體結合分子與配體融合中的接頭。在本實施方案中,優選肽接頭。肽接頭的長度沒有特別限制,并且可以由本領域技術人員根據目的適當地選擇。肽接頭的實例可包括但不限于甘氨酸-絲氨酸聚合物的接頭。然而,本領域技術人員可以根據目的適當地選擇肽接頭的長度和序列。合成化合物接頭(化學交聯劑)是肽的交聯中通常所用的交聯劑,例如N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亞胺酯(DSS)、辛二酸雙(磺基琥珀酰亞胺基)酯(BS3)、二硫代雙(丙酸琥珀酰亞胺酯)(DSP)、二硫代雙(丙酸磺基琥珀酰亞胺酯)(DTSSP)、乙二醇雙(琥珀酸琥珀酰亞胺酯)(EGS)、乙二醇雙(琥珀酸磺基琥珀酰亞胺酯)(磺基-EGS)、酒石酸二琥珀酰亞胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亞胺酯(磺基-DST)、雙[2-(琥珀酰亞胺氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)或雙[2-(磺基琥珀酰亞胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BSOCOES)。這些交聯劑是可商購的。在本公開的一些實施方案中,配體結合分子和配體的融合蛋白是其中配體結合分子的N-末端和配體的C-末端通過或不通過接頭融合的融合蛋白。當本公開的配體結合分子是多聚體時,配體可以是融合蛋白,其中配體通過或不通過接頭融合在配體結合分子中任意肽鏈的N-或C-末端。例如,當配體結合分子是IgG抗體時,配體可以通過或不通過接頭融合在VH的N-末端或VL的N-末端。下面列出了當本公開的配體結合分子包含單域抗體時,配體結合分子和配體的融合蛋白的結構的幾個實施方案。以下實施方案以從N-末端到C-末端的順序顯示。對于受益于本公開的本領域技術人員而言顯而易見的是融合蛋白可以是單體或多聚體(包括二聚體)。配體-單域抗體配體-接頭-單域抗體配體-單域抗體-抗體恒定區(或其片段)配體-接頭-單域抗體-抗體恒定區(或其片段)配體-單域抗體-抗體鉸鏈區-抗體CH2-抗體CH3配體-接頭-單域抗體-抗體鉸鏈區-抗體CH2-抗體CH3包含VH和VL的配體結合分子在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,配體結合分子包含抗體VH和抗體VL。包含VH和VL的配體結合分子的實例包括但不限于Fv、scFv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2和完整抗體。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,配體結合分子中包含的VH和VL彼此締合??贵wVH和抗體VL之間的締合可以被取消,例如,通過蛋白酶切割序列的切割。本公開的配體結合分子包括這樣的配體結合分子,其中配體結合分子中的抗體VL或其部分與抗體VH或其部分之間的締合通過蛋白酶對蛋白酶切割序列的切割而被取消。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,配體結合分子包括抗體VH和抗體VL,并且配體結合分子中的抗體VH和抗體VL在配體結合分子的蛋白酶切割序列未被切割的狀態彼此締合,而配體結合分子中抗體VH和抗體VL之間的締合被蛋白酶切割序列的切割取消。配體結合分子中的蛋白酶切割序列可以位于配體結合分子中的任何位置,只要配體結合分子與配體的結合可以通過蛋白酶切割序列的切割減弱。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,配體結合分子包含抗體VH、抗體VL和抗體恒定區。正如Rothlisberger等人(JMolBiol.2005Apr8;347(4):773-89)所提到的,已知抗體的VH和VL結構域或CH和CL結構域通過許多氨基酸側鏈相互作用。已知VH-CH1和VL-CL能夠作為Fab結構域形成穩定的結構。據報道,VH和VL之間的氨基酸側鏈通常以10-5M至10-8M范圍內的解離常數相互作用。當僅存在VH和VL結構域時,只有一小部分可能形成締合狀態。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,配體結合分子被設計成在包含抗體VH和抗體VL的配體結合分子中提供蛋白酶切割序列,以及整個重鏈-輕鏈相互作用存在于切割前的Fab結構中的兩個肽之間,而含有VH(或VH的一部分)的肽與含有VL(或VL的一部分)的肽之間的相互作用通過蛋白酶切割序列的切割減弱,從而取消VH和VL之間的締合。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,蛋白酶切割序列位于抗體恒定區內。在更具體的實施方案中,蛋白酶切割序列位于相對于抗體重鏈恒定區中氨基酸位置140(EU編號)的可變區側,或相對于抗體重鏈恒定區的氨基酸位置122(EU編號)的可變區側。在一些具體實施方案中,蛋白酶切割序列被插入到從抗體重鏈恒定區中的氨基酸118(EU編號)到抗體重鏈恒定區中的氨基酸140(EU編號)的序列內的任何位置。在另一個更具體的實施方案中,蛋白酶切割序列位于抗體輕鏈恒定區中氨基酸位置130(Kabat編號)的可變區側,或抗體輕鏈恒定區的氨基酸位置113(Kabat編號)的可變區側或在相對于抗體輕鏈恒定區中氨基酸位置112(Kabat編號)的可變區側。在一些具體實施方案中,蛋白酶切割序列被插入到從抗體輕鏈恒定區中的氨基酸108(Kabat編號)到抗體輕鏈恒定區中的氨基酸131(Kabat編號)的序列內的任何位置。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,蛋白酶切割序列位于抗體VH內或抗體VL內。在更具體的實施方案中,蛋白酶切割序列相對于抗體VH的氨基酸位置7(Kabat編號)位于抗體恒定區側,或相對于抗體VH的氨基酸位置40(Kabat編號)位于抗體恒定區側,或相對于抗體VH的氨基酸位置101(Kabat編號)位于抗體恒定區側,或相對于抗體VH的氨基酸位置109(Kabat編號)位于抗體恒定區側,或相對于抗體VH的氨基酸位置111(Kabat編號)位于抗體恒定區側。在更具體的實施方案中,切割位點或蛋白酶切割序列相對于抗體VL的氨基酸位置7(Kabat編號)位于抗體恒定區側,或相對于抗體VL的氨基酸位置39(Kabat編號)位于抗體恒定區側,或相對于抗體VL的氨基酸位置96(Kabat編號)位于抗體恒定區側,或相對于抗體VL的氨基酸位置104(Kabat編號)位于抗體恒定區側或相對于抗體VL的氨基酸位置105(Kabat編號)位于抗體恒定區側。在某些實施方案中,當本公開的多肽為配體結合分子時,蛋白酶切割序列插入在抗體VH或抗體VL中形成環結構的殘基,以及靠近環結構的殘基位置??贵wVH或抗體VL中的環結構是指在抗體VH或抗體VL中不形成二級結構例如α-螺旋或-β片層的部分。具體地,形成環結構的殘基和靠近環結構的殘基的位置可以指抗體VH的氨基酸位置7(Kabat編號)至氨基酸位置16(Kabat編號)、氨基酸位置40(Kabat編號)至氨基酸位置47(Kabat編號),氨基酸位置55(Kabat編號)至氨基酸位置69(Kabat編號),氨基酸位置73(Kabat編號)至氨基酸位置79(Kabat編號),氨基酸位置83(Kabat編號)至氨基酸位置89(Kabat編號),氨基酸位置95(Kabat編號)至氨基酸位置99(Kabat編號),或氨基酸位置101(Kabat編號)至氨基酸位置113(Kabat編號),或抗體VL的氨基酸位置7(Kabat編號)至氨基酸位置19(Kabat編號)、氨基酸位置39(Kabat編號)至氨基酸位置46(Kabat編號)、氨基酸位置49(Kabat編號)至氨基酸位置62(Kabat編號)或氨基酸位置96(Kabat編號)至氨基酸位置107(Kabat編號)的范圍。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,蛋白酶切割序列插入在抗體VH的氨基酸位置7(Kabat編號)至氨基酸位置16(Kabat編號),氨基酸位置40(Kabat編號)至氨基酸位置47(Kabat編號),氨基酸位置55(Kabat編號)至氨基酸位置69(Kabat編號),氨基酸位置73(Kabat編號)至氨基酸位置79(Kabat編號),氨基酸位置83(Kabat編號)至氨基酸位置89(Kabat編號),氨基酸位置95(Kabat編號)至氨基酸位置99(Kabat編號),或氨基酸位置101(Kabat編號)至氨基酸位置113(Kabat編號)的序列中的任何位置。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,蛋白酶切割序列插入在抗體VL的氨基酸位置7(Kabat編號)至氨基酸位置19(Kabat編號),氨基酸位置39(Kabat編號)至氨基酸位置46(Kabat編號),氨基酸位置49(Kabat編號)至氨基酸位置62(Kabat編號),或氨基酸位置96(Kabat編號)至氨基酸位置107(Kabat編號)的序列中的任何位置。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,蛋白酶切割序列位于抗體VH和抗體恒定區之間的邊界附近。短語“抗體VH和抗體重鏈恒定區之間的邊界附近”可以指抗體VH的氨基酸位置101(Kabat編號)和抗體重鏈恒定區的氨基酸位置140(EU編號)之間或可指抗體VH的氨基酸位置109(Kabat編號)和抗體重鏈恒定區的氨基酸位置122(EU編號)之間,或抗體VH的氨基酸位置111(Kabat編號)和抗體重鏈恒定區的氨基酸位置122(EU編號)之間。當抗體VH連接到抗體輕鏈恒定區時,短語“抗體VH和抗體輕鏈恒定區之間的邊界附近”可以指抗體VH的氨基酸位置101(Kabat編號)和抗體輕鏈恒定區的氨基酸位置130(Kabat編號)之間或可指抗體VH的氨基酸位置109(Kabat編號)和抗體輕鏈恒定區的氨基酸位置113(Kabat編號)之間,或抗體VH的氨基酸位置111(Kabat編號)和抗體輕鏈恒定區的氨基酸位置112(Kabat編號)之間。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,蛋白酶切割序列位于抗體VL和抗體恒定區之間的邊界附近。短語“抗體VL和抗體輕鏈恒定區之間的邊界附近”可以指抗體VL的氨基酸位置96(Kabat編號)和抗體輕鏈恒定區的氨基酸位置130(Kabat編號)之間或可指抗體VL的氨基酸位置104(Kabat編號)和抗體輕鏈恒定區的氨基酸位置113(Kabat編號)之間,或抗體VL的氨基酸位置105(Kabat編號)和抗體輕鏈恒定區的氨基酸位置112(Kabat編號)之間。當抗體VL與抗體重鏈恒定區連接時,短語“抗體VL與抗體重鏈恒定區之間的邊界附近”可以指抗體VL的氨基酸位置96(Kabat編號)和抗體重鏈恒定區的氨基酸位置140(EU編號)之間或可以指抗體VL的氨基酸位置104(Kabat編號)和抗體重鏈恒定區的氨基酸位置122(EU編號)之間,或抗體VL的氨基酸位置105(Kabat編號)和抗體重鏈恒定區的氨基酸位置122(EU編號)之間??梢栽谂潴w結合分子中的多個位置提供蛋白酶切割序列,例如,在選自以下的多個位置:抗體恒定區內、抗體VH內、抗體VL內、抗體VH和抗體恒定區之間的邊界附近,和抗體VL和抗體恒定區之間的邊界附近。參考本公開的本領域技術人員可以改變包含抗體VH、抗體VL和抗體恒定區的分子的形式,例如通過抗體VH和抗體VL互換。這種分子形式不脫離本公開的范圍。包含單域抗體的配體結合分子在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,配體結合分子包含單域抗體。配體結合分子中的蛋白酶切割序列可以位于配體結合分子中的任何位置,只要配體結合分子與配體的結合因序列的切割而減弱。在某些實施方案中,當本公開的多肽是包含單域抗體的配體結合分子時,蛋白酶切割序列被引入配體結合分子內的單域抗體中。在一些更具體的實施方案中,蛋白酶切割序列被引入單域抗體內形成環結構的殘基位置和靠近環結構的殘基位置。單域抗體內的環結構是指單域抗體內不形成二級結構例如α-螺旋、β-折疊的部分。當本根據的多肽是包含單域抗體的配體結合分子時,在單域抗體為VHH或單域VH抗體的實施方案中,形成環結構的殘基和接近環結構的殘基的位置可以具體指以下范圍:單域抗體的氨基酸7(Kabat編號)至氨基酸17(Kabat編號);氨基酸12(Kabat編號)至氨基酸17(Kabat編號);氨基酸31(Kabat編號)至氨基酸35b(Kabat編號);氨基酸40(Kabat編號)至氨基酸47(Kabat編號);氨基酸50(Kabat編號)至氨基酸65(Kabat編號);氨基酸55(Kabat編號)至氨基酸69(Kabat編號);氨基酸73(Kabat編號)至氨基酸79(Kabat編號);氨基酸83(Kabat編號)至氨基酸89(Kabat編號);氨基酸95(Kabat編號)至氨基酸99(Kabat編號);氨基酸95(Kabat編號)至氨基酸102(Kabat編號);和氨基酸101(Kabat編號)至氨基酸113(Kabat編號)。當本公開的多肽是包含單域抗體的配體結合分子時,在單域抗體為VHH或單域VH抗體的實施方案中,蛋白酶切割序列被引入一個或多個位置,所述一個或多個位置包含在選自以下單域抗體的序列的一個或多個序列中:單域抗體的氨基酸7(Kabat編號)至氨基酸17(Kabat編號)的序列;單域抗體的氨基酸12(Kabat編號)至氨基酸17(Kabat編號)的序列;單域抗體的氨基酸31(Kabat編號)至氨基酸35b(Kabat編號)的序列;單域抗體的氨基酸40(Kabat編號)至氨基酸47(Kabat編號)的序列;單域抗體的氨基酸50(Kabat編號)至氨基酸65(Kabat編號)的序列;單域抗體的氨基酸55(Kabat編號)至氨基酸69(Kabat編號)的序列;單域抗體的氨基酸73(Kabat編號)至氨基酸79(Kabat編號)的序列;單域抗體的氨基酸83(Kabat編號)至氨基酸89(Kabat編號)的序列;單域抗體的氨基酸95(Kabat編號)至氨基酸99(Kabat編號)的序列;單域抗體的氨基酸95(Kabat編號)至氨基酸102(Kabat編號)的序列;以及單域抗體的氨基酸101(Kabat編號)至氨基酸113(Kabat編號)的序列。當本公開的多肽是包含單域抗體的配體結合分子時,在單域抗體是單域VL抗體的實施方案中,形成環結構的殘基和接近環結構的殘基位置可以具體指以下范圍:單域抗體的氨基酸7(Kabat編號)至氨基酸19(Kabat編號);氨基酸24(Kabat編號)至氨基酸34(Kabat編號);氨基酸39(Kabat編號)至氨基酸46(Kabat編號);氨基酸49(Kabat編號)至氨基酸62(Kabat編號);氨基酸50(Kabat編號)至氨基酸56(Kabat編號);氨基酸89(Kabat編號)至氨基酸97(Kabat編號);以及氨基酸96(Kabat編號)至氨基酸107(Kabat編號)的范圍。當本公開的多肽是包含單域抗體的配體結合分子時,在單域抗體是單域VL抗體的實施方案中,蛋白酶切割序列被引入一個或多個位置,所述一個或多個位置包含在選自以下單域抗體序列的一個或多個序列中:單域抗體的氨基酸7(Kabat編號)至氨基酸19(Kabat編號)的序列;單域抗體的氨基酸24(Kabat編號)至氨基酸34(Kabat編號)的序列;單域抗體的氨基酸39(Kabat編號)至氨基酸46(Kabat編號)的序列;單域抗體的氨基酸49(Kabat編號)至氨基酸62(Kabat編號)的序列;單域抗體的氨基酸50(Kabat編號)至氨基酸56(Kabat編號)的序列;單域抗體的氨基酸89(Kabat編號)至氨基酸97(Kabat編號)的序列;以及單域抗體的氨基酸96(Kabat編號)至氨基酸107(Kabat編號)的序列??梢栽谂潴w結合分子內,例如在配體結合分子中的單域抗體內的多個位置提供多個蛋白酶切割序列。在某些實施方案中,當本公開的多肽是包含單域抗體的配體結合分子時,未切割的配體結合分子比單獨的單域抗體具有更長的半衰期。使配體結合分子的血液半衰期比單獨的單域抗體的血液半衰期長的實施方案的實例包括但不限于增加配體結合分子的分子量,或將具有FcRn結合能力的部分與單域抗體融合,或將具有白蛋白結合能力的部分與單域抗體融合,或將聚乙二醇化部分與單域抗體融合。當本公開的多肽是包含單域抗體的配體結合分子時,當比較單獨的單域抗體的半衰期和配體結合分子的半衰期時,優選使用人中的血液半衰期。當人中的血液半衰期難以測量時,可以根據小鼠(例如,正常小鼠、表達人類抗原的轉基因小鼠、具有人FcRn表達的轉基因小鼠等)或猴中(例如食蟹猴)中的血液半衰期來預測人中的血液半衰期。當本公開的多肽是包含單域抗體的配體結合分子時,相對于單獨的單域抗體的血液半衰期增加配體結合分子的血液半衰期的一個實施方案包括增加配體結合分子的分子量。在優選的實施方案中,配體結合分子的分子量為60kDa或更大。當存在于血液中時,分子量為60kDa或更大的分子通常不太可能被腎臟清除,并且可能具有長的血液半衰期(參見JBiolChem.1988Oct.15;263(29):15064-70)。當本公開的多肽是包含單域抗體的配體結合分子時,與單獨的單域抗體的血液半衰期相比增加配體結合分子的血液半衰期的一個實施方案包括使單域抗體與FcRn結合區融合。當本公開的多肽是包含單域抗體的配體結合分子時,作為與單獨的單域抗體的血液半衰期相比增加配體結合分子的血液半衰期的一個實施方案,存在使單域抗體與具有白蛋白結合特性的部分融合的方法。白蛋白不經過腎臟排泄并且還具有FcRn結合能力,它在血液中具有17至19天的長半衰期(JClinInvest.1953Aug;32(8):746-768)。因此,與白蛋白結合的蛋白質變大,也可以間接與FcRn結合,據報道血液中的半衰期增加(Antibodies2015,4(3),141-156)。此外,作為與單獨的單域抗體的血液半衰期相比增加配體結合分子的血液半衰期的一種實施方案,存在使單域抗體與聚乙二醇化部分融合的方法。認為使蛋白質聚乙二醇化會使蛋白質變大,同時抑制血液蛋白酶的分解,從而延長蛋白質的血液半衰期(JPharmSci.2008Oct;97(10):4167-83)。將蛋白酶切割序列引入能夠與配體結合的分子中的方法的實例包括將蛋白酶切割序列插入能夠與配體結合的多肽的氨基酸序列中的方法,以及用蛋白酶切割序列替換能夠與配體結合的多肽的氨基酸序列一部分的方法。獲得能夠與配體結合的分子的方法的實例包括獲得具有與配體結合能力的配體結合區的方法。通過使用例如本領域已知的抗體制備方法的方法獲得配體結合區。通過該制備方法得到的抗體可以直接用于配體結合區,也可以只使用得到的抗體中的Fv區。當單鏈(也稱為“sc”)形式中的Fv區能夠識別抗原時,可以僅使用單鏈?;蛘?,可以使用包含Fv區的Fab區。在能夠結合配體的分子中引入了蛋白酶切割序列的分子作為本公開的配體結合分子??梢匀芜x地確認配體結合分子是否通過用適合蛋白酶切割序列的蛋白酶處理而被切割。蛋白酶切割序列的切割的存在或不存在可以通過例如使蛋白酶與將蛋白酶切割序列引入能夠與配體結合的分子中的分子接觸,并通過電泳方法例如SDS-PAGE確定蛋白酶處理的產物的分子量來確認。在某些實施方案中,當本公開的多肽是配體結合分子時,提供了產生配體-配體結合分子的方法。例如,提供產生配體和配體結合分子的復合物的方法,所述方法包括使配體結合分子與配體接觸,回收由配體結合分子和配體組成的復合物。該復合物可以與藥學上可接受的載體一起配制以提供藥物組合物。本公開還涉及產生配體結合分子或者配體結合分子與配體融合的融合蛋白的方法,當配體結合分子被切割時,其與配體的結合減弱。當本公開的多肽是配體結合分子時,在一個實施方案中,本公開提供了產生配體結合分子或融合蛋白的方法,包括將蛋白酶切割序列引入能夠結合到配體的分子中。生產多肽的方法本公開還涉及編碼包含蛋白酶底物或蛋白酶切割序列的多肽的多核苷酸。根據本公開的多核苷酸通常由合適的載體攜帶(或插入)并轉染到宿主細胞中。載體沒有特別限制,只要載體可以穩定地保留插入的核酸。例如,當使用大腸桿菌作為宿主時,pBluescript載體(由StratageneCorp.制造)等優選作為用于克隆的載體,盡管可以使用各種市售載體。在為了產生本公開的多肽而使用載體的情況下,表達載體特別有用。表達載體沒有特別限制,只要該載體允許多肽在體外、在大腸桿菌、培養細胞或在個體生物體中表達。表達載體優選為例如用于體外表達的pBEST載體(由PromegaCorp.制造)、用于在大腸桿菌中表達的pET載體(由InvitrogenCorp.制造)、用于在培養細胞中表達的pME18S-FL3載體(GenBank登陸號AB009864),以及用于在個體生物體中表達的pME18S載體(MolCellBiol.8:466-472(1988))。本公開的DNA插入載體可以通過常規方法進行,例如使用限制性位點的連接酶反應(CurrentprotocolsinMolecularBiologyedit.Ausubeletal.(1987)Publish.JohnWiley&Sons.Section11.4-11.11)。宿主細胞沒有特別限制,可以根據目的使用各種宿主細胞。用于表達多肽的細胞的實例可以包括細菌細胞(例如,鏈球菌屬(Streptococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、大腸桿菌(E.coli)、鏈霉菌屬(Streptomyces)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis))、真菌細胞(例如,酵母和曲霉屬(Aspergillus))、昆蟲細胞(例如,果蠅S2(DrosophilaS2)和灰翅夜蛾屬SF9(SpodopteraSF9))、動物細胞(例如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293和Bowes黑色素瘤細胞)和植物細胞。載體向宿主細胞的轉染可以通過本領域已知的方法進行,例如磷酸鈣沉淀法、電穿孔法(CurrentprotocolsinMolecularBiologyedit.Ausubeletal.,(1987)Publish.JohnWiley&Sons.Section9.1-9.9)、Lipofectamine方法(由GIBCO-BRL/ThermoFisherScientificInc.制造)或顯微注射方法??梢詫⒑线m的分泌信號參入目標多肽中,以便將在宿主細胞中表達的多肽分泌到內質網腔、周質空間或細胞外環境中。信號可以是目標多肽的內源性信號,或者可以是外源信號。當本公開的多肽被分泌到培養基中時,上述生產方法中多肽的回收包括培養基的回收。當本公開的多肽在細胞中產生時,首先裂解細胞,然后回收多肽。包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析的本領域已知的方法可用于從重組細胞培養物回收和純化本公開的多肽。治療本說明書中使用的“治療(treatment)”(及其語法派生詞,例如“治療(treat)”和“治療(treating)”)是指旨在改變待治療個體的自然病程的臨床干預,并且用于預防和在臨床病理狀況期間進行。治療的理想效果包括但不限于預防疾病的發展或復發、減輕癥狀、減輕疾病的任何直接或間接病理影響、預防轉移、減少疾病進展的速度,疾病狀況的恢復或緩解,以及改良或改善的預后。在一些實施方案中,包含蛋白酶切割序列的本公開的多肽可用于延遲疾病的發病或延遲疾病的進展。藥物組合物本公開還涉及藥物組合物(藥劑),其包含含有蛋白酶切割序列的多肽和藥學上可接受的載體;藥物組合物(藥劑),其包含含有蛋白酶切割序列的多肽、配體和藥學上可接受的載體;以及藥物組合物(藥劑),其包含融合蛋白和藥學上可接受的載體,其中融合蛋白中包含蛋白酶切割序列的多肽與配體融合。在本公開中,藥物組合物一般是指用于治療或預防疾病的藥劑,或用于檢查或診斷的藥劑。在本公開中,術語“包含包含蛋白酶切割序列的多肽的藥物組合物”可以改述為“用于治療疾病的方法,包括向待治療的受試者施用包含蛋白酶切割序列的多肽”,或改述為“包含蛋白酶切割序列的多肽用于治療疾病的用途”,或“包含蛋白酶切割序列的多肽在生產用于治療疾病的藥物中的用途”。在本公開中,術語“包含配體和包含蛋白酶切割序列的多肽的藥物組合物”可以改述為“用于治療疾病的方法,包括向待治療的受試者施用配體和包含蛋白酶切割序列的多肽”,或改述為“配體和包含蛋白酶切割序列的多肽用于治療疾病的用途”,或改述為“配體和包含蛋白酶切割序列的多肽在生產用于治療疾病的藥物中的用途”。在本公開中,術語“包含融合蛋白的藥物組合物”可以改述為“用于治療疾病的方法,包括向待治療的受試者施用融合蛋白”,或改述為“融合蛋白用于治療疾病的用途”,或改述為“融合蛋白在生產治療疾病的藥物中的用途”。本公開的藥物組合物可以通過使用本領域技術人員已知的方法來配制。例如,藥物組合物可以以無菌溶液或混懸液與水或任何其他藥學上可接受的液體的注射液的形式腸胃外使用。藥物組合物可以例如通過與藥理學上可接受的載體或介質,具體地,無菌水或生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩定劑、調味劑、賦形劑、運載體、抗菌劑、粘合劑等適當組合,并將它們混合成通常接受的藥物實踐所需的單位劑型來配制。這些制劑中的活性成分的量設定為在規定范圍內提供合適的體積。注射用無菌組合物可以根據通常的藥學實踐使用運載體如可注射蒸餾水來配制??勺⑸渌芤旱膶嵗ê猩睇}水、葡萄糖或其他佐劑(例如,D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇和氯化鈉)的等滲溶液。水溶液可與適當的增溶劑,例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)或非離子表面活性劑(Polysorbate80TM,HCO-50,等)組合使用。油狀液體的實例包括芝麻油和大豆油,并且可以組合使用苯甲酸芐酯和/或苯甲醇作為增溶劑。油狀液體可以與緩沖液(例如磷酸鹽緩沖液和醋酸鈉緩沖液)、安撫劑(soothingagent)(例如鹽酸普魯卡因)、穩定劑(例如苯甲醇和苯酚)或抗氧化劑組合。通常將配制好的注射溶液裝入合適的安瓿中。本公開的藥物組合物優選通過腸胃外途徑施用。例如,施用用于注射、經鼻施用、經肺施用或經皮施用的組合物。藥物組合物可以通過例如靜脈內注射、肌內注射、腹腔內注射或皮下注射全身或局部施用??梢愿鶕颊叩哪挲g和癥狀適當地選擇施用方法。本公開的藥物組合物的劑量可以確定在例如0.0001mg至1000mg/kg體重/劑量的范圍內?;蛘?,劑量可確定為例如每位患者0.001至100000mg。然而,本公開不必受限于這些數值。劑量和施用方法根據患者的體重、年齡、癥狀等而變化,本領域技術人員可以考慮這些情況來確定合適的劑量和施用方法。當本公開的多肽是配體結合分子時,在一些實施方案中,含有配體結合分子的組合物可以被施用于個體。施用至個體的配體結合分子與個體中原本存在的配體結合,例如在血液或組織中,處于與配體結合的狀態的配體結合分子進一步在體內轉運。轉運至患病組織的配體結合分子可以在患病組織中被切割,從而可以減弱其與配體的結合以在患病組織中釋放結合的配體。釋放的配體可以在患病組織中發揮生物學活性并治療起源于患病組織的疾病。在其中配體結合分子在與配體結合時抑制配體的生物學活性并且在患病組織中被特異性切割的實施方案中,配體在運輸過程中不發揮生物學活性并且僅當配體-結合分子在患病組織中被切割時發揮生物學活性。因此,可以減少全身不良反應來治療疾病。當本公開的多肽是配體結合分子時,在一些實施方案中,可以分別或同時向個體施用含有配體結合分子的組合物和含有配體的組合物?;蛘?,可以將含有配體結合分子和配體兩者的組合物施用于個體。在將含有配體結合分子和配體兩者的組合物施用于個體的情況下,組合物中的配體結合分子和配體可以形成復合物。在將配體結合分子和配體兩者施用至個體的情況下,施用至個體的配體結合分子與配體結合,處于與配體結合的狀態的配體結合分子在體內被運輸。運輸至患病組織的配體結合分子可以在患病組織中切割,從而減弱其與配體的結合以在患病組織中釋放結合的配體。釋放的配體可以在患病組織中發揮生物學活性并治療起源于患病組織的疾病。在其中配體結合分子在與配體結合時抑制配體的生物學活性并且在患病組織中被特異性切割的實施方案中,配體在運輸過程中不發揮生物學活性并且僅當配體-結合分子在患病組織中被切割時發揮生物學活性。因此,治療疾病的全身不良反應減少。除了施用于個體的配體之外,施用于個體的配體結合分子還能夠結合最初存在于個體中的配體。處于與最初存在于個體中的配體或施用至個體的配體結合的狀態下的配體結合分子可以在體內轉運。當本公開的多肽是配體結合分子時,在一些實施方案中,可以將配體結合分子與配體融合的融合蛋白施用于個體。在這些實施方案中,融合蛋白中的配體結合分子和配體通過或不通過接頭融合。非共價鍵仍然存在于配體結合分子部分和配體部分之間。在將與配體融合的配體結合分子的融合蛋白施用于個體的情況下,融合蛋白在體內轉運,然后融合蛋白中的配體結合分子部分在患病組織中被切割,使得配體結合分子部分與配體的非共價鍵減弱,以從融合蛋白釋放配體和配體結合分子的一部分。釋放的配體和釋放的配體結合分子的一部分可以在患病組織中發揮配體的生物學活性,治療起源于患病組織的疾病。在配體結合分子與配體結合時抑制配體的生物學活性并在患病組織中被特異性切割的實施方案中,融合蛋白中的配體在運輸過程中不發揮生物學活性而僅當融合蛋白在患病組織中被切割時發揮生物學活性。因此,可以減少全身不良反應來治療疾病。由于本公開多肽中所含的蛋白酶切割序列被蛋白裂解酶和/或尿激酶切割,因此其預期在癌組織中被切割,這允許在減少全身副作用的同時治療癌癥。本領域技術人員應當理解,只要基于本領域的公知技術知識不存在技術矛盾,本說明書中描述的一個或多個實施方案的任意組合也包括在本公開中。此外,被排除在本公開之外的發明(其是本說明書中描述的一個或多個實施方案的任意組合)應被視為本說明書中意圖或描述的發明,只要基于本領域技術常識不存在技術矛盾即可。[實施例]以下是本公開的方法和組合物的實施例。應當理解,根據上述一般描述可以執行各種其他實施方案。[實施例1]利用肽陣列探索蛋白酶切割序列1-1.多肽文庫的設計與構建基于序列TSTSGRSANPRG(SEQIDNO:1)設計了15個氨基酸的肽庫,該序列可以被uPA和MP-SP1切割。向SEQIDNO:1所示序列的N-和C-末端之一或兩者添加Gly或Ser,或兩者,并且進一步改變SEQIDNO:1所示序列的部分氨基酸以使其具有除C、R和K之外的任何天然存在的氨基酸,從而設計文庫1:GGSXXXXXRSANPRG(SEQIDNO:18079)、文庫2:TSTSGRXXXXXGGGS(SEQIDNO:18080)和文庫3:GGGSXXXRXXGGGSG(SEQIDNO:18081)(X表示除C、R和K之外的17個天然存在的氨基酸中的任何一個)。肽庫文庫1、文庫2和文庫3根據MolCellProteomics,2014Jun,13(6):1585-97;doi:10.1074/mcp.M113.033308;Epub2014Apr4中描述的方法合成,并制備了其上固定這些肽庫的肽陣列。1-2.肽的切割和數據分析根據MolCellProteomics,2014Jun,13(6):1585-97;doi:10.1074/mcp.M113.033308;Epub2014Apr4中描述的方法進行蛋白酶對陣列上肽的切割的評估。為了評估蛋白酶的切割,每個肽陣列都用重組人u-纖溶酶原激活物/尿激酶(人uPA、huPA)(R&DSystems;1310-SE-010)、重組人蛋白裂解酶/ST14催化結構域(人MT-SP1、hMT-SP1)(R&DSystems;3946-SE-010)和重組小鼠u-纖溶酶原激活物/尿激酶(小鼠uPA、muPA)(abcam;ab92641)處理。為了評估血清中肽的切割,每個肽陣列都用人血清(hserum)(ValleyBiomedical;HS1004C)處理。處理條件見表1和表2。作為蛋白酶切割的對照(陽性對照),文庫1中使用了GGSTSTSGRSANPRG(SEQIDNO:2),文庫2和3中使用了TSTSGRSANPRGGS(SEQIDNO:3)。作為非特異性切割的對照(陰性對照),使用GGGSGGGSGGGSGGG(SEQIDNO:4)。切割比率(蛋白水解活性率,縮寫為PAR)根據下式計算:僅用PBS處理后的熒光(RFU)/用蛋白酶處理后的熒光(RFU)。[表1]蛋白酶切割的處理條件蛋白酶蛋白酶濃度緩沖液反應時間反應溫度人uPA1000nMPBS1小時37℃人MT-SP1500nMPBS1小時37℃小鼠uPA1000nMPBS1小時37℃[表2]用血清切割的處理條件蛋白酶反應溶液反應時間反應溫度人血清稀釋至80%的人血清過夜37℃在文庫1中,對于人uPA和人MT-SP1的切割,17,197個序列顯示出比SEQIDNO:2所示序列更高的切割比率(SEQIDNO:5-17201),對于人uPA、人MT-SP1和小鼠uPA的所有切割,3,200個序列顯示出比SEQIDNO:2所示序列更高的切割比率(SEQIDNO:5-3204)。其中,人血清中,452個序列顯示出比SEQIDNO:4所示序列更低的切割比率(SEQIDNO:5-456)。對于人uPA和人MT-SP1的切割,在顯示出比SEQIDNO:2所示序列更高的切割比率的17,197個序列中,有7,567個序列通過被人uPA、人MT-SP1和小鼠uPA的切割比率除以被人血清的切割比率(當人血清的切割比率小于1時,將其轉換為1后)獲得的所有值的得分都高于SEQIDNO:2所示序列,且對人uPA和人MT-SP1,切割比率也高于SEQIDNO:2所示序列(SEQIDNO:5-1811和3205-8964)。在文庫2中,對于被人uPA和人MT-SP1的切割,792個序列顯示出比SEQIDNO:3所示的序列更高的切割比率(SEQIDNO:17202-17993)。其中,對小鼠uPA,兩個序列還顯示出比SEQIDNO:3所示序列更高的切割比率(SEQIDNO:17202和17203)。在對人uPA和人MT-SP1顯示出比SEQIDNO:3所示序列更高切割比率的792個序列中,175個序列在人血清中顯示出比SEQIDNO:4低的切割比率(SEQIDNO:17204-17378)。在文庫3中,對于被人uPA和人MT-SP1的切割,10個序列顯示出比SEQIDNO:3所示序列更高的切割比率(SEQIDNO:17994-18003)。其中,6個序列還顯示出比SEQIDNO:3所示序列更高的被對小鼠uPA的切割比率(SEQIDNO:17994-17999)。在對人uPA和人MT-SP1顯示出比SEQIDNO:3所示的序列更高的切割比率的10個序列中,有7個序列在人血清中顯示出比SEQIDNO:4所示序列更低的切割比率(SEQIDNO:17994-17996和18000-18003)。[實施例2]導入了蛋白酶切割序列的配體結合分子的實施例圖5和圖6示出了分子的例子,其中當多肽是配體結合分子時,抗體被用作配體結合分子。在這些實施例中,最初獲得了針對配體的中和抗體。隨后,蛋白酶切割序列被引入到抗配體中和抗體的可變區(VH或VL)和恒定區(CH1或CL)之間的邊界附近。確認了在引入蛋白酶切割序列后抗配體抗體的配體結合活性的保留。在配體與抗配體中和抗體結合的狀態下證實了通過蛋白酶切割的配體的解離。證實了由此解離的配體的生物學活性的發揮。在圖5中,配體的C-末端和抗配體抗體的VH的N-末端通過接頭連接,在VH和CH1的邊界附近引入了蛋白酶切割序列。當抗配體抗體對配體具有足夠強的親和力時,配體的生物學活性被充分抑制。這種配體-抗-配體抗體融合體在全身施用時不發揮其生物學活性,因為配體被中和。配體-抗-配體抗體融合體具有Fc區;因此,它的半衰期很長。從全身施用的配體-抗配體抗體融合體中,當位于VH和CH1邊界附近的蛋白酶切割序列被腫瘤組織中高度表達的蛋白酶切割時,配體-接頭-抗配體抗體的VH分子被釋放。由于單獨的VH或VL不能與配體結合(VH和VL都是與配體結合所必需的),因此配體的中和作用被消除,配體能夠在腫瘤組織中發揮其生物學活性。另外,配體-接頭-抗-配體抗體的釋放的VH分子缺少Fc區,具有小分子量;因此,它的半衰期很短,并能被迅速全身清除。因此,可以最小化由配體引起的全身副作用。在圖6中,與圖5不同,配體和抗配體抗體不通過接頭連接,并且在VH和CH1之間的邊界附近的位置引入了蛋白酶切割序列的抗配體抗體與配體混合,然后被施用。當抗配體抗體對配體具有足夠強的親和力并且相對于配體濃度有足夠的抗配體抗體時,配體的生物學活性被充分抑制。這種配體-抗-配體抗體復合物在全身施用時不發揮其生物學活性,因為配體被中和。配體-抗-配體抗體復合物具有Fc區;因此,它的半衰期很長。從全身施用的配體-抗配體抗體復合物,當位于VH和CH1之間邊界附近的蛋白酶切割序列被腫瘤組織中高表達的蛋白酶切割時,抗配體抗體的VH分子被釋放。由于單獨的VH或VL不能與配體結合(VH和VL都是與配體結合所必需的),因此配體的中和作用被消除,配體能夠在腫瘤組織中發揮其生物學活性。另外,釋放的配體分子沒有Fc區,分子量??;因此,它的半衰期很短,并能被迅速全身清除。因此,可以最小化由配體引起的全身副作用。因此,使用在VH和CH1之間的邊界附近引入蛋白酶切割序列的抗配體抗體可以允許配體在蛋白酶表達組織中選擇性釋放,從而使配體發揮其生物學活性。當配體是細胞因子時,可以允許細胞因子在蛋白酶表達組織中選擇性地發揮其作用。當配體為趨化因子時,趨化因子可使表達趨化因子受體的細胞遷移到表達蛋白酶的組織中,因為趨化因子在蛋白酶表達組織中以高濃度存在,而外周血中趨化因子濃度降低。[實施例3]含有導入蛋白酶切割序列的單域抗體的配體結合分子的實施例圖7-10說明了當多肽是包含單域抗體的配體結合分子時,包含引入了蛋白酶切割序列的單域抗體的配體結合分子的實例。圖7說明了僅包含單域抗體的配體結合分子的實例,在該單域抗體中引入了蛋白酶切割序列。在蛋白酶切割序列未被切割的狀態下,單域抗體能夠與配體結合,并且當單域抗體對配體具有足夠強的親和力時,配體的生物學活性被充分抑制。即使全身施用配體結合分子和配體,由于配體-配體結合分子復合物中的配體被中和,該配體也不會發揮其生物學活性。配體-配體結合分子復合物比單獨的配體具有更長的半衰期。在全身施用由配體和配體結合分子形成的復合物中,當放置在單域抗體中的蛋白酶切割序列被腫瘤組織中高表達的蛋白酶切割時,單域抗體不再能夠結合于配體,配體的中和作用被消除,并且配體能夠在腫瘤組織中發揮其生物學活性。圖8示出了融合多肽的實例,其中配體與配體結合分子融合,該配體結合分子僅包含蛋白酶切割序列被引入其中的單域抗體。在蛋白酶切割序列未被切割的狀態下,融合多肽中的單域抗體能夠與配體結合,當單域抗體對配體的親和力足夠強時,配體的生物學活性被充分抑制。即使當全身施用融合多肽時,融合多肽中的配體也不會發揮其生物學活性,因為它被中和了,并且融合多肽的半衰期比單獨的配體更長。在全身施用的融合多肽中,當放置在單域抗體中的蛋白酶切割序列被腫瘤組織中高表達的蛋白酶切割時,融合多肽中的單域抗體不再能夠與配體結合,配體的中和作用被消除,含有配體的融合多肽的一部分被釋放,配體能夠在腫瘤組織中發揮其生物學活性。圖9和圖10說明了配體結合分子以及配體結合分子和配體的融合多肽的實例,所述配體結合分子包含引入了蛋白酶切割序列的單域抗體、抗體鉸鏈區和抗體Fc區。如在圖7和圖8中所示的實施方案中那樣,配體可以在未切割狀態下被單域抗體中和,在切割狀態下釋放以發揮其生物學活性。在圖9和圖10所示的實例中,考慮到抗體Fc區包含在未切割狀態的復合物或融合多肽中,融合多肽在未切割狀態下的半衰期預計比圖7和8所示的實例中的更長。[實施例4]導入了蛋白酶切割序列的含有抗人IL-6R單域抗體的配體結合分子4-1.通過將蛋白酶切割序列引入含有抗人IL-6R單域抗體的多肽中來制備配體結合分子通過將蛋白酶切割序列插入包含在多肽IL6R90-G1T3dCHdC(SEQIDNO:18030)中的單域抗體中,制備了含引入了蛋白酶切割序列的單域抗體的配體結合分子,所述多肽IL6R90-G1T3dCHdC通過使針對人IL-6R的單域抗體的C-末端(SEQIDNO:18028)和SEQIDNO:18029所示的抗體鉸鏈區和Fc區序列的N-末端融合來制備。首先,將含有據報道被癌癥特異性表達的MT-SP1切割的肽序列(LSGRSDNH,SEQIDNO:18031)的序列插入多肽IL6R90-G1T3dCHdC中,并制備表3中所示的配體結合分子。這些分子使用Expi293(LifeTechnologies)通過瞬時表達表達并通過本領域技術人員已知的基于蛋白A的方法進行純化。作為不含蛋白酶切割序列的對照分子,表達并純化了IL6R90-G1T3dCHdC。如此制備的配體結合分子和對照分子是如圖9所示的二聚體蛋白質。[表3]配體結合分子4-2.包含引入蛋白酶切割序列的抗人IL-6R單域抗體的配體結合分子與人IL-6R的結合評價4-2-1.蛋白酶處理向0.1mg/mL實施例4-1中制備的配體結合分子中加入終濃度為25nM的重組人蛋白裂解酶/ST14催化結構域(hMT-SP1,R&Dsystemsm3946-SE-010),并在37℃溫育過夜,從而制備含有經蛋白酶處理的配體結合分子的溶液。制備含有未經蛋白酶處理的配體結合分子的溶液的條件是加入相同體積的PBS代替蛋白酶并在相同條件下儲存。4-2-2.配體結合分子的蛋白酶切割的確認(SDS-PAGE)進行SDS-PAGE以確認配體結合分子是否被實施例4-2-1中進行的蛋白酶處理切割。將9μL含有實施例4-2-1中制備的經蛋白酶處理的配體結合分子/未經蛋白酶處理的配體結合分子的溶液與3μL樣品緩沖液混合并在95℃下溫育1分鐘。隨后,使用Mini-PROTEANTGX凝膠(4-20%15孔)(Bio-Rad#456-1096)進行電泳,并用SampleBlueSafeStain(novex,LC6065)對蛋白質進行染色。結果如圖11所示。如圖11所示,雖然無論用蛋白酶處理還是未用蛋白酶處理,不含蛋白酶切割序列的對照分子都在相同位置顯示條帶(泳道12和13),但引入相應蛋白酶切割序列的配體結合分子僅在用蛋白酶處理時才顯示出新的條帶,這表明含有引入各自的蛋白酶切割序列的單域抗體的配體結合分子被蛋白酶處理切割。4-2-3.經蛋白酶處理的配體結合分子/未經蛋白酶處理的配體結合分子與人IL-6R結合的評價向20μL的含有實施例4-2-1中制備的經蛋白酶處理的配體結合分子/未經蛋白酶處理的配體結合分子的溶液中加入60μL的PBS以制備用于評價IL-6R結合的樣品。使用生物層干涉測量法(BLI方法)對樣品的IL-6R結合進行評估。將IL-6R結合評估樣品和IL-6R分配到傾斜底部(TW384)微孔板(Fortebio,18-5076)中。蛋白質G傳感器(ForteBio,18-0022)用PBS水合,并使用OctetRED384在25度的設置下進行測量。在含有PBS的孔中進行基線測量30秒,然后讓抗體與蛋白G傳感器結合200秒。再次,在含有PBS的孔中進行基線測量30秒,然后在含有500nM人IL-6R的孔中測量結合180秒,在含有PBS的孔中測量解離180秒。圖12顯示了顯示結合的實時結合圖。如圖12所示,與使用未經蛋白酶處理的配體結合分子相比,使用每個都導入了蛋白酶切割序列的配體結合分子時,人IL-6R的結合量減少。[實施例5]人IL-6R與含有導入了蛋白酶切割序列的抗人IL-6R單域抗體的配體結合分子的融合蛋白的制備及評價(配體結合分子-IL-6R融合蛋白)5-1.人IL-6R與含有引入了蛋白酶切割序列的抗人IL-6R單域抗體的配體結合分子的融合蛋白的制備配體結合分子-IL-6R融合蛋白通過將實施例4-1中制備的配體結合分子的N-末端與人IL-6R(SEQIDNO:18037)的C-末端通過由甘氨酸和絲氨酸組成的各種接頭(表4)融合而制備。這些融合蛋白通過本領域技術人員已知的方法使用Expi293(LifeTechnologies)通過瞬時表達表達,并使用本領域技術人員已知的基于蛋白A的方法進行純化。如此制備的融合蛋白是二聚體蛋白,每個蛋白具有兩條肽鏈,其序列如表4所示。[表4]配體結合分子-IL6R融合蛋白名稱SEQIDNO:IL6RaG4S.6R90H12I001-G1T3dCH1dC18038IL6RaG4Sx2.6R90H12I001-G1T3dCH1dC18039IL6RaG4Sx3.6R90H12I001-G1T3dCH1dC18040IL6RaG4Sx4.6R90H12I001-G1T3dCH1dC18041IL6RaG4Sx5.6R90H12I001-G1T3dCH1dC18042IL6RaG4S6R90H13I001-G1T3dCH1dC18043IL6RaG4Sx2.6R90H13I001-G1T3dCH1dC18044IL6RaG4Sx3.6R90H13I001-G1T3dCH1dC18045IL6RaG4Sx4.6R90H13I001-G1T3dCH1dC18046IL6RaG4Sx5.6R90H13I001-G1T3dCH1dC18047IL6RaG4S.6R90H14IG001-G1T3dCH1dC18048IL6RaG4Sx2.6R90H14IG001-G1T3dCH1dC18049IL6RaG4Sx3.6R90H14IG001-G1T3dCH1dC18050IL6RaG4Sx4.6R90H14IG001-G1T3dCH1dC18051IL6RaG4Sx5.6R90H14IG001-G1T3dCH1dC18052IL6RaG4S.6R90H15I001-G1T3dCH1dC18053IL6RaG4Sx2.6R90H15I001-G1T3dCH1dC18054IL6RaG4Sx3.6R90H15I001-G1T3dCH1dC18055IL6RaG4Sx4.6R90H15I001-G1T3dCH1dC18056IL6RaG4Sx5.6R90H15I001-G1T3dCH1dC18057IL6RaG4S.6R90H16IG001-G1T3dCH1dC18058IL6RaG4Sx2.6R90H16IG001-G1T3dCH1dC18059IL6RaG4Sx3.6R90H16IG001-G1T3dCH1dC18060IL6RaG4Sx4.6R90H16IG001-G1T3dCH1dC18061IL6RaG4Sx5.6R90H16IG001-G1T3dCH1dC18062作為不含蛋白酶切割序列的對照分子,制備其中IL6R90-G1T3dCHdC(SEQIDNO:18030)的N-末端與IL-6R的C-末端通過接頭融合的分子(表5),并進行表達和純化。如此制備的對照分子也是二聚體蛋白質,其各自具有兩條肽鏈,其序列如表5所示。[表5]不含蛋白酶切割序列的對照分子名稱SEQIDNO:IL6RaG4S.IL6R90-G1T3dCH1dC18063IL6RaG4Sx2.IL6R90-G1T3dCH1dC18064IL6RaG4Sx3.IL6R90-G1T3dCH1dC18065IL6RaG4Sx4.IL6R90-G1T3dCH1dC18066IL6RaG4Sx5.IL6R90-G1T3dCH1dC180675-2.配體結合分子-IL-6R融合蛋白的蛋白酶切割的評價5-2-1.蛋白酶處理向0.1mg/mL的實施例5-1中制備的配體結合分子-IL-6R融合蛋白中加入終濃度25nM的重組人蛋白裂解酶/ST14催化結構域(hMT-SP1,R&Dsystemsm3946-SE-010)并在37℃下溫育過夜,從而制備含有經蛋白酶處理的融合蛋白的溶液。制備含有未經蛋白酶處理的融合蛋白的溶液的條件是加入相同體積的PBS代替蛋白酶并在相同條件下儲存。5-2-2.確認抗IL-6R單域抗體-IL-6R融合蛋白的蛋白酶切割(SDS-PAGE)進行SDS-PAGE以確認配體結合分子-IL-6R融合蛋白是否被實施例5-2-1中進行的蛋白酶處理切割。將9μL含有實施例5-2-1中制備的經蛋白酶處理的融合蛋白/未經蛋白酶處理的融合蛋白的溶液與3μL樣品緩沖液混合并在95℃下溫育1分鐘。隨后,使用Mini-PROTEANTGX凝膠(4-20%15孔)(Bio-Rad#456-1096)進行電泳,并用SampleBlueSafeStain(novex,LC6065)對蛋白質進行染色。結果示于圖13和圖16中。如圖13-16所示,雖然不含蛋白酶切割序列的對照分子無論經蛋白酶處理還是未經蛋白酶處理都在相同位置顯示條帶,但包含含有引入了蛋白酶切割序列的單域抗體的配體結合分子的融合蛋白僅在用蛋白酶處理后才顯示新條帶,表明包含含有引入了蛋白酶切割序列的單域抗體的配體結合分子的融合蛋白被蛋白酶處理切割。5-2-3.含有生物素化抗IL-6R單域抗體的分子的制各作為檢測與配體結合分子融合的IL-6R的釋放的方法,使用以下方法:將生物素添加到識別IL-6R的含有單域抗體的分子中;檢測游離IL-6R與含生物素化抗IL-6R單域抗體的分子的結合。如下制備含生物素化抗IL-6R單域抗體的分子:制備含有抗IL-6R單域抗體的分子,其單域抗體的部分序列與IL6R90-G1T3dCH1dC(SEQIDNO:18030)相同,制備了IL6R90-FcBAPdC(SEQIDNO:18069),其在其C-末端添加了生物素額外序列(AviTag序列,SEQIDNO:18068)。制備編碼IL6R90-FcBAPdC的基因片段,然后通過本領域技術人員已知的方法將其導入用于在動物細胞中表達的載體。同時將表達EBNA1和生物素連接酶的基因同時導入載體,加入生物素進行生物素標記。導入基因的細胞在37℃、8%CO2條件下培養,目標含生物素化抗IL-6R單域抗體的分子(IL6R90-bio)被分泌到培養上清液中。使用本領域技術人員已知的方法從培養上清液中純化IL6R90-bio。5-2-4.通過蛋白酶處理評估IL-6R從融合蛋白的釋放使用實施例5-2-3中制備的含生物素化抗IL-6R單域抗體的分子(IL6R90-bio)通過生物層干涉測量法(BLI法)評價通過用蛋白酶處理融合蛋白的IL-6R釋放。將實施例5-2-1中制備的經蛋白酶處理的融合蛋白、未經蛋白酶處理的融合蛋白和IL6R90-bio中的每一種分配到傾斜底(TW384)微板(ForteBio,18-5076)的不同孔中。鏈霉親和素生物傳感器(ForteBio,18-5021)用PBS水合,并使用OctetRED384在27℃的設置下進行測量。在含有PBS的孔中進行基線測量30秒,然后使IL6R90-bio與鏈霉親和素傳感器結合200秒。再次,在含有PBS的孔中進行基線測量30秒,然后在含有經蛋白酶處理的融合蛋白或未經蛋白酶處理的融合蛋白的孔中測量結合180秒,然后在含有PBS的孔中測量解離180秒。圖17和18示出了顯示結合的實時結合的圖。如圖17和18所示,在IL-6R和含有引入了蛋白酶切割序列的單域抗體的配體結合分子的融合蛋白的情況下,與未用蛋白酶處理時相比,當用蛋白酶處理時與IL6R90-bio結合的人IL-6R的量增加。因此,融合蛋白中的單域抗體與IL-6R的結合活性被蛋白酶處理減弱,并且IL-6R從融合蛋白中釋放。[實施例6]人PD-1與含有引入了蛋白酶切割序列的抗人PD-1單域抗體的配體結合分子的融合蛋白的制備及評價(配體結合分子-PD-1融合蛋白)6-1.人PD-1與含有引入了蛋白酶切割序列的抗人PD-1單域抗體的配體結合分子的融合蛋白的制備使用本領域技術人員已知的方法制備PD102C3-G1T3noCyshinge(SEQIDNO:18070)和PD102C12-G1T3noCyshinge(SEQIDNO:18071),其中人抗體恒定區與結合人PD-1的單域抗體融合。然后,在引入蛋白酶切割序列后,PD102C3-G1T3noCyshinge和PD102C12-G1T3noCyshinge中的每一個都在其N-末端與人PD-1胞外域的C-末端(SEQIDNO:18072)通過由甘氨酸和絲氨酸組成的接頭融合,從而制備配體結合分子-PD-1融合蛋白(表6)。這些融合蛋白通過本領域技術人員已知的方法使用Expi293(LifeTechnologies)通過瞬時表達表達,并使用本領域技術人員已知的基于蛋白A的方法進行純化。如此制備的融合蛋白是二聚體蛋白,每個蛋白具有兩條肽鏈,其序列如表6所示。[表6]配體結合分子-人PD1融合蛋白名稱SEQIDNO:hPD1PD102C3H12-G1T3noCyshinge18073hPD1PD102C3H13-G1T3noCyshinge18074hPD1PD102C12H12-G1T3noCyshinge18075hPD1PD102C12H14-G1T3noCyshinge180766-2.配體結合分子-PD-1融合蛋白的蛋白酶切割評估6-2-1.蛋白酶處理向0.1mg/mL的實施例6-1中制備的配體結合分子-PD-1融合蛋白中加入終濃度25nM的重組人蛋白裂解酶/ST14催化結構域(hMT-SP1,R&Dsystemsm3946-SE-010)并在37℃下溫育過夜,從而制備含有經蛋白酶處理的融合蛋白的溶液。制備含有未經蛋白酶處理的融合蛋白的溶液的條件是加入相同體積的PBS代替蛋白酶并在相同條件下儲存。6-2-2.確認抗PD-1單域抗體-PD-1融合蛋白的蛋白酶切割(SDS-PAGE)進行SDS-PAGE以確認配體結合分子-PD-1融合蛋白是否被實施例6-2-1中進行的蛋白酶處理切割。將9μL含有實施例6-2-1中制備的經蛋白酶處理的融合蛋白/未經蛋白酶處理的融合蛋白的溶液與3μL樣品緩沖液混合并在95℃下溫育1分鐘。隨后,使用Mini-PROTEANTGX凝膠(4-20%15孔)(Bio-Rad#456-1096)進行電泳,并用SampleBlueSafeStain(novex,LC6065)對蛋白質進行染色。結果如圖19所示。如圖19所示,含有引入了蛋白酶切割序列的單域抗體的配體結合分子的融合蛋白只有在蛋白酶處理后才顯示出新的條帶,表明含有含有引入了蛋白酶切割序列的單域抗體的配體結合分子的融合蛋白被蛋白酶處理切割。6-2-3.含生物素化抗PD-1單域抗體的分子的制備作為檢測與配體結合分子融合的PD-1的釋放的方法,使用以下方法:將生物素添加到識別PD-1的含有單域抗體的分子中;檢測游離PD-1與含生物素化抗PD-1單域抗體分子的結合。如下制備含生物素化抗PD-1單域抗體的分子:制備含有單域抗體的分子,其具有與PD102C3-G1T3noCyshinge的序列相同的單域抗體的部分序列,制備了在C-末端添加了生物素額外序列(AviTag序列,SEQIDNO:18068)的PD102C3-FcBAPdC(SEQIDNO:18077)。而且,制備含抗PD-1單域抗體的分子,其具有與PD102C12-G1T3noCyshinge的序列相同的單域抗體的部分序列,制備了通過在C-末端添加了生物素額外序列(AviTag序列,SEQIDNO:18068)的PD102C12-FcBAPdC(SEQIDNO:18078)。分別制備編碼PD102C3-FcBAPdC和PD102C12-FcBAPdC的基因片段,然后通過本領域技術人員已知的方法將其導入用于在動物細胞中表達的載體。同時將表達EBNA1和生物素連接酶的基因同時導入載體,加入生物素進行生物素標記。導入基因的細胞在37℃、8%CO2條件下培養,目標含生物素化抗PD-1單域抗體的分子(PD1-bio)被分泌到培養上清液中。使用本領域技術人員已知的方法從培養上清液中純化PD1-bio。6-2-4.通過蛋白酶處理PD-1從融合蛋白的釋放的評估使用實施例6-2-3中制備的含生物素化抗PD-1單域抗體的分子(PD1-bio)通過生物層干涉測量法(BLI法)評價通過用蛋白酶處理融合蛋白的PD-1的釋放。將實施例6-2-1中制備的經蛋白酶處理的融合蛋白、未經蛋白酶處理的融合蛋白和PD1-bio中的每一種分配到傾斜底(TW384)微板(ForteBio,18-5076)的不同孔中。適當地選擇PD102C3-FcBAPdC或PD102C12-FcBAPdC,使得PD1-bio可以與測量樣品中的單域抗體結合的相同表位結合。鏈霉親和素生物傳感器(ForteBio,18-5021)用PBS水合,并使用OctetRED384在27℃的設置下進行測量。在含有PBS的孔中進行基線測量30秒,然后使PD1-bio與鏈霉親和素傳感器結合200秒。再次,在含有PBS的孔中進行基線測量30秒,然后在含有經蛋白酶處理的融合蛋白或未經蛋白酶處理的融合蛋白的孔中測量結合180秒,然后在含有PBS的孔中測量解離180秒。圖20示出了實時結合的圖,該圖示出了結合。如圖20所示,在PD-1和含有引入了蛋白酶切割序列的單域抗體的配體結合分子的融合蛋白的情況下,與未用蛋白酶處理時相比,當它們用蛋白酶處理時,與PD1-bio結合的人PD-1的量增加。因此,融合蛋白中的單域抗體與PD-1的結合活性被蛋白酶處理減弱,并且PD-1從融合蛋白中釋放。為有助于清楚的理解,以上發明參考實際實例和圖示進行了詳細說明。然而,本說明書中提供的描述和圖示不應被解釋為限制本公開的范圍。在此引用的所有專利文獻和科學文獻的公開均明確地通過引用整體納入本文。[實施例7]插入了各種蛋白酶切割序列的抗體的評價7-1.插入了蛋白酶切割序列的抗體變體的制備將表7中列出的蛋白酶切割序列插入G7(重鏈:G7H-G1T4(SEQIDNO:18079);輕鏈:G7L-LT0(SEQIDNO:18080))的輕鏈可變區的位置106a(根據Kabat編號)和輕鏈恒定區的位置107a(根據Kabat編號)之間,G7是一種中和人CXCL10的抗體。上述制備的抗體輕鏈變體與重鏈組合的表7所示抗體變體,通過本領域技術人員已知的方法使用Expi293細胞(LifeTechnologies)通過瞬時表達表達,并使用本領域技術人員已知的基于蛋白A的方法純化。[表7]插入的序列和抗體變體7-2.對插入了蛋白酶切割序列的抗體變體的蛋白酶切割的評價為了評估實施例7-1中制備的抗體變體是否被蛋白酶處理切割,每個抗體變體用重組人u-纖溶酶原激活物/尿激酶(人uPA、huPA)(R&DSystems;1310-SE-010)、重組人蛋白裂解酶/ST14催化結構域(人MT-SP1、hMT-SP1)(R&DSystems;3946-SEB-010)和重組小鼠u-纖溶酶原激活物/尿激酶(小鼠uPA、muPA)(abcam;ab92641)中的每一種處理。在37℃下,使100μg/mL的抗體變體與huPA、hMT-SP1或muPA在PBS中反應1小時后,通過還原毛細管電泳評估抗體變體。Wes(ProteinSimple)用于毛細管電泳,抗人λ鏈HRP標記抗體(abcam;ab9007)用于檢測。結果,在蛋白酶處理的抗體變體中,36kDa附近的峰消失,并在20kDa附近觀察到新峰。因此,36kDa和20kDa附近的峰被認為分別對應于未切割的輕鏈和切割的輕鏈。蛋白酶處理后得到的各峰面積由Wes專有軟件(CompassforSW;ProteinSimple)輸出,根據下式計算抗體變體的切割比率(%):(切割的輕鏈的峰面積)*100/(切割的輕鏈的峰面積+未切割的輕鏈的峰面積)。在huPA處理、hMT-SP1處理和muPA處理中使用的蛋白酶濃度以及抗體變體的切割比率(%)總結在表8、9、10、11、12、13、14和15中。在評估切割比率的抗體變體中,包含G7L.106a.12aa的71種抗體再次進行類似的蛋白酶處理。結果示于表16中。其中,與G7L.106a.12aa相比,在huPA、hMT-SP1和muPA處理中顯示相同或更高切割比率的抗體變體顯示在表17中。[表8]抗體變體的蛋白酶切割比率(%)[表9]蛋白酶對抗體變體的切割比率(%)[表10]蛋白酶對抗體變體的切割比率(%)[表11]蛋白酶對抗體變體的切割比率(%)[表12]蛋白酶對抗體變體的切割比率(%)[表13]蛋白酶對抗體變體的切割比率(%)[表14]蛋白酶對抗體變體的切割比率(%)[表15]蛋白酶對抗體變體的切割比率(%)[表16]蛋白酶對抗體變體的切割比率(%)[表17][工業適用性]本公開的肽序列可用作蛋白酶底物,并且這些底物可用于各種治療、診斷和預防應用。此外,包含本公開的肽序列作為蛋白酶切割序列的多肽可用于各種治療、診斷和預防應用。當本公開的多肽是包含抗原結合結構域和具有抑制結構域的攜帶部分的多肽時,該多肽和包含它們的藥物組合物允許在血液中遞送抗原結合結構域,同時抑制抗原結合結構域的抗原結合活性。此外,多肽的使用允許抗原結合結構域在患病部位特異性地發揮抗原結合活性。此外,與遞送時相比,多肽在發揮其抗原結合活性時具有更短的半衰期,這減少了對全身作用的擔憂;因此,它們對治療疾病非常有用。當本公開的多肽為配體結合分子時,配體結合分子在體內遞送同時與配體結合并在患病組織中切割,這削弱了與配體的結合并允許配體的患病組織特異性釋放,因此,患病組織可以以特定方式暴露于配體。此外,由于在配體結合分子的遞送過程中配體的生物學活性受到抑制,因此可以減少配體可能全身作用的擔憂;因此,它們對治療疾病非常有用。當前第1頁12
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